CC BY
5©Коллектив авторов, 2017 Вопросы онкологии, 2017. Том 63, № 4
УДК 618.11-006.6
Т.И. Иванова, Н.И. Сыченкова, В.А. Хорохорина, Н.И. Рябченко, С.А. Иванов, Л.И. Крикунова
Ассоциация аллеля Е4 (ге 429358) гена аполипопротеина Е (АРОЕ) с серозной аденокарциномой яичников
МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, Обнинск
С целью выявления генетической предрасположенности к развитию серозной аденокар-циномы яичников проанализировано распределение аллеля Е4 (rs 429358, С) гена АРОЕ в группах здоровых женщин (454 человека) и пациенток с диагнозом серозная аденокарци-нома яичников (114 человек). Определялись показатели прогностической эффективности оценки аллеля Е4: отношение шансов (OR) и AUC (Area Under Curve) - площадь под ROC кривой. Показано, что носительство аллеля Е4 АРОЕ значимо ассоциировано с обнаружением серозной аденокарциномы яичников (р=0,003; OR=1,94, AUC=0,55), а частота встречаемости генотипов, включающих Е4, достоверно увеличена (р=0,02; OR=1,8). при раздельном анализе двух возрастных подгрупп (старше и моложе 46 лет) обнаружено, что опасность развития серозной аденокар-циномы яичников значимо повышена у женщин старшего возраста (р=0,006; OR=2,24, AUC=0,76). Необходимо выяснение возможных ассоциаций носительства АРОЕ 4 с серозной аденокарциномой яичников у женщин репродуктивного возраста.
Ключевые слова: APOE, аллель Е4, серозная аденокарцинома яичников
В Российской Федерации рак яичников (РЯ) занимает первое место по показателю смертности от рака органов женской репродуктивной системы, составляя около 36 % летальных исходов, при этом прирост заболеваемости с 2004 года по 2014 составил 8 % [3]. 60-70 % всех диагностированных случаев выявляются на III и IV стадиях, поэтому проблема выявления генетических факторов предрасположенности является актуальной. Среди больных раком яичников (РЯ) доля носительниц мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 превышает популяционный уровень в 100 раз (10-15 % при частоте встречаемости в популяции 0,1 %) [5]. Однако, у большинства женщин РЯ развивается в отсутствие этих мутаций. Соответственно проводятся масштабные исследования, направленные на поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания. В рамках проекта «Полногеномный анализ ассо-
циаций (GWAS)» выявлено около двух десятков распространённых аллелей, сопряжённых с РЯ, и каждый год появляется информация об обнаружении новых генов такого рода [13, 17, 23]. Ассоциации с заболеваемостью высоко достоверные, но небольшие, поэтому клиническая полезность пока ограничена.
ранее нами была показана сопряжённость минорных аллелей ряда генов, к числу которых относится аполипопротеин Е (АРОЕ), с эстро-генозависимыми заболеваниями, и на этом основании предложен способ определения риска развития рака эндометрия [2, 10, 12]. Целью данной работы - был анализ ассоциаций варианта Е4 (rs 429358) аполипопротеина Е (АРОЕ) с раком яичников.
Материал и методы исследования
Группы исследования составляли здоровые лица (454 человек, средний возраст 43,84±12,66), не имевшие в анамнезе гинекологических заболеваний, и пациентки, у которых был обнаружен рак яичников (167 женщин, средний возраст 54,79±11,04). Ассоциативный анализ выполнялся для пациенток с серозной аденокарциномой яичников, поскольку эта форма рака представлена в 72 % (114 женщин) случаев, причём 75 % составляли раки 3 и 4 степени по классификации FIGO.
ДНК выделяли из периферической крови с помощью набора «Wizard Genomic DNA Purification Kit» («Promega») в соответствии с протоколом производителя. В момент взятия образцов обследуемые лица подписывали форму информированного согласия на участие в исследовании, а врачом заполнялась анкета, включающая данные о возрасте, росте, весе, этнической принадлежности, диагнозе заболевания обследованных женщин. Исследование было одобрено Этическим комитетом МРНЦ им. А.Ф. Цыба.
Для генотипирования использовали методику поли-меразной цепной реакции с последующей обработкой Cfo1(Promega) рестриктазой и определением длин фрагментов рестрикции (ПЦР/ПДРФ). Аллель Е2 на электро-фореграмме имеет 4 полосы, соответствующие 91, 83, 39 и 32 парам оснований. Аллель Е4 имеет 5 полос, соответствующие 72, 48, 39, 35 и 32 парам оснований. Аллель Е3 характеризуется 5 полосами, соответствующими 91, 49, 39, 36 и 32 парам оснований. Определялись частоты по Е3/Е2/Е4 гаплотипам аполипопротеина Е (АРОЕ). Исследование проводилось путём сравнения частот генотипов и аллелей в группах контроля и у больных женщин. Статистический анализ проводили стандартными методами с помощью пакета программ MedCalk. Для обнаружения различий между средними значениями двух выборок, внутри которых показатели (возраст, вес) нормально распре-
делены, применяли t-критерий для независимых выборок. В случае, когда распределение частот не соответствовало нормальному, использовали непараметрические тесты: для двух независимых выборок — Манн-Уитни, при сравнении более чем двух независимых выборок - Крускал и Уол-лис. При сравнении частот генотипов применялся точный двусторонний критерий Фишера. Для оценки достоверности различий частот генотипов использовался трендовый тест Армитажа (http://www.biomedcentral.eom/1753-6561/3/ S7/S37). Вклады различных генотипов в заболеваемость определялись с помощью традиционного для исследований «случай-контроль» показателя «odd ratio» (OR - отношение шансов, мера коррелятивной связи) и его 95 % доверительный интервал (CI); при отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR=1, а при OR>1 шанс заболевания при данном генотипе повышен. С целью выяснения взаимосвязей между предрасположенностью к аденокарциноме яичников и изучаемыми признаками выполнялся анализ логистической регрессии с пошаговым алгоритмом оценки уравнений. С помощью ROC (Receiver Operator Characteristic) анализа проводилась оценка прогностической значимости параметров, ассоциированных с серозной аденокарциномой яичников. Определялся показатель прогностической эффективности AUC (Area Under Curve) - площадь под ROC кривой - вероятность отличить больного от здорового, ориентируясь на маркёр. Чем выше показатель, тем лучше маркёр. Значение 0,5 демонстрирует непригодность потенциального маркёра.
Результаты и обсуждение
Белковые продукты Е2, Е3 и Е4 АРОЕ отличаются между собой аминокислотными заменами в двух сайтах: 112 и 158, обусловленные однонуклотидными полиморфизмами (SNP) в
соответствующих кодонах: С (цитозин) или Т (тимин). Позиции в аминокислотной последовательности белка АРОЕ цистеин 112+арги-нин 158, традиционно обозначают аллелем Е3; ге7412, цистеин 112+цистеин 158 - традиционное обозначение аллеля Е2; ге 429358, аргинин 112+аргинин 158 - традиционное обозначение аллеля Е4. В результате нашего исследования, где подавляющую долю (82 %) больных составляли женщины старше 46 лет, показано, что аллель Е4 гена АРОЕ (ге 429358) выявил значимую ассоциацию с раком яичников, а именно с серозной аденокарциномой. Частота аллеля среди здоровых женщин составляет 9 %, что соответствует популяционной частоте для жителей центральных областей России [4]. Среди больных она равна 16 % (табл. 1). Частота гомозиготных генотипов Е4Е4 среди больных составляет 4 %, а среди здоровых 0,5 %, различия значимы (р=0,005). Носительство аллеля Е3 сопряжено с протективным эффектом (OR=0,62; 95 % С1 0,43-0,89; р=0,01). Аллель Е2 не выявил ассоциацию с серозной аденокарциномой яичников.
Хотя превышение аллеля Е4 и генотипов, его включающих, в группе больных значимо (р=0,003 и 0,02 соответственно), однако, величина АиС для аллеля Е4 в суммарных выборках больных и здоровых женщин, равная 0,55, указывает на то, что данный показатель сам
Таблица 1. Распределение генотипов АРОЕ среди пациенток с серозной аденокарциномой (АДК) яичников
и здоровых женщин
Группы сравнения Генотипы Гаплотипы (аллели)
Е3Е3 Е3Е4 Е3Е2 Е4Е4 Е2Е2 Е2Е4 Е3 Е4 Е2
АДК n=114 число ( %) 71 (62) 25 (22) 11 (10) 5 (4) 1 (1) 1 (1) 178(78) 36(16) 14(6)
Контроль n=444 число ( %) 320(72) 70(16) 47(10,5) 2 (0,5) 1(0,1) 4(0,9) 757(85) 78(9) 53(6)
Р 0,51 0,13 0,86 0,005 0,37 1 0,01 0,003 0,88
Таблица 2. Частота генотипов и аллеля Е4 (ге 429358, С) гена АРОЕ у здоровых женщин и пациенток с серозной аденокарциномой (АДК) яичников в зависимости от возраста
Группы сравнения Генотипы Аллели
Число (проценты) Р1 Х-В Р2 OR 95 % CI2 Число (проценты) Р3 oR 95 % CI AUC 95 % CI
ТТ ТС СС Т С
АДК сумма 83 (73) 26 (23) 5 (4) 0,20 0,02 1,8 1,11-2,92 192 (84) 36 (16) 0,003 1,94 1,27-2,97 0,55 0,51-0,59
Контроль сумма 367 (82,5) 74 (17) 2 (0,5) 0,44 808 (91) 78 (9)
АДК>46 69 (73,4) 22 (23,4) 3 (3,2) 0,53 0,02 2,13 1,16-3,94 160 (85) 28 (15) 0,006 2,24 1,28-3,92 0,76 0,72-0,79
Контроль >46 159 (85,5) 27 (14,5) 0 0,32 345 (93) 27 (7)
АДК<45 14 (70) 4 (20) 2 (10) 0,18 0,25 1,8 0,67-4,98 32 (80) 8 (20) 0,06 2,27 0,99-5,19 0,56 0,50-0,62
Контроль <45 208 (81) 47 (18) 2 (1) 0,74 463 (90) 51 (10)
Примечание: р1 - уровень статистической значимости различий частот генотипов с равновесием Харди-Вайнберга; р2 - уровень статистической значимости различий частот генотипов ТС+СС у больных по сравнению со здоровыми женщинами; р3 - уровень статистической значимости различий частоты аллеля С (Е4) между больными и здоровыми женщинами
по себе является плохим маркёром при таком сравнении. Среди суммарной группы здоровых женщин, основная доля которых представлена в репродуктивном возрасте, тоже много носительниц этого аллеля. Есть данные об ассоциации Е4 с уровнем стероидных гормонов, при этом особенно его негативное влияние распространяется на женщин [21]. Поэтому были учтены возраст и индекс массы тела (ИМТ) больных и здоровых женщин. Анализ выполнялся на модели логистической регрессии с пошаговым алгоритмом оценки уравнений. Было обнаружено, что негативное влияние аллеля Е4 сопряжено с возрастом (OR=2,35; AUC=0,76; 95 % доверительный интервал от 0,72 до 0,79, р=0,0004; процент конкордации модели 79,5). ROC анализ сопряжённости возраста с заболеванием выявил пороговую величину - 46 лет (AUC=0,74; 95 % доверительный интервал от 0,71 до 0,78; p<0,0001). В табл. 2 приведено распределение частот аллеля Е4 (rs 429358) в суммарной выборке и в группах, стратифицированных по возрасту.
Частоты генотипов соответствуют равновесному распределению Харди-Вайнберга (во всех случаях p>0,05), что может быть обусловлено малочисленностью группы больных женщин (табл. 2). Показано, что в обеих возрастных подгруппах частота Е4 в два раза выше по сравнению со здоровыми женщинами, но значимость различий выявлена только для женщин старшего возраста (р=0,006). У носительниц генотипов Е4 старше 46 лет шанс развития серозной адено-карциномы яичников в два раза выше, чем у носительниц мажорного аллеля (р=0,02) (табл. 2). В случае больных моложе 46 лет значимая ассоциация аллеля Е4 с раком яичников не выявлена (р=0,06) (табл. 2). Наличие высокоспецифичных маркёров, позволяющих определить РЯ на начальных бессимптомных стадиях, могло бы увеличить выборку больных женщин репродуктивного возраста, что вероятно позволило бы выявить значимость ассоциации аллеля Е4 и в этой возрастной категории. Сравнение распределения частоты аллеля Е4 (rs 429358; С) между двумя возрастными подгруппами у больных (20 % и 15 %, р=0,47) и здоровых женщин (10 % и 7 %, р=0,19) не выявило значимых отличий (табл. 2).
Известно, что белок — аполипопротеин Е (АРОЕ) является одним из основных ли-попротеинов плазмы с антиоксидантными, противовоспалительными и антиатерогенны-ми свойствами [11, 23]. Отдельные изоформы белка вовлечены в ряд патофизиологических процессов: болезнь Альцгеймера, агрессивный рассеянный склероз, гиперлипопротеинемия III типа, повышенный уровень холестерина и
триглицеридов в плазме, атеросклероз [1, 7]. Предполагают, что белок АРОЕ посредством целого ряда биологических процессов (передача сигналов, липидный транспорт, поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза) участвует в распространении, пролиферации и выживании опухолевых клеток. Выявлена его потенциальная роль в качестве опухоль-ассо-циированного маркёра: уровень экспрессии АРОЕ значительно повышен в клетках злокачественных карцином яичников и эндометрия [6, 8, 9]. Ингибирование АРОЕ приводило к апоптозу только тех раковых клеток, в которых этот ген был оверэкспрессирован. Авторы полагают, что экспрессия АРОЕ отражает степень злокачественности опухоли и определяет её дальнейшую эволюцию. Можно предположить, что изоформа Е4 АРОЕ по сравнению с Е3 за счёт лучшего и более прочного связывания с липидами способствует быстрому и полному усвоению энергонасыщенных жиров, тем самым создавая благоприятные условия для быстрорастущих злокачественных клеток [15].
Влияние полиморфизма Е2/Е3/Е4 на развитие онкологических заболеваний не является однозначным. Было обнаружено, что аллель Е4 (ге 429358) сопряжён с развитием рака молочной железы у женщин [16, 19], а аллель Е2 (ге7412) с развитием колоректального рака у мужчин и раком тела матки с сопутствующей гиперплазией эндометрия у женщин [10, 21]. Проведённое в Нидерландах исследование корреляций гаплотипов Е2/Е3/Е4 гена АРОЕ с уровнем холестерина плазмы и раком показало, что носители разных аллелей не отличаются между собой повышенным риском онкологических заболеваний, суммированным по всем типам и локализациям вкупе для мужчин и женщин [20]. Американскими исследователями была выявлена предрасположенность к раку толстой кишки для носителей генотипов Е2/Е2, Е2/Е4, Е4/Е4 старше 65 лет независимо от пола (OR=1,88) [18]. Исследователи из группы А. И. Яшина (Центр популяционного здоровья и старения университет Дюка, Дур-хам, США) установили, что основными факторами, модулирующими системный эффект аллеля Е4 (ге 429358) АРОЕ на продолжительность жизни являются не нейродегене-ративные и сердечно-сосудистые патологии, а пол, возраст и онкологические заболевания [14]. В зависимости от возраста носительство варианта Е4 повышает риск онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний у женщин и снижает у мужчин.
Выявленная в настоящей работе ассоциация аллеля Е4 (ге 429358) гена АРОЕ с серозной
аденокарциномой яичников для женщин старше 46 лет отчасти согласуется с данными литературы относительно его роли в развитии злокачественных заболеваний. Анализ вариантов гена АРОЕ мог бы помочь выявить группу риска и, не исключено, позволил бы своевременно предпринять превентивные меры. Итоги проведенной работы позволяют надеяться на дальнейшее развитие исследований в данной области.
Работа частично поддержана грантом РФФИ 14-44-03072 р центр а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иванова Т. И., Полуэктова М. В., Хорохорина В. А. и др. Влияние генотипов APOE на биохимические показатели метаболизма железа и липидов у больных неопластическими заболеваниями эндометрия и здоровых женщин // Исследования и практика в медицине. - 2014. - Т. 1 (1). - C. 35-44.
2. Иванова Т. И., Крикунова Л. И., Рябченко Н. И. и др. Способ определения риска развития рака тела матки. Патент РФ № 2558059, зарегистр. 10.07.2015.
3. Каприн А. Д., Старинский В. В. Злокачественные новообразования в России в 2014 году (заболеваемость и смертность). — М.: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2016. -250 с.
4. Козлов А. И., Боринская С. А., Санина Е. Д. «Экономный Генотип» £4/ £4 по гену АРОЕ и риск метаболических нарушений в популяциях уральских народов // Экологическая генетика. - 2011. - Т. 2 (9). - C. 17-23.
5. Соколенко А. П., Иевлева А. Г., Митюшкина Н. В. и др. Синдром наследственного рака молочной железы и яичников в Российской Федерации // ACTA NATURAE.
- 2010. - Т. 2 (4). - C. 35-39.
6. Chen Y-C., Pohl G., Wang T.-L. et al. Apolipoprotein E is required for cell proliferation and survival in ovarian cancer // Cancer Research. - 2005. - Vol. 1. - Р. 331-337.
7. Corder E.H., Saunders A.M., Strittmatter W.J. et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families // Science. -1993. - Vol. 5123. - P. 921-923.
8. Hough C.D., Sherman-Baust C.A., Pizer E.S. et al. Advances in brief large-scale serial analysis of gene expression reveals genes differentially expressed in ovarian cancer // Gynecologic oncology. - 2000. - Vol. 60. - P. 6281- 6287.
9. Huvila J., Brandt A., Rojas C.R. et al. Gene expression profiling of endometrial adenocarcinomas reveals increased apolipoprotein E expression in poorly differentiated tumors // International Journal of Gynecological Cancer. - 2009. - Vol. 19. - P. 1226-1231.
10. Ivanova T.I., Krikunova L.I., Ryabchenko N.I. et al. Association of the apolipoprotein E 2 allele with concurrent occurrence of endometrial hyperplasia and endometrial carcinoma // Oxidative Medicine and Cellular Longevity.
- 2015. - Vol. 2015. - P. e 593658.
11. Jofre-Monseny L., Minihane A.-M., Rimbach G. Impact of apoE genotype on oxidative stress, inflammation and disease risk // Molecular Nutrition & Food Research. -2008. - Vol. 52. - P. 131-145.
12. Kondrashova T.V., Neriishi K., Ban S. et al. Frequency of hemochromatosis gene (HFE) mutations in Russian healthy women and patients with estrogen-dependent cancers // Biochimica et Biophysica Acta — Molecular Basis of Disease. - 2006. - Vol. 1762. - P. 59-65.
13. Kuchenbaecker K.B., Ramus S.J., Tyrer J. et al. Identification of six new susceptibility loci for invasive epithelial ovarian cancer // Nat Genet. - 2015. - Vol. 47 - P. 164-171.
14. Kulminski A.M., Arbeev K.G., Culminskaya I. et al. Age, gender, and cancer but not neurodegenerative and cardiovascular diseases strongly modulate systemic effect of the apolipoprotein E4 allele on lifespan // PLos genetics.
- 2014. - Vol. 10. - P. e10041411.
15. Nguyen D., Dhanasekaran P., Nickel M. et al. Molecular basis for the differences in lipid and lipoprotein binding properties of human apolipoproteins E3 and E4 // Biochemistry. - 2010. - Vol. 49. - P. 10881-10889.
16. Porrata-Doria T., Matta J.L., Acevedo S.F. Apolipoprotein E allelic frequency altered in women with early-onset breast cancer // Breast cancer: Basic and clinical Research. - 2010. - Vol. 4. - P. 43-48.
17. Scarbrough P.M., Weber R.P., Iversen E.S. et al. A cross-cancer genetic association analysis of the DNA repair and DNA damage signaling pathways for lung, ovary, prostate, breast and colorectal cancer // Cancer Epidemiol Bio-markers Prev. - 2015. - Vol. 25. - P. 193-200.
18. Slattery M.L., Swenney C., Murtaugh M. et al. Associations between apoE genotype and colon and rectal cancer // Carcinogenesis. - 2005. - Vol. 26. - P. 1422-1429.
19. Surekha D., Vishnupriya S., Sailaja K. et al. Influence of apolipoprotein E gene polymorphism on the risk for breast cancer // International Journal of Human Genetics. - 2008. - Vol. 8. - P. 277-282.
20. Trompet S., Jukema J.W., Katan M.B. et al. Apolipoprotein E genotype, plasma cholesterol, and cancer: a Mendelian randomization study // American Journal of Epidemiology.
- 2009. - Vol. 170. - P. 1415-1421.
21. Uchoa M.F., Moser V.A., Pike C.J. Interactions between inflammation, sex steroids, and Alzheimer's disease risk factors // Frontiers in Neuroendocrinology. 2016. (43). C. 60-82.
22. Watson M.A., Gay L., Stebbings W.S. et al. Apolipoprotein E gene polymorphism and colorectal cancer: gender-specific modulation of risk and prognosis // Clinical science.
- 2003. - Vol. 104. - P. 537-545.
23. Winham S.J., Pirie A., Chen YA. et al. Investigation of exomic variants associated with overall survival in ovarian cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 2016.
- Vol. 25. - P. 446-454.
24. Zhou T.-B. Signaling pathways of prohibitin and its role in diseases // Journal of receptor and signal transduction research. - 2013. - Vol. 33. - P. 73-78.
Поступила в редакцию 27.10.2016 г.
T.I. Ivanova, N.I. Sychenkova, V.A. Khorokhorina, N.I. Ryabchenko, S.A. Ivanov, L.I. Krikunova
The association of the apolipoprotein E4 allele (rs 429358) with ovarian serous adenocarcinoma
Tsyb Medical Radiological Research Centre -branch of the National Medical Research Radiological Centre Obninsk
The distribution of APOE 4 allele (rs 429358, C) was analyzed in healthy women (N=454) and patients with ovarian serous adenocarcinoma (N=114) in order to identify genetic predisposition to the disease. We determined the prognostic indicators of the E4 allele as a marker: odds ratio (OR) and AUC (Area Under Curve) - an area under the ROC curve. It was shown that APOE 4 allele was significantly associated with ovarian serous adenocarcinoma (p = 0,003; OR=1,94; AUC=0,55). The E4 genotypes frequency was significantly increased among patients (p = 0.02; OR=1,8). Separate analysis of the two age subgroups (over 46 years and younger) found that the chance of developing ovarian serous adenocarcinoma was significantly increased for older women (p = 0,006; OR = 2,24, AUC = 0,76). Possible associations of APOE 4 with the ovarian serous adenocarcinoma in women of reproductive age deserve further studying.
Key words: APOE, allele E4, ovarian serous adenocarcinoma
