CC BY
65
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ПУЛЬМОНОЛОГИИ
И.В. Салтыкова1, М.Б. Фрейдин2, Е.Ю. Брагина2, Л.М. Огородова1, В.П. Пузырёв2
Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Российская Федерация 2Научно-исследовательский институт медицинской генетики СО РАМН, Томск, Российская Федерация
Ассоциация полиморфизма ^6737848 гена SOCS5 с бронхиальной астмой
Цель исследования: провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов регуляции иммунного ответа с бронхиальной астмой. Пациенты и методы. Проанализировано 10 однонуклеотидных замен генов №N0 (^2069705), IFNGR2 (^17880053), №4 (^2070874), Ы4ВЛ (гз1805010), 0ЛТЛ3 (п10905277), ТВХ21 (п11652969,), РШУ (п3760903), РШ3 (п12756687), 8ТЛТ5р (ть16967593), 30С35 (п6737848) путем полиморфизма длин рестрикционных фрагментов у 106 больных бронхиальной астмой и 115 здоровых индивидов. Результаты. С помощью логистической регрессии показана ассоциация полиморфизма ^6737848 гена 30С35 с бронхиальной астмой в аддитивной и доминантной модели (р =0,05, 0R =0,338, 95% С10,158—0,723;р =0,02, 0R =0,284, С10,126—0,638, соответственно). Не обнаружено вклада полиморфизма исследованных генов в изменчивость уровня общего ^Е. Выводы. Полученные данные свидетельствуют о патогенетической роли полиморфизма ^6737848 гена 30С35 в отношении бронхиальной астмы. Ключевые слова: бронхиальная астма, генетический полиморфизм, ^Е, 80С85.
53
Введение
Бронхиальная астма (БА) — мультифакториальное заболевание дыхательных путей, развитие которого определяется сложным взаимодействием множества генов и факторов внешней среды. Поиск генов предрасположенности к БА — актуальная задача, на решение которой направлены значительные усилия, поскольку ожидается, что установление молекулярно-генетических причин развития заболевания поможет лучше понять его патофизиологию и разработать новые эффективные методы диагностики и персонифицированной терапии БА.
В большинстве случаев развитие БА связывают с активностью T лимфоцитов-хелперов 2-го типа (Т^). Гены ТЬ2-профиля иммунного ответа достаточно хорошо изучены в отношении связи с аллергическими болезнями, включая БА. Так, например, показана ассоциация полиморфизма генов 0ЛТЛ3, ТВХ21, а4, 8ТЛТ6
с БА и аллергией [1]. При этом исследования генов
Т^-профиля, участвующего в иммунном ответе против определенных бактерий и являющегося антагонистом ТЦ-иммунитета, в отношении предрасположенности БА единичны. В то же время накапливается все больше данных о роли микробиоты, населяющей бронхолегочные пути, в развитии БА и тяжести ее течения [2, 3]. В связи с этим изучение генов ТЬ1-пути в отношении развития БА и ее клинических признаков является весьма актуальным. Результаты исследований генов Т^-профиля подтверждают их роль в развитии БА. Например, показана связь полиморфизма гена ^N0 с БА детского возраста [4], аллергией [5] и уровнем общего ^Е [6].
Процесс дифференцировки наивных Т хелперов в клетки ТЬ2- или Т^-профиля называется поляризацией. Ключевыми участниками этого процесса являются цитокины. Они регулируют функциональную активность клеток иммунной системы, изменяя главным образом транскрипционные профили этих клеток. Свое действие цитокины реализуют, связываясь с рецепторами
I.V. Saltykova1, M.B. Freidin2, E.Y. Bragina2, L.M. Ogorodova1, V.P. Puzyrev2
1 Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation 2 Research Institute of Medical Genetics, Tomsk, Russian Federation
Association of Polymorphism Rs6737848 in the Socs5 Gene with
Bronchial Asthma
Aim: to investigate the role of polymorphic variants of immune-response modifying genes in predisposition to asthma. Patients and methods. The analysis of restriction fragments length polymorphism was used to investigate 10 single-nucleotide polymorphisms: IFNG rs2069705, IFNGR2 rs17880053, IL4 rs 2070874, IL4RA rs 1805010, GATA3 rs10905277, TBX21 rs11652969, PIASY rs3760903, PIAS3 rs12756687, STAT5 rs16967593, and SOCS5 rs6737848 in 106 asthma patients and 115 healthy people. Results. The rs6737848 SOCS5 polymorphism was significantly associated with asthma in additive model (p =0,05, OR =0,338, 95%CI 0,158—0,723) and in dominant model (p =0,02, OR =0,284, CI 0,126— 0,638). None of the polymorphisms of the studied genes was associated with total IgE levels. Conclusions. This is the first report on the association of rs6737848 SOCS5 with asthma.
Key words: bronchial asthma, gene polymorphism, IgE, SOCS5.
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 7
на клеточной мембране, что приводит к активации транскрипционных факторов, в т.ч. сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции STAT. Наиболее изученным геном этого семейства в связи с предрасположенностью к БА является STAT6, участвующий в активации IL 4 и 13, однако существуют данные о роли и других молекул семейства STAT в развитии БА и связанных с ней клинических признаков. В частности, установлены ассоциации полиморфизма генов STAT2, STAT4 с БА в азиатских популяциях [7, 8].
К ингибиторам проведения сигнальных каскадов относятся супрессоры цитокиновых сигналов (SOCS) и протеиновые ингибиторы активированных STAT (PIAS) [9]. Исследования ингибиторов проведения сигнальных каскадов цитокинов в связи с предрасположенностью к БА и атопии практически отсутствуют. Однако их участие в регуляции функционирования иммунной системы и роль в патогенезе других иммуноопосредованных заболеваний дает основание предполагать вклад генов семейства SOCS и PIAS в предрасположенность к БА.
Цель исследования: оценить ассоциации БА с полиморфизмом генов, участвующих в регуляции Thj- и Th2-профиля иммунного ответа.
54 Пациенты и методы
Участники исследования
Были сформированы выборки больных БА и здоровых индивидов на базе Медицинского объединения «Центр семейной медицины» и Областной клинической больницы г. Томска. Частично были приглашены волонтеры из числа госпитализированных и амбулаторных пациентов других лечебно-профилактических учреждений г. Томска. Общими критериями включения для анализируемых групп было отсутствие родственных связей между индивидами, принадлежность к русскому этносу, возраст от 18 до 65 лет. Критериями включения для здоровых индивидов были отсутствие аллергических болезней в анамнезе и отрицательные скарификационные аллерго-логические пробы. Критериями исключения стали психические заболевания, злоупотребления алкоголем или наркотиками в анамнезе, ВИЧ-инфекция.
Обследовано 106 пациентов с БА, из них 82 женщины (43,5+12,3 года) и 24 мужчины (32,6+11,5 года). У всех пациентов была диагностирована атопическая БА на основании критериев экспертов ВОЗ: наличие характерного анамнеза, типичные клинические симптомы астмы, атопия (атопический анамнез, положительные тарификационные аллергологические пробы). Степень тяжести заболевания устанавливали по критериям документа GINA (2006). Контрольную выборку составили 115 индивидов, из них 95 женщин (31,7+11,2 года) и 20 мужчин (34,0+11,4 года).
Методы исследования
Исследовано 10 полиморфных вариантов генов цито-кинов и молекул регуляции сигнальных каскадов: ^N0 к2069705, IFNGR2 к17880053, К4 ге 2070874, К4Ш ге 1805010, GATA3 гб10905277, TBX21 к11652969, PIASY к3760903, PIAS3 гб12756687, STAT5p гб16967593, SOCS5 ге6737848. Для генотипирования использовали образцы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), выделенной из цельной венозной крови по стандартной методике. Ге-нотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров,
подобранных с помощью программы «Primer3», с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (табл. 1). Для проведения ПЦР добавляли 100—200 нг геномной ДНК в 20 мкл реакционной смеси: 2,5 пмоль специфических праймеров (Биосан, Новосибирск), 2 ммоль каждого dNTP, 1,5 ммоль MgCl2, 0,5 Ед Taq ДНК-полимеразы (SibEnzime, Россия) в 10х реакционном буфере. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и ам-плифицировали в автоматических минициклерах «2720 Thermal Cycler» (Applied Biosystems, США) и «ТП4-ПЦР-01-Терцик» (ДНК-Технология, Россия).
Статистическая обработка данных
Статистический анализ проводили с использованием программы «SPSS 16.0» (IBM Corp., США). Частоты генотипов по исследованным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди—Вайнберга (РХВ) при помощи точного теста Фишера. Методом бинарной логистической регрессии оценены кодоминантные, доминантные, рецессивные и аддитивные модели для каждого из проанализированных полиморфных вариантов генов. Степень выраженности ассоциации определена путем расчета отношения шансов (odds ratio, OR) и его доверительного интервала (confidence interval, CI) для каждой модели. Межгенные взаимодействия анализировали с помощью множественной логистической регрессии.
Поправку на множественные сравнения проводили с помощью подхода False Discovery Rate (FDR) [10]. Расчет поправки проводили в среде R с помощью функции p.adjust. В результатах везде представлены величины p с учетом поправки на множественные сравнения.
Для анализа ассоциаций уровня IgE с полиморфизмами исследуемых генов использовали однофакторный дисперсионный анализ. Поскольку исходное распределение этого признака отличалось от нормального (согласно данным теста Колмогорова—Смирнова), уровень IgE был прологарифмирован, чтобы перейти к логнормальному распределению. Кроме того, не были получены статистически значимые различия дисперсий между сравниваемыми группами, что позволило применить дисперсионный анализ.
Результаты
У здоровых лиц для исследуемых полиморфных вариантов частоты генотипов соответствовали ожидаемым при РХВ. С помощью логистической регрессии показана связь полиморфизма к6737848 гена SOCS5 с БА в аддитивной (р =0,05, OR =0,338, 95% С1 0,158-0,723) и доминантной модели (р =0,02, OR =0,284, 95% С1 0,1260,638) (табл. 2). Для полиморфизма генов те2069705 ^N0 и ш12756687 PIAS3 была установленаа ассоциация с БА в рецессивной модели, однако после поправки на множественные сравнения ассоциации стали статистически не значимы (р =0,055) (см. табл. 2). Для других исследованных полиморфизмов ассоциаций с БА не показано.
Учитывая результаты анализа ассоциаций, для генов SOCS5, ^N0 и PIAS3 проведена оценка межгенного взаимодействия в отношении ассоциации с БА. Тестировали трехкомпонентную модель, включающую взаимодействие 3 генов (рассмотрен аддитивный эффект каждого из генов), а также двухкомпонентные модели для каждой
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ПУЛЬМОНОЛОГИИ
Таблица 1. Характеристика исследованных полиморфизмов, структуры праймеров и ферменты рестрикции
Ген, полиморфизм Локализация Структура праймеров Фермент рестрикции (SibEnzime, Россия)
PIAS3 rs12756687 1q21 Интрон 1 F- 5 '-TGAACCCTGACCTGAAAACC-3' R-5'-CCTCCTGGGAACAGGATAGG-3' Bst2U I
PIASY rs3760903 19p13.3 Интрон 1 F-5'-GGCTGCAGTTTACATACCCC-3' R-5'-CAGAAGCCAGGTGTCCTCGA-3' Bst4C I
TBX21 rs11652969 17q21.32 Интрон 1 F-5'-TGCCTGTAGTCAAGGAGAGAAT-3' R-5'-TGAAGAAACTGACGCTCCG-3' BssT1 I
GATA3 rs10905277 10p15 5'UTR F-5'-GTTGTTGCCACTCCAGCAACT-3' R-5'-GGAGGGGTCGTTTAGCAAAG-3' Rsa I
IL4RA rs1805010 16p12.1 ЭкзонЗ F-5'-GGCAGGTGTGAGGAGCATCC-3' R-5'-GCCTCCGTTGTTCTCAGGTA-3' Rsa I
IL4 rs2070874 5q31.1 5'UTR F 5'-AGAGAGGGGCTGATTGGC -3' R-5'-GGAGAGATGGTGCCAGAT-3' BstMAI
STAT5b rs16967593 17q11.2 Интрон 1 F 5'-TTTTGGAATGTTTGCCCTTC-3' R-5'-ATGGCATTCAGGTTGCGTAG-3' AatII
IFNG rs2069705 12q14 Промотор F-5'-ATTATCAAGCCAGTTTTACAG-3' R-5'-GATTCTTTCTCCTCCTTTGTA-3' Hpa I
IFNGR2 rs17880053 21q22.11 Промотор F-5'-ATGTCCCTCCCTTCTTCACCGTA-3' R-5'-TGTGGAAGTCAGGCAAGGATTAT-3' Msp20 I
SOCS5 rs6737848 2p21 Интрон 1 F-5'-CGGTTTACAAAATGAAAGCTGA-3' R-5'-GGACGAATAGTAAAATTCAAGGACA-3' BstDE I
55
Таблица 2. Характеристики логрегрессионных моделей для rs6737848 SOCS5, rs2069705 IFNGи rs12756687 PIAS3
Модель Генотипы БА (n; %) Контроль (n; %) OR (95% CI) p FDR-скорректи-рованный р
rs6737848 SOCS5 доминантная СС GC-GG 94 (91,3) 9 (8,7) 80 (74,8) 27 (25,2) 1,00 0,284 (0,126-0,638) 0,002 0,020
rs6737848 SOCS5 аддитивная CC GC GG 94 (91,3) 8 (7,8) 1 (1) 80 (74,8) 26 (24,3) 1 (0,9) 1,00 0,338 (0,158-0,723) 0,005 0,05
rs2069705 IFNG рецессивная CC-CT TT 93 (89,4) 11(10,6) 85 (75,9) 27 (24,1) 1,00 0,372 (0,174-0,796) 0,011 0,055
rs12756687 PIAS3 рецессивная GG-GC CC 81 (76,4) 25 (23,6) 103 (89,6) 12 (10,4) 1,00 2,649 (1,255-5,593) 0,011 0,055
пары генов. Статистически значимые эффекты взаимодействия не показаны ни для одной из моделей. Также не продемонстрировано ассоциации полиморфизма исследованных генов с уровнем общего ^Е ни для одной из тестируемых моделей.
Обсуждение
В результате исследования установлена ассоциация полиморфизма га6737848 гена БОСБ5 с БА. Кроме того, показаны тенденции к ассоциации полиморфизмов генов №N0 и Р1АБ3 с исследуемой болезнью. При этом не установлено статистически значимого эффекта взаимодействия между этими 3 генами в отношении их ассоциации с БА. Таким образом, можно предполагать независимый патогенетический эффект полиморфизма гена БОСБ5 в развитии астмы.
Насколько нам известно, ассоциация гена БОСБ5 с БА показана впервые. БОСБ5 является потенциальным регулятором сигнального каскада ^ 4, т.к. способен ингибировать ТЬ2-иммунный ответ путем связывания с а-субъединицей рецептора этого цитокина. Экспрессия гена БОСБ5 по-
ложительно коррелирует с экспрессией TBX21 и FOXP3 и негативно связана с экспрессией IL4 [11].
Данные о роли SOCS5 в отношении аллергических болезней противоречивы. В одном из исследований сделано заключение о том, что SOCS5 не связан с аллергическим статусом на основании данных отсутствия корреляции экспрессии SOCS5 с аллергической сенсибилизацией у 248 детей [11]. В исследовании модели астмы на мышах гиперэкспрессия SOCS5 оказалась связана с повышением уровня экспрессии IL5 и IL13 в бронхолегочном лаваже, эозинофилией и повышенной бронхолегочной реактивностью [12]. Авторы предположили, что гиперэкспрессия SOCS5 не ингибирует ТЪ2-иммунный ответ и способствует поддержанию симптомов астмы в модели in vivo. Таким образом, исследования, посвященные изучению роли SOCS5 в отношении аллергических заболеваний, противоречивы и демонстрируют отсутствие понимания функциональной роли этой молекулы.
Поскольку в нашем исследовании не показана ассоциация полиморфизма гена SOCS5 с уровнем общего IgE, можно предполагать, что SOCS5 реализует свой вклад в развитие БА независимо от IgE-опосредованных механизмов поддержания аллергического воспаления. Ме-
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 7
ханизм вовлеченности SOCS5 в развитие БА неясен, однако существуют данные, что эта молекула является одним из ингибиторов активации рецептора эпидер-мального фактора роста (EGFR), увеличение продукции которого ассоциировано с ремоделированием бронхо-легочной системы у больных БА [13]. Таким образом, можно предположить, что SOCS5 может быть вовлечен в развитие БА посредством регуляции сигнального пути EGFR. Эта гипотеза требует экспериментального подтверждения.
Заключение
Показана ассоциация полиморфизма ш6737848 гена SOCS5 с БА в аддитивной и доминантной модели (р =0,05, OR =0,338, 95% С1 0,158-0,723; р =0,02, OR =0,284, 95% С1 0,126-0,638, соответственно). Не установлено вклада полиморфизма исследованных генов в изменчивость уровня общего ^Е. Полученные данные свидетельствуют о патогенетической роли полиморфизма ш6737848 гена SOCS5 в отношении БА.
ЛИТЕРАТУРА
56
1. March M.E., Sleiman P. M., Hakonarson H. The genetics of asthma and allergic disorders. Discov. Med. 2011; 11 (56): 35-45.
2. Ege M.J., Mayer M., Schwaiger K. et al. Environmental bacteria and childhood asthma. Allergy. 2012; 67 (12): 1565-1571.
3. Hilty M., Burke C., Pedro H. et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PLoS One. 2010; 5 (1): 8578.
4. Nakao F., Ihara K., Kusuhara K. et al. Association of IFN-gamma and IFN regulatory factor 1 polymorphisms with childhood atopic asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2001; 107 (3): 499-504.
5. Nieters A., Brems S., Becker N. Cross-sectional study on cytokine polymorphisms, cytokine production after T-cell stimulation and clinical parameters in a random sample of a German population. Hum. Genet. 2001; 108 (3): 241-248.
6. Nagarkatti R., Rao C.B., Rishi J.P. et al. Association of IFNG gene polymorphism with asthma in the Indian population. J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 110 (3): 410-412.
7. Li Y., Wu B., Xiong H. et al. Polymorphisms of STAT-6, STAT-4 and IFN-gamma genes and the risk of asthma in Chinese population. Respir. Med. 2007; 101 (9): 1977-1981.
8. Hsieh YY, Wan L., Chang C.C. et al. STAT2*C related genotypes and allele but not TLR4 and CD40 gene polymorphisms are associated with higher susceptibility for asthma. Int. J. Biol. Sci. 2009; 5 (1): 74-81.
9. Wormald S., Hilton D.J. Inhibitors of cytokine signal transduction. J Biol Chem. 2004; 279 (2): 821-4.
10. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. Royal Statistic. Soc., Series B (Methodological). 1995; 57 (1): 289-300.
11. Daegelmann C., Herberth G., Ruder S. et al. Association between suppressors of cytokine signalling, T-helper type 1/T-helper type 2 balance and allergic sensitization in children. Clin. Exp. Allergy. 2008; 38 (3): 438-448.
12. Ohshima M., Yokoyama A., Ohnishi H. et al. Overexpression of suppressor of cytokine signalling-5 augments eosinophilic airway inflammation in mice. Clin. Exp. Allergy. 2007; 37 (5): 735-742.
13. Le Cras T.D., Acciani T.H., Mushaben E.M. et al. Epithelial EGF receptor signaling mediates airway hyperreactivity and remodeling in a mouse model of chronic asthma. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2011; 300 (3): 414-421.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Салтыкова Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ Адрес: 634050, Томск, Московский тракт, д. 2, тел.: (3822) 52-99-16, e-mail: [email protected] Фрейдин Максим Борисович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории популяци-онной генетики ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» СО РАМН Адрес: 634050, Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10, тел.: (3822) 42-09-56, e-mail: [email protected] Пузырёв Валерий Павлович, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» СО РАМН, руководитель лаборатории популяционной генетики ФГБУ «НИИМГ» СО РАМН
Адрес: 634050, Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10, тел.: (3822) 51-22-28, e-mail: [email protected] Огородова Людмила Михайловна, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующая кафедрой факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Адрес: 634050, Томск, Московский тракт, д. 2, тел.: (3822) 53-10-22, e-mail: [email protected]
Брагина Елена Юрьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории популяционной генетики
ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» СО РАМН
Адрес: 634050, Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10, тел.: (3822) 42-09-56, e-mail: [email protected]
