CC BY
79
УДК 612.6.05:616.12-008.331.1-053.2
В.А. Шенин, Л.А. Демидова, И.Ю. Урыбин, В.В. Долгих, Т.А. Астахова
АССОЦИИРОВАННОСТЬ ГЕНА АСЕ C ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)
Исследовано распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса ангиотензин — превращающего фермента (АСЕ) (I/D — полиморфизма) среди детей и подростков, больных эссенциаль-ной артериальной гипертензией (ЭАГ) и. в группе сравнения, состоящей из нормотензивных лиц. При. анализе изменчивости, полиморфизма АСЕ был выявлен существенный, избыток аллеля с деле-цией у подростков с ЭАГ.
Ключевые слова: эссенциальная артериальная гипертензия, ген АСЕ, предрасположенность
ASSOCIATION OF ACE GENE IN CHILDREN AND ADOLESCENTS WITH ESSENTIAL HYPERTENSION
V.A. Shenin, L.A. Demidova, I.Yu. Uribin, V.V. Dolgikh, T.A. Astakhova
Institute of pediatrics and human reproduction, SC ME SD RAMS, Irkutsk
The paper presents results of the research, of distribution, of the incidence of alleles and genotypes of polymorphous locus ACE among children and adolescents with essential hypertension and. the normals. The anal-
ysis of polymorphism variability showed higher level of alleles with deletion in adolescents with essential hypertension.
Key words: essential hypertension, gene ACE, predisposition
Ангиотензин-превращающий фермент (АСЕ) хорошо известен, как ключевой фермент в регуляции кровяного давления. Однако это основная, но не единственная функция АСЕ. Он также участвует в целом ряде процессов, протекающих в организме и влияет на пролиферацию клеток.
Ген АСЕ локализуется в 23 локусе 17-й хромосомы и содержит 26 экзонов. Для данного гена известны не менее 12 полиморфизмов, три из которых находятся в кодирующей последовательности [2, 7]. Наиболее изучен полиморфизм типа вставка /отсутствие (insertion /deletion I /D), расположенный в интроне 16 гена АСЕ. Вставка размером 287 п.н. состоит из А1и-повторов [5]. Этот полиморфизм не изменяет функцию фермента, но влияет на степень экспресии гена. Наличие D-аллеля ассоциировано с более высоким уровнем циркулирующего АСЕ (от 14 до 50 %) и более высокой активностью тканевого фермента [3, 4]. Это послужило предпосылкой для поиска связи генотипа АСЕ с предрасположенностью к таким видам патологии сердечно-сосудистой системы, как гиперплазия левого желудочка, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия, ремодулирование сосудов, атеросклероз. Количество исследований, посвященных роли генотипа АСЕ в развитии этих патологических состояний достаточно велико, но их весьма противоречивые результаты не позволяют на сегодняшний день сделать окончательный вывод об ассоциации I/D — полиморфизма АСЕ и ряда заболеваний, в т. ч. относительно АГ. Как показано рядом авторов, при интерпретации данных в отношении ассоциации генетического полиморфизма и АГ с ее осложнениями следует иметь в виду возможность различий в распределении аллелей в разных популяциях, а также взаимодействие с другими генами и факторами окружающей среды [9].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводилось у 168 детей. Из них 39 детей составляли группу исследования с нормальными показателями уровня артериального давления. Данная группа нами была использована для контроля. Группу с ЭАГ составили 129 детей. Возраст детей и подростков составлял 12—18 лет.
Диагноз эссенциальная артериальная гипертензия (ЭАГ) верифицировался методом исключения заболеваний и состояний, которые могли обусловить вторичное повышение уровня АД. С этой целью всем детям и подросткам, имеющим уровень АД, превышающий значение 95 перцинтиль-ного коридора регионального норматива распределение уровня АД проводился комплекс клинико-функциональных, биохимических и генетических исследований, позволяющий исключить многообразные патологические процессы со стороны различных органов и систем, сопровождающихся повышением уровня АД. При обследовании были
исключены заболевания почек, эндокринные заболевания и нарушения обмена веществ, заболевания центральной нервной системы, врожденные пороки сердечно-сосудистой системы и т.д.
Для исследования полиморфизма гена АСЕ забирались по 0,5 ml образцов венозной крови с добавлением антикоагулянта 0,5 М ЭДТА в соотношении 1 : 50. Препараты ДНК получали с применением ионообменной смолы Chelex—100 [8].
Амплификацию полиморфных участков генов АСЕ проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе производства компании «ДНК-Технология» (Москва). Использовали набор реагентов для детекции инсерционно-делиционного полиморфизма гена АСЕ. Производитель набора Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск).
Разделение продуктов реакции проводили в 2% агарозном геле, содержащем 0,05 мкг/мл этидиум бромида, с использованием внешнего стандарта молекулярного веса. Результаты злектрофореза в геле визуализировались на фильтре трансиллюминатора и документировались фотографированием.
В АСЕ полиморфизме наличие одного фрагмента размером 480 п.н. соответствовало гомозиготе с инсерционным генотипом (II). Наличие фрагмента размером 194 п.н. соответствовало гомозиготе по делеции (DD), наличие обоих фрагментов соответствовало гетерозиготному генотипу (ID). Во избежание ошибочного типирования гетерозигот как гомозигот DD каждый образец с генотипом DD был амп-лифицирован повторно с набором праймеров, специфичных для последовательности вставки. При наличии продукта амплификации размером 293 п.н. образец идентифицировался как гетерозигота, при его отсутствии — как гомозигота по делеции.
Наблюдаемые частоты встречаемости генотипов исследованных локусов проверяли на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга.
Сравнение распределения частот аллелей и генотипов в обследованных группах проводили с использованием теста на P х B, введя поправку на непрерывность [1]. Статистически достоверными считали различия при p < 0,05.
Относительный риск (RR — Relative Risk) вычисляли по формуле [6],
RR = (а + 0,5) х (d + 0,5) / (b + 0,5) х (с + 0,5), где а — число больных с наличием и b — с отсутствием данного аллеля среди больных, с и d — число здоровых с наличием и отсутствием данного аллеля соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В связи с этим нами было исследовано распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса АСЕ (I/D — полиморфизма) среди детей и подростков с ЭАГ и в группе сравнения, состоя-
Таблица 1
Распределение фенотипов и частот генов АСЕ в исследованных группах
Сис- тема Фено- тип Контрольная группа (I) Дети с ЭАГ (II) х2 I/II
N.O F.O. Частота гена N.E. 1 II .f. d. 'k N.O. F.O. Частота гена N.E. 1 II .f. 2d х
АСЕ II 14 Э5,90 I = 0,62S2 D = 0^71S 15,Э9 0,91 p > 0,05 26 20,15 I = 0,507S D = 0,4922 ЭЭ,26 6,54 p < 0,05 14,74 p < 0,01
ID 21 5Э^5 1 S,22 79 61,24 64,4S
DD 4 10,25 5,Э9 24 1S,61 Э1,26
1 Э9 129
Но = 0^S і 0,07S9 Не = 0,4671 і 0,0290 D = + 0,1527 Но = 0,6124 і 0,0429 Не = 0,4999 і 0,0029 D = + 0,2251
Примечание: N.0. - фактическая численность фенотипов; РО. - фактическая частота фенотипов; Но - наблюдаемая гетерозиготность; Не - ожидаемая гетерозиготность; ^Е. - ожидаемая численность фенотипов.
щей из нормотензивных лиц такого же возрастного и полового состава.
Распределение генотипов и частот аллелей гена АСЕ в группе детей и подростков с ЭАГ и контрольной группе приведено в таблице 1. В контрольной группе распределение генотипов и частот гена АСЕ соответствовало ожидаемому согласно равновесию Харди-Вайнберга (х2^. = 1 = 0,91; р > 0,05). Статистически достоверное отклонение от равновесия, обусловленное недостатком гомозигот по инсерции II, наблюдается в группе больных с ЭАГ (Х2^. = 1 = 6,54; р <0,05). Частоты генотипов полиморфного маркера 1^ гена АСЕ распределились следующим образом: II — 20,2 %, ГО — 61,2 %, DD — 18,6 % в группе больных с ЭАГ и 35,9 %, 53,9 %, 10,3 %
— в контрольной группе соответственно. По сравнению с контролем у пациентов с ЭАГ различия в распределении генотипов статистически достоверны (х2 = 14,74; р <0,01). Частота обнаружения генотипа DD у пациентов с ЭАГ в 1,8 раза превышает таковую в контрольной группе. В то же время частота гомозигот по инсерции в группе больных в 1,8 раза меньше, чем в контрольной группе. Различия по частоте аллелей гена АСЕ также наблюдаются, но менее выражены и статистически не достоверны. Частота I аллеля в группе больных (50,8 %) в 1,3 раза ниже, чем в контрольной выборке.
Данные по относительному риску (RR) свидетельствуют о существовании положительной ассоциации аллеля D гена АСЕ с ЭАГ. Значения RR для аллеля D и генотипов ГО и DD выше 1. Для аллеля I и генотипа II значения RR составляют 0,32 и 0,45, соответственно, свидетельствуют об отрицательной ассоциации аллеля I с ЭАГ. Полученные результаты можно расценивать как показатель того, что аллель D является фактором предрасположенности к ЭАГ, а аллель I гена АСЕ представляет собой фактор устойчивости, оказывающий защитное действие к развитию ЭАГ.
Таким образом, результаты проведенного нами сравнительного анализа указывают на наличие выраженной ассоциации полиморфизма гена АСЕ и эссенциальной артериальной гипертензии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вейр Б. Анализ генетических данных / Б. Вейр. — М.: Мир, 1995. — 400 с.
2. Clifford C.P. Racial differences in the freduency of a restriction site polymorphism of the angiotensin-converting enzyme (ACE) gene /
C.P. Clifford, D.J.R. Nuner // Abstracts 16 th Sci. Meeting Jnternat. Soc. Hypertension. Hasgow, UK.
— 1996. — Abstract. 4 B, N 4. — P. 1598.
3. Danser A.H. Angiotensin-converting enzyme in the human heart. Effect of the deletion / insertion polymorphism / A.H. Danser, M.A. Schalekamp, W.A. Bax, A.M. Van den Brink, P.R. Saxena, J.A. Riegger, H. Schunkert // Circulation. — 1995. — N 92. — P. 1387—1388.
4. Rigat B. An insertion / deletion polymorphism of angiotensine 1 converting enzyme accounting for half of the variance of the serum enzyme levels / B. Rigat, C. Hybert, F. Alhenc-Jelas // J. Clin. Invest.
— 1990. — N 86. — P. 1343—1346.
5. Rigat B. PCR detection of the insertion / deletion polymorphism of the human angiotensine converting enzyme gene (DCP 1) (dipeptidyl — carboxypeptidase 1 ) / B. Rigat, C. Hubert, P. Corvol, F. Soubrier // Nucl. Acids. Res. — 1992. — Vol. 20. — P. 1433.
6. Thomson J. A review of theoretical aspects of HLA and disease associations / J. Thomson // Theor. Popul. Biol. — 1981. — N 20. — P. 168.
7. Villard E. Two putatiue functional variants at the angiotensin-converting enzyme (ACE) gene locus involvedvin the genetic determination of plasma ACE / E. Villard, L. Tiret, A.M. Houot // Abstracts 16 th Sci. Meeting Jnternat. Soc. Hypertension. Hasgow, UK. — 1996. — Abstract. 4, N 2. — P. 0736.
8. Walsh P. Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typind from forensic material / P. Walsh et al. // Bio Techniques. — 1991.
— N 10. — P. 506 — 513.
9. West M.J Renin-anguiotensin system gene polymorphism and left ventricular hyper-trofy. The case against an association / M.J. West, K.M. Summer, K.K. Wong, D.J. Burstow // Adv. Exp. Med. Biol. — 1997. — N 432. — P. 117—122.
