АТФазная активность и уровень ионов в сердечной ткани при экспериментальном адреналиновом повреждении и проведении клеточной трансплантации

Богородская Светлана Леонидовна; Клинова Светлана Николаевна; Голубев Сергей Степанович; Зарицкая Лариса Васильевна; Батунова Елена Владимировна; Ежикеева Светлана Дмитриевна; Тен Марина Николаевна; Курильская Татьяна Ефимовна; Пивоваров Юрий Иванович

КУРИЛЬСКАЯ Т.Е., ПИВОВАРОВ Ю.И — 2011 УДК 612.64: 616.127- 005.8

АТФАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ И УРОВЕНЬ ИОНОВ В СЕРДЕЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АДРЕНАЛИНОВОМ ПОВРЕЖДЕНИИ И ПРОВЕДЕНИИ КЛЕТОЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

Светлана Леонидовна Богородская1, Светлана Николаевна Клинова1, Сергей Степанович Голубев1,

Лариса Васильевна Зарицкая2, Елена Владимировна Батунова2, Светлана Дмитриевна Ежикеева1,

Марина Николаевна Тен1, Татьяна Ефимовна Курильская1, Юрий Иванович Пивоваров1 ('Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН, директор — чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Е.Г.Григорьев; 2Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах)

Резюме. Авторы изучали влияние ксеногенных неонатальных сердечных клеток на АТФазную активность и уровень ионов в сердечной ткани крыс при адреналиновом повреждении. Было установлено, что клеточная трансплантация способствовала сохранению, раннему восстановлению и активации АТФаз, что приводило в ранние сроки эксперимента к более высокому уровню вовлеченных в процесс адаптации ионов: кальция, магния, калия.

Ключевые слова: сердце, адреналин, клеточная трансплантация, АТФазы, ионы.

ATPASE ACTIVITY AND LEVELS OF IONS IN CARDIAC TISSUE IN EXPERIMENTAL ADRENALIN INJURY CONDUCT AND CELL TRANSPLANTATION

S.L. Bogorodskaya1, S.N. Clinova1, S.S. Golubev1, L.V. Zaritskaya2, E.V. Batunova2, S.D. Ezhikeeva1,

M.N. Ten1, T.E.Kurilskaya1, J.I. Pivovarov1 ('Science Centre of the Reconstructive and Restorative Surgery of the East-Siberian Science Centre SB RAMS;

2Irkutsk State Postgraduate Medical Training Institute)

Summary. The authors studied the impact of xenogeneic neonatal heart cells on ATPase activity and the level of ions in cardiac tissue of rats with adrenal damage. It was found that cells transplantation contributed to the preservation, restoration and early activation of ATPase, which resulted in the early stages of the experiment to a higher level involved in the process of adaptation of the ions: calcium, magnesium, potassium.

Key words: heart, adrenaline, cell transplantation, ATPase, ions.

В более ранних работах описывалась способность клеточной трансплантации уменьшать величину как структурных [5], так и некоторых биохимических процессов в миокарде [1, 2, 3]. Так в случае применения клеточной терапии при экспериментальном адреналиновом повреждении миокарда было показано ограничение подавления АТФазной активности в период угнетения метаболизма, и ее последующее раннее и интенсивное восстановление [2].

То есть, можно полагать, что клеточная трансплантация способствует уменьшению нарушений ионного транспорта в миокарде.

Цель данной работы: изучить влияние клеточной трансплантации на уровень ионов в сердечной ткани при адреналиновом повреждении.

Материалы и методы

Эксперимент проводили на беспородных крысах, самцах, массой 200-250 г. 1-я группа — здоровые крысы (п=12) — параметры, определенные в данной группе принимали как исходные. Адреналиновый стресс моделировали однократным подкожным введением 0,1%-ного раствора адреналина в дозе 0,2 мг на 100 г массы: животным контрольной группы (2 гр., п=80) — сразу после адреналина вводили 0,5 мл физиологического раствора; животным опытной группы (3 гр., п=61) — также сразу после введения адреналина подкожно инъецировали изолированные сердечные клетки новорожденного кролика в дозе 500 тыс. клеток в 0,5 мл физиологического раствора.

Сердца крыс забирали через 1, 4, 8, 12, 16, 24 часа от начала эксперимента и помещали в жидкий азот.

Исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минздрава СССР от 12.08.1977. N755). Соблюдение этических норм подтверждается положительным заключением комитета по биомедицинской этике ВСНЦ СО РАМН от 10.12.2009 г.

В образцах сердца определяли кальций и магний с помощью стандартных наборов реактивов фирмы «Biocon», Германия; натрий и калий — наборами реактивов «Human», Германия. Активность АТФаз определяли по приросту неорганического фосфата. Для исследования активности креатинкиназы (КК) применяли реактивы «Biocon»; лактатдегидрогеназу 1 (ЛДГ1) оценивали по ее альфа-гидроксибутиратдегидрогеназной активности реактивами «Cormay», Польша. Использовали полуавтоматический биохимический анализатор «Roki, Ольвекс», Россия.

Световую микроскопию образцов миокарда выполняли с помощью компьютерной видеосистемы «Quantimet 5501 W», Leica, Англия.

Статистическую обработку результатов проводили с применением программы «Statistica» с использованием критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Если в контрольной группе к 1-му часу эксперимента имелась тенденция к понижению АТФазной активности в сердечной ткани, то в группе с проведением клеточной трансплантации активность АТФаз в этот срок была значительно и статистически значимо повышена (рис.1, а). Это свидетельствовало о том, что в сердечной ткани животных с трансплантацией трансмембранный транспорт был активирован, а в контрольной группе — скорее угнетен. В этот же срок у опытных крыс отмечалось повышение уровня кальция, магния и калия (рис.2, 3). В то же время, сравниваемые группы отличались и по уровню натрия: после трансплантации происходило значительное снижение его уровня в сердечной ткани, а в контрольной группе к 1-му часу его уровень остался без изменения (рис.3, а). Таким образом, увеличению активности АТФаз в сердечной ткани животных с трансплантацией к 1-му часу эксперимента соответствовало повышение уровня ионов, поступающих в клетки за

Рис. 1. Влияние подкожной трансплантации ксеногенных неонатальных сердечных клеток на активность в сердечной ткани: а) плазмолеммальной АТФазы, б) креатинкиназы, в) ЛДГ 1 при адреналиновом повреждении миокарда. * — Р<0,05 по сравнению с контролем.

ас

5

счет активного транспорта. За счет последнего также происходило уменьшение уровня натрия.

В свою очередь, увеличению уровня двухвалентных ионов — кальция и магния, которые являются известными активаторами ферментов и синтеза белков, соответствовало сохранение и более ранняя активация ЛДГ 1: к 1-му часу в сердечной ткани животных с трансплантацией отмечалось ее повышение до максимума, что статистически значимо отличалось и от исходного значения и от величины в контрольной группе (рис.1, в). Активность креатинкиназы также повышалась раньше: к 4 часам отмечалось максимальное значение — более высокое, чем в контроле (рис.1, б).

С понижением содержания в сердечных клетках калия и повышением натрия связывают изменения в осмотических процессах, отек карди-омиоцитов и их повреждение. Очевидно, что трансплантация влияла на динамику соотношения калия и натрия и, возможно, с этим связаны отмечаемые при морфологическом исследовании меньший отек кардиомиоци-тов — об этом свидетельствовало ограничение увеличения площади поперечного сечения кардиомиоцитов, и меньшая величина суммарной площади очагов некроза на сердечных срезах (табл.1).

Восстановление и активация АТФаз в сердечной ткани контрольных животных происходили позднее, чем в опытной группе (максимум в 8-часовой пробе). Тенденция к восстановлению кальция также наблюдалась в более поздние сроки: максимум при восстановлении отмечен в 12-часовом образце, при этом, повышение было менее значительное, чем в опытной группе — величина близка к исходному значению. Максимум магния при восстановлении приходился на 12 часов и также был близким к исходному уровню. Та же закономерность отмечалась и для калия.

Восстановление и активация других ферментов также соответственно запаздывала: максимум активности креатинкиназы сдвинут к 8 часам: величина при этом выше и исходной, и активности в сердечной ткани опытных животных. В динамике ЛДГ 1 к этому сроку отмечалась тенденция к восстановлению активности, но превышения исходных значений не происходило.

К концу суточного эксперимента АТФазная активность и уровни ионов в сердечной ткани сравниваемых групп статистически значимо не отличались. К 24-м часам

отмечалось статистически значимое снижение активности ЛДГ 1 в обеих группах. Активность креатинкиназы значительно понижалась в сердечной ткани контрольной группы, при трансплантации — ее уровень оставался статистически значимо выше, чем в контроле, и близким к исходной величине.

Таким образом, вероятно, сразу же после введения адреналина в сердечной ткани животных обеих групп происходила вызванная адреналином интенсификация метаболических процессов с существенной затратой энергетических и пластических субстратов, их истощением и, видимо, значительным накоплением конечных продуктов, что все вместе приводило к последующему подавлению метаболизма. Этот процесс был в большей

а. Кальций

--о--Адреналин —О—Адреналин, клетки

6. Магний

2

5

12 ч 16 ч 24 ч

--О-Адреналин —О—Адреналин, клетки

Рис. 2. Влияние подкожной трансплантации ксеногенных неонатальных сердечных клеток на содержание в сердечной ткани ионов: а) кальция и б) магния. * — Р<0,05 по сравнению с контролем.

Рис. 3. Влияние подкожной трансплантации ксеногенных неонатальных сердечных клеток на содержание в сердечной ткани ионов: а) натрия и б) калия при адреналиновом повреждении миокарда. * — Р<0,05 по сравнению с контролем.

Таблииа 1

Морфологические тараметры миокарда у крыс: здоровых (n= 12), с введением адреналина (n=80) и с введением адреналина и ксеногенных сердечных клеток (n=52), M±m

Исходное значение Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов (мкм2) Суммарная площадь очагов некроза в поле зрения при увеличении х200 (мкм2)

Контроль Опыт Контроль Опыт

207,0±б

1 час 212,9±8,2 210,7±7,7

4 час 234,3±5,1* 217,5±8,2*,**

8 час 248,4±7,8* 229,б±3,3*,**

12 час 254,2±4,7* 240,б±3,5*,** 7,2±0,5

16 час 298,1±4,4* 24б,2±5,3*,** 20,5±0,4 11,5±0,4**

24 часа 30б,0±4,7* 251,З±б,7*,** 223,б±5,3 б0,5±2,4**

Примечание. * Р<0,05 — но сравнению с исходным значением; ** Р<0,05 — но сравнению с контролем.

степени выражен у животных контрольной группы, у которых к 1 часу наблюдалось уменьшение активности ферментов и понижение уровня ионов. В сердечной ткани животных с трансплантацией в ранние сроки эксперимента еще наблюдалась активация метаболических процессов, в частности — АТФаз. Ограничению нарушения работы АТФаз, их раннему восстановлению соответствовала динамика ионов — с повышенным уровнем в ранние сроки. Сохранение, опережающее восстановление и повышение уровня двухвалентных ионов — кальция и магния являлось необходимым условием развития адаптации: восстановления и активации метаболических процессов, в том числе, различных ферментов [2], синтеза белков [4], энергетики [1, 3]. Изменение в соотношении калия и натрия, вызванное трансплантацией, видимо, способствовало меньшему отеку кардиомиоцитов. В итоге, в группе с подкожной ксеногенной трансплантацией сердечных клеток происходило ограничение развития повреждения, что подтверждалось меньшей величиной суммарной площади очагов некроза.

ЛИTEPATУPA

1. Богородская С.Л., Клинова С.Н., Гутник И.Н. и др. Оценка энергетических локазателей миокарда лри моделировании адреналинового новреждения в условиях клеточной транотлантации // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2009. — №3. — С.154-157.

2. Богородская С.Л., Клинова С.Н., Микашова М.Б. и др. Tрaнсплaнтaция ксеногенных кардиомиоцитов ири экс-иериментальном адреналиновом яовреждении миокарда: ферментативная активность и морфологические яараметры // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2008. — №8. — С.132-136.

3. Клинова С.Н., Богородская С.Л., Курильская Т.Е. и др. Динамика адениловых нуклеотидов в раннем териоде инфар-

кта миокарда и при его коррекции клеточной трансплантацией // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). — 2009. — Т.86, №3. — С.38-41.

4. Рунович А.А., Войников В.К., Курильская Т.Е. и др. Индукция белков теплового шока в сердечной мышце при катехоламиновом миокардите, коррегированном методом клеточной трансплантации // Седьмая ежегодная сессия НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН: Тез. докл. и сообщ., Москва, 25-27 мая 2003 г.// Бюлл. НЦ ССХ им.А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания» — 2003 . — Т.4, №6. — С. 208.

5. Hill J.M., Orlic D., Arai .А. E. Stem cells for myocardial regeneration // Circ. Res. — 2002. — V. 91, N 12. — P.1092-1102.

Информация об авторах: 664049, Юбилейный, 100,Тел. 8(3952)465270, e-mail: sbogorodskaya@mail.ru, Богородская Светлана Леонидовна — заведующая лабораторией, к.б.н.,

Клинова Светлана Николаевна — младший научный сотрудник,

Голубев Сергей Степанович — заведующий отделом, к.м.н.,

Зарицкая Лариса Васильевна — заведующий лабораторным отделом,

Батунова Елена Владимировна — младший научный сотрудник,

Ежикеева Светлана Дмитриевна — врач-лаборант, Тен Марина Николаевна — врач-лаборант, Курильская Татьяна Ефимовна — заведующая отделом, д.м.н.,

Пивоваров Юрий Иванович — ведущий научный сотрудник, д.м.н., профессор.

ПРЕДИКТОРЫ ИСХОДОВ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА В РЕАНИМАЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ

Наталья Викторовна Лихолетова1, Вячеслав Васильевич Ковалев1,

Владимир Ильич Горбачев1, Ирина Леонидовна Петрова2 ('Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра анестезиологии и реаниматологии, зав. — д.м.н., проф. В.И. Горбачев;

2Иркутская областная ордена «Знак Почета» клиническая больница, гл. врач — к.м.н. П.Е. Дудин)

Резюме. Было проведено проспективное исследование 40 случаев геморрагического инсульта у пациентов в возрасте от 42 до 90 лет. С помощью многофакторного анализа удалось обнаружить, что значимыми предикторами исхода внутричерепного кровоизлияния являются: возраст пациента, исходный уровень сознания по шкале ком Глазго и объём внутримозговой гематомы по данным компьютерной томографии. Знание предикторов геморрагического инсульта помогает определить прогноз в случае внутримозгового кровоизлияния, в том числе и степень выраженности неврологического дефицита.

Ключевые слова: внутримозговое кровоизлияние, предикторы, неврологический исход.

PREDICTIVE FACTORS OF OUTCOMES OF HEMMORRAGIC STROKE IN RESUSCITATION PRACTICE

N.V. Licholetova1, V.V. Kovalev1, V.I. Gorbachev1'2, I.L. Petrova2 (1Irkutsk State Institute for Postgraduate Medical Education, 2Irkutsk State Regional Hospital)

1Q5

Atpase activity and levels of ions in cardiac tissue in experimental adrenalin injury conduct and cell transplantation