CC BY
13© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
Н.Г.Саркисян1,3,5, Л.В.Ганковская2, И.А.Тузанкина1,3, О.А.Свитич4, Г.И.Ронь5, В.Н.Шершнев6, О.Н.Колядина2, М.А.Долгих5
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ В ГЕНАХ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ПАРОДОНТИТОМ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
1Уральский федеральный университет, Екатеринбург; 2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва; 3Институт иммунологии и физиологии, Екатеринбург; 4НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва; 5Уральский медицинский университет, 6Институт промышленной экологии, Екатеринбург
Цель. Поиск ассоциации полиморфизмов в генах DEFВ1, IL-10, TNF-a и TLR2 с развитием хронического генерализованного пародонтита у представителей уральского региона (европеоидной расы). Материалы и методы. В исследовании участвовали 142 пациента, которые были поделены на три группы: группа пациентов с пародонтитом, группа с частыми воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей и группа сравнения — здоровые доноры. В работе было проведено исследование полиморфных маркеров: DEFB1 (-44G/C), DEFB1 (-20A/G), IL-10 (-1082 A/G), TNF-a (-308 G/A), Arg753Gln и Arg677Trp с помощью ПЦР в режиме реального времени. Результаты. Определена ассоциация инфекционной патологии верхних дыхательных путей и возникновения заболеваний пародонта с полиморфными маркерами в генах DEFB1 (-44G/C) и Arg753Gln и Arg677Trp. Не выявлено достоверных различий в распределении генотипов и аллелей генов IL-10 и TNF-a в группе пациентов с пародонтитом и группе сравнения. Заключение. Полиморфизм DEFB1 (-44G/C) может рассматриваться в качестве маркера риска развития пародонтита.
Журн. микробиол., 2016, № 1, С. 67—71
Ключевые слова: пародонтит, полиморфизм, врожденный иммунитет, TLR, цитокины, дефенсины, инфекция
N.G.Sarkisyan1,3,5, L.V.Gankovskaya2, I.A.Tuzankina1,3, O.A.Svitich4, G.I.Ron5, V.N.Shershnev6, O.N.Kolyadina2, M.A.Dolgikh5
ASSOCIATION OF POLYMORPHIC MARKERS IN GENES OF INNATE IMMUNITY IN PATIENTS WITH PERIODONTITIS AND INFLAMMATORY DISEASES OF UPPER RESPIRATORY TRACT
1Ural Federal University, Ekaterinburg; 2Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow; 3Institute of Immunology and Physiology, Ekaterinburg; 4Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow; 5Ural Medical University, 6Institute of Industrial Ecology, Ekaterinburg, Russia
Aim. Search of association ofpolymorphisms in DEFВ1, IL-10, TNF-a and TLR2 genes with development of chronic generalized periodontitis in representatives of Ural region (Caucasian race). Materials and methods. 142 patients, that were split into 3 groups, took part in the study: a group of patients with periodontitis, a group with frequent inflammatory disease of upper respiratory tract and a comparison group — healthy donors. A study of polymorphic markers was carried out: DEFB1 (-44G/C), DEFB1 (-20A/G), IL-10 (-1082 A/G), TNF-a (-308 G/A), Arg753Gln and Arg677Trp using PCR in real time mode. Results. Association of infectious pathology of upper respiratory tract and development of periodontitis diseases with markers in DEFB1 (-44G/C) and Arg753Gln and Arg677Trp genes was determined. Significant differences in distribution of genotypes and alleles of genes IL-10 and TNF-a in the group of patients with periodontitis and comparison group were not detected. Conclusion. DEFB1 (-44G/C) polymorphism can be examined as a marker of periodontitis development risk.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 1, P. 67-71
Key words: periodontitis, polymorphism, innate immunity, TLR, cytokines, defensins, infection
Патология пародонта по значимости занимает второе место после кариеса зубов. С каждым годом увеличивается число публикаций, подчеркивающих связь пародонтита с различными хроническими заболеваниями, к примеру: с атеросклерозом и ассоциированными с ним сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, желудочно-кишечными заболеваниями, заболеваниями почек, ожирением, метаболическим синдромом, заболеваниями щитовидной железы, иммунными нарушениями и др. [2, 6, 7, 11]. По данным ВОЗ распространенность заболеваний пародонта различной степени тяжести составляет более 90% у взрослого населения. Несмотря на интенсивное исследование патогенеза паро-донтита и риска развития данной патологии, до настоящего времени не выявлено определенной взаимосвязи между конкретными маркерами и развитием заболевания [2 — 4].
Показано, что этиологическими факторами хронического генерализованного пародонтита являются бактерии P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и A. actinomycetemcomitans, а также вирусы семейства Herpesviridae. В последние годы в литературе появились данные о роли иммунной системы, в частности факторов врожденного иммунитета, в патогенезе пародонтита. Особое место среди факторов иммунитета занимают цитокины, и баланс про- и противовоспалительных цитокинов имеет большое значение при пародонтите. Считается, что полиморфные маркеры в генах CD-14 и TNF-a могут быть ассоциированы с метаболическими нарушениями в системе соединительной ткани и деструктивными процессами в кости. Так, полиморфизмы С(-260)Т в гене CD14 и G(-308)A в гене TNF-a ассоциированы с высоким риском развития хронического воспаления в тканях пародонта. При наличии хронического генерализованного пародонтита в зубодесневой жидкости определяется повышение провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-1ß, IL-6, IL-1a и снижение — IL-10. Показано, что к протективным маркерам хронического пародонтита относятся специфичность DRB1*04 и аллель DQA1*0101, которые ассоциированы с устойчивостью к различным формам данной патологии [9].
В литературе имеются единичные и противоречивые исследования, касающиеся ассоциации полиморфных маркеров в генах, белковые продукты которых участвуют в иммунных реакциях с риском развития заболеваний пародонта [10, 13]. Практически нет данных о маркерах в генах противомикробных пептидов (дефенсинов), которые являются одним из основных факторов защиты слизистой ротовой полости. Следует отметить, что рецепторы врожденного иммунитета, распознающие патогены — Toll-подобные рецепторы (TLR) и др. могут участвовать в патогенезе пародонтита. В связи с этим, поиск генетических маркеров в генах врожденного иммунитета (TLR, дефенсинов, цитокинов) воспалительных заболеваний пародонта является актуальной задачей. Полученные данные позволят прогнозировать развитие и тяжесть воспалительных заболеваний паро-донта.
Цель исследования — поиск ассоциации полиморфизмов в генах DEFB1, IL-10, TNF-a и TLR2 с развитием хронического генерализованного пародонтита у представителей уральского региона (европеоидной расы).
В данной работе были обследованы 142 пациента, среди них 57 мужчин и 85 женщин, в возрасте от 35 до 55 лет. Все пациенты были разделены на три группы: пациенты с пародонтитом (67 человек: 23 мужчины, 44 женщины, возраст 37 — 55 лет), пациенты с частыми воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей ( 48 человек: 19 мужчин, 29 женщин, возраст 35 — 52 года) и группа сравне-
ния — здоровые доноры (27 человек: 15 мужчин, 12 женщин, возраст 40 — 55 лет). По расширенному сбору анамнеза выявлено наличие соматической патологии (гайморит, тонзиллит, ларингит, этмоидит, отит, трахеит, фарингит). Проведено комплексное стоматологическое обследование: заполнение амбулаторной карты формы 043У, сбор жалоб, анамнеза, осмотра с индексной оценкой гигиенического состояния полости рта.
Биологическим материалом служил соскоб эпителиальных клеток со слизистой щеки пациента. Анализ материала выполнялся на кафедре иммунологии РНИМУ им. Н.И.Пирогова.
В работе было проведено исследование полиморфных маркеров: DEFB1 (-44G/C), DEFB1 (-20A/G), IL-10 (-1082 A/G), TNF-a (-308 G/A), Arg753Gln и Arg677Trp. Для оценки полиморфизмов из эпителиальных клеток была выделена ДНК с использованием наборов «К-сорб» («Синтол», РФ). Далее проводили по-лимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase («Синтол», РФ) а также наборы «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ» («Синтол», РФ). Реакцию для оценки маркеров в генах дефенсина проводили на приборе RotorGene («QIAGEN», Германия). Праймеры, задействованные в работе с генетическими маркерами, были разработаны с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой «Синтол» (РФ). Системы для проведения ПЦР-РВ для определения исследуемых полиморфизмов была разработаны на кафедре иммунологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова [1, 5, 8].
Для оценки полиморфных маркеров Arg753Gln и Arg677Trp в гене TLR2 проводили ПЦР и реакцию рестрикции. При исследовании полиморфных маркеров, локализованных в гене TLR2, был использован подход, предложенный Schroder N.W. et al. [12]. Реакцию рестрикции продуктов ПЦР проводили для выявления наличия полиморфных участков в генах TLR2. Для определения полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2 использовали рестриктазу BspAC I («СибЭнзим», РФ). Температурный и временной режим реакции полностью соответствовал таковым в инструкции фирмы-производителя.
Статистическая обработка данных проводилась в программе Microsoft Excel 2007 с использованием статистического пакета STATISTICA 6.0, а также при использовании формул «Pearson Chi-square» и «M-L Chi-square». Для оценки достоверности различий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров применяли критерий %2. Различия между показателями в группах считались достоверными при p<0,05.
При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg677Trp гена TLR2 среди пациентов с пародонтитом, с воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей и в группе сравнения обнаружено преобладание частоты аллеля Trp над частотой аллеля Arg и встречаемости генотипа TrpTrp над встречаемостью генотипов TrpArg и ArgArg во всех исследуемых группах. Отличия распределения аллелей и генотипов в группе пациентов с па-родонтитом и в группе сравнения были недостоверны. Однако следует отметить, что у пациентов с инфекцией достоверно доминировал гетерозиготный генотип и отсутствовал генотип Arg/Arg.
Таким образом, можно заключить, что полиморфный маркер Arg677Trp гена TLR2 не ассоциирован с пародонтитом. Можно предположить, что хотя замена аминокислоты в 677 положении могла привести к нарушению передачи сигнала с TIR-домена TLR2 рецептора, но в наших исследованиях в группе с пародонти-том это не было показано. В то же время, у пациентов с частыми заболеваниями верхних дыхательных путей выявлена ассоциация маркера Arg677Trp.
Другой полиморфный маркер Arg753Gln также был локализован в районе TIR-домена TLR2. В группе пациентов с воспалительными заболеваниями верх-
них дыхательных путей частота аллеля Gln преобладала над частотой аллеля Arg, а встречаемость генотипа GlnArg — над другими генотипами. Следует отметить, что в группе с пародонтитом соотношение частоты аллелей и генотипов было сопоставимо с показателями в группе сравнения.
В группе пациентов с пародонтитом распределение частоты аллелей и генотипов полиморфизмов IL-10 (-1082 A/G) и TNF-a (-308 G/A) недостоверно отличалось от такового в норме. При рассмотрении распределения частоты генотипов можно отметить, что в группе с пародонтитом недостоверно преобладали генотипы TNF-a (GG) и IL-10 (GG). Сравнительный анализ исследуемых маркеров в генах цитокинов не выявил статистически значимых отличий в группе с пародонтитом и в группе пациентов с воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей относительно показателей в группе сравнения.
Другие полиморфные маркеры, которые были изучены в работе, относились к нетранслируемой области гена дефенсина. Для данного исследования нами были выбраны полиморфные маркеры G(-20)A и C(-44)G гена DEFB1, расположенные в нетранслируемой области. Предположительно данные SNPs могут влиять на уровень экспрессии гена дефенсина. SNPs в положениях -44C/G (rs1800972) и -20G/A (rs11362), которые находятся в 5'-нетранслируемой области (UTR) гена DEFB1, не приводили к изменению аминокислотной последовательности, но могли быть связаны с изменением в транскрипции или в трансляции [14]. Ассоциация данных полиморфных маркеров с патологиями пародонта до настоящего времени не исследовалась.
Различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного маркера А(-20) G между исследуемыми группами были статистически недостоверными. Таким образом, можно говорить об отсутствии ассоциации полиморфного маркера А(-20)G гена DEFB1 с пародонтитом и воспалительными патологиями верхних дыхательных путей. Показано, что пародонтит ассоциирован с генотипом СС -44C/G (rs1800972). Частота генотипов в группе пациентов с инфекцией относительно показателей в группе сравнения были следующими: генотип GG — 0,2 и
0.04. генотип GС — 0,41 и 0,46, генотип СС — 0,39 и 0,50, соответственно. Риск развития воспалительных патологий в верхних дыхательных путях связан с носи-тельством генотипа GG, генотип СС является протективным.
Полученные результаты дают возможность выявления генетической предрасположенности к пародонтиту и воспалительной патологии верхних дыхательных путей. Исследование позволяет рекомендовать проведение генетического анализа на полиморфизм гена DEFB1 в детском возрасте, что даст возможность направленной профилактики.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ганковская О.А. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов TLR2 и TLR9 с преждевременными родами и внутриутробным инфицированием. Медицинская иммунология. 2010, 12 (1-2): 87-94.
2. Козодаева М.В., Иванова Е.В., Манулов Б.М. Состояние пародонта у больных сахарным диабетом (обзор). Пародонтология. 2011, 1 (58): 3-7.
3. Мирсаева Ф.З. Экспресс-диагностика заболеваний внутренних органов у больных хроническим генерализованным пародонтитом. Пародонтология. 2013, 3 (68): 55-58.
4. Ореховой Л.Ю. Заболевания пародонта. М., Поли Медиа Пресс, 2004.
5. Свитич О.А., Ганковская Л.В., Рахманова И.В. и др. Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5'-нетранслируемой области гена DEFB1, с гипертрофией аденоидных вегетаций. Вестник РГМУ. 2012, 3: 59-62.
6. Al-Zahrani M. S., Kayal R. A., Bissada N. F. Periodontitis and cardiovascular disease: a review of shared risk factors and new findings supporting a causality hypothesis. Quint. Int. 2006, 37 (1): 11-18.
7. Chapple I. L., Genco R. Diabetes and periodontal diseases: consensus report of the Joint EFP/
AAP Workshop on Periodontitis and Systemic Diseases. J. Periodontol. 2013, 84 (4): 106112.
8. Gankovskaya L.V., Svitich O.A., Lavrov V.F. et al. Herpes simplex virus type 2 infection during pregnancy is correlated with elevated TLR9 and TNFa expression in cervical cells. Intern. Trends Immunology. 2014, 2: 62-66.
9. Jazi M.M., Solgi G., Roosta H.A. et al. HLA-DRB and HLA-DQA/HLA-DQB allele and haplotype frequencies in Iranian patients with aggressive periodontitis. J. Periodontal Res. 2013, 48 (4): 533-539.
10. Karimbux N.Y., Saraiya V.M., Elangovan S. et al. Interleukin-1 gene polymorphisms and chronic periodontitis in adult whites: a systematic review and meta-analysis. J. Periodontol. 2012, 83 (11): 1407-1419.
11. Luis-Delgado O., Echevarria-Garcia J. J., Berini-Aytes L. et al. Periodontitis as a risk factor in patients with ischemic heart disease. Med. Oral. 2004, 9(2):125-137.
12. Schröder N.W., Hermann C., Hamann L. et al. High frequency of polymorphism Arg753Gln of the Toll-like receptor-2 gene detected by a novel allele-specific PCR. J. Mol. Med. 2003, 81 (6): 368-372.
13. Taba M. Jr., Souza S.L., Mariguela V.C. Periodontal disease: a genetic perspective. Braz. Oral. Res. 2012, 26 (l): 32-8.
14. Tesse R., Cardinale F., Santostasi T. et al. Association of beta-defensin-1 gene polymorphisms with Pseudomonas aeruginosa airway colonization in cystic fibrosis. Genes Immun. 2008, 9 (1): 57-60.
Поступила 15.05.15
Контактная информация: Свитич Оксана Анатольевна,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5a, р.т. (495)674-55-01
ОБЗОРЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
П.Д.Лопухов1, Н.И.Брико1, А.А.Халдин2, Н.Н.Цапкова1, О.В.Лупашко2
ПАПИЛЛОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ: ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ, ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА
1Первый Московский государственный медицинский университет И.М. Сеченова,
2Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии
Папилломавирусы — большая и разнообразная группа вирусов. Она включает около двухсот полностью описанных типов, которые были обнаружены у людей. Вирусы папилломы человека (ВПЧ) выступают этиологическим агентом при различных доброкачественных и злокачественных поражениях эпителия слизистых оболочек и кожи. Крайне важно, что персистирующая ВПЧ инфекция определенных типов является ведущей причиной рака шейки матки, полового члена, вульвы, влагалища, анального канала и ротоглотки (включая основание языка и миндалины). Профилактика ВПЧ инфекции — лучший способ борьбы с обусловленными ВПЧ заболеваниями, а вакцинация, как было показано, самый эффективный метод ее профилактики. В данной статье рассмотрены основные характеристики и клинические проявления папилломавирусной инфекции, а также эффективность вакцинации против ВПЧ.
Журн. микробиол., 2016, № 1, С. 71—78
Ключевые слова: папилломавирус, рак шейки матки, аногентиальные бородавки, вакцинация
