CC BY
18
УДК 577.1
АСМ-МС ДЛЯ БЕЛКОВОГО АНАЛИЗА ОБРАЗЦОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ
А.Л. Кайшева1, Т.О. Плешакова1, К.А. Мальсагова1, К. Чингин2, Rahman Matiur2, А. Н. Проничев3, В. Г. Никитаев3, Е. О. Иванов3, Л. М. Василяк4, В. С. Зиборов4, Н.Д. Иванова5, А. А. Валуева1,
Ю.Д. Иванов1
Атомно-силовой микроскоп (АСМ) является молекулярным детектором, позволяющим регистрировать отдельные белки и белковые комплексы на поверхности атомарно-ровной подложки - АСМ-чипа. Регистрация целевых белков проводится после процедуры фишин-га - вылавливания белков из объема анализируемого раствора на участок поверхности небольшой площади (сенсорную зону чипа), модифицированный аффинными реагентами против целевого белка. Использование процедуры биоспецифического обогащения позволяет эффективно сконцентрировать молекулы целевых белков в количестве, достаточном для последующего масс-спектрометрического анализа для целей ранней диагностики рака яичников в образцах крови.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, таргетная масс-спектрометрия, детекция белка, рак предстательной железы.
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича", 119121 Россия, Москва, Погодинская, 10/7; e-mail: kaysheva1@gmail.com.
2 East China University of Technology, Nanchang, China, 330013, Nanchang, Jiangxi, 418 Guanglan road.
3 НИЯУ МИФИ, 115409 Россия, Москва, Каширское ш., 31.
4 ОИВТ РАН, 125412 Россия, Москва, ул. Ижорская, д. 13, стр. 2.
5 Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии-МВА имени К. И. Скрябина (ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К. И. Скрябина), 109472 Россия, Москва, ул. Академика Скрябина, 23.
Введение. Опухоли яичников эпителиального происхождения составляют до 90% в структуре злокачественных новообразований яичников. В связи с высокой летальностью, отсутствием эффективных методов ранней диагностики и ограниченными успехами в лечении рака яичников заболевание является одной из основных проблем в онкогинекологии [1]. По данным МНИОИ им. П. А. Герцена, рак яичников занимает восьмое место (5%) в структуре онкологической заболеваемости женщин в России. Высокая летальность среди онкогинекологической патологии яичников большей частью обусловлена диагностированием на поздних стадиях около 60% случаев [1]. Прогноз общей выживаемости и эффективности терапии при ранней диагностике заболевания на стадии IA составляет более 90% [2]. Своевременное лечение рака яичников до сих пор затруднено вследствие плохой развитости методов чувствительной диагностики [2]. Актуальным представляется развитие серологических методов ранней диагностики, молекулярного профилирования и выявление новых кандидатных маркеров онкопато-логии. Наиболее привлекательным для ранней диагностики является метод детекции единичных молекул в биообразцах с использованием комбинации атомно-силовой микроскопии (АСМ) и масс-спектрометрии (МС). АСМ позволяет выполнять в режиме счета регистрацию единичных белковых комплексов, сконцентрированных на поверхности атомарно-ровного чипа посредством биоспецифических взаимодействий (антитело/антиген, аптамер/антиген). В свою очередь МС позволяет однозначно идентифицировать визуализированные комплексы [3].
Целью настоящей работы являлась детекция белковых продуктов трансляции онкогенов - белок Serpin b3, тимидилат-синтаза (TYMS), белок Bcl2, ядерный фактор активации Т-клеток (NFATcl) и транскрипционный фактор GATA6, ассоциированных с развитием рака яичников с использованием комбинации атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии.
Методика. На поверхности АСМ-чипа был сформирован массив сенсорных зон: каждый тип аффинного реагента (всего 16 типов) был иммобилизован в трех сенсорных зонах (рис. 1(а)). Таким образом, сенсорные зоны с различными типами зондов были равномерно распределены по поверхности всего чипа. Формирование сенсорных зон реализовано с помощью роботизированной раскапывательной системы.
Для иммобилизации аффинных агентов на поверхности чипа процедура осуществлялась по методике, описанной в работах [3, 4]. Коротко, поверхность силанизированной слюды активировалась с помощью бифункционального сукцинимидного кросс-линкера. Далее, на активированную поверхность наносились растворы аффинных реагентов и
инкубировались в течение 45 минут. После инкубации поверхность чипов отмывалась деионизованной водой.
Контроль качества поверхности после процедуры иммобилизации аффинных реагентов и после инкубации чипа в анализируемой жидкости (образец плазмы крови) проводился с помощью АСМ Титаниум (НТ-МДТ, Россия). Сканирование осуществлялось в автоматическом режиме - для каждой из сенсорной зон получали 16 фреймов размером 25 мкм2 с шагом сканирования, дающим 256 точек. Использовался кантилевер NSG03(NT-MDT Tips, Россия). Для получения изображения и перевода его в цифровой вид использовано стандартное программное обеспечение NOVA Px (НТ-МДТ, Россия). Для обработки полученных данных - подсчета количества зарегистрированных на поверхности объектов - использовано программное обеспечение одАСМ, разработанное в ИБМХ (Свидетельство о государственной регистрации программы ЭВМ № 2010613458). Статистическая обработка данных, полученных в каждой сенсорной зоне, проводилась в программе Microsoft Excel и включала построение функции плотности распределения по высотам визуализированных объектов p(h):
p(h) = (Nh/N) ■ 100%,
где Nh - число объектов с высотой h, зарегистрированных в эксперименте, N - общее количество зарегистрированных объектов.
Материалом исследования служили 15 образцов плазмы крови больных раком яичников (первичный). АСМ-чип представлял собой аффинный реагент, на поверхности которого были сформированы 48 зон (по три зоны на каждый тип аффинного реагента): 42 рабочих с иммобилизованными моноклональными антителами и аптамерами против 11 целевых белков и две контрольные зоны, на поверхности которой были иммобилизованы аффинные агенты - аптамеры и антитела против белка ПСА (простатоспе-цифичного антигена). Выбор анти-ПСА аптамеров и антител в качестве контрольных обусловлен ожидаемым отсутствием этого белка в образцах сывороток пациентов -женщин, больных раком яичников.
Пробоподготовка АСМ-чипа для МС-анализа включала гидролитическое расщепление белков на поверхности чипа. Для этого на сенсорную зону АСМ-чипа наносили гидролитический буфер объемом 8 мкл, содержащий раствор бикарбоната аммония 150 мМ, ацетонитрил 1%, раствор гуанидин гидрохлорида 0.5 М и глицерол 10% и 1.5 мкл раствора модифицированного трипсина с концентрацией 0.1 мкМ (рН 7.5-8.0). Инкубацию АСМ-чипа проводили в течение 18 часов при постоянной температуре 45 °С. По
завершении инкубации раствор гидролизата отбирали с рабочей зоны чипа, высушивали в вакуумном концентраторе и хранили в условиях глубокого холода (-80 °С) до проведения масс-спектрометрических измерений [3, 4].
Таблица 1
Использованные аффинные пары
Аффинный реагент/целевой белок UniProt- код белка Медицинская значимость, Z-score** Результаты МС-измерений в плазме крови (по данным ИРР*** или РРББ4*)
mAb* / Serpin b3 P29508 Онкологические заболевания, 6 СРМ5* 10-12 М
mAb / GATA 6 Q92908 Онкологические заболевания, 4 СРМ 10-11 М
mAb/TYMS P04818 Онкологические заболевания, 6 СРМ 10-11 М
mAb / Desmoglein 1 Q02413 Синдром Риттера, 6 СРМ 10-10 М
mAb / N-cadherin P19022 Онкологические заболевания, 6 СРМ 10-10 М
mAb/CNDP2 Q96KP4 Онкологические заболевания, 4 СРМ 10-10 М
mAb / Bcl2 Q92934 Онкологические заболевания, 3 РРББ - 8 ■ 10-9 М
mAb / ПСА P07288 Онкологические заболевания, 10 РРББ - 10-8 М
(контроль)
Aptamer / NFATcl O95644 Онкологические заболевания, 4 СРМ 10-10 М
Aptamer / TNFR P25118 Нет данных Нет данных
Aptamer / YES P07947 Онкологические заболевания, 4 СРМ 10-10 М
Aptamer / TCF4 P15884 Нет данных СРМ 10-11 М
Aptamer / GATA6 Q92908 Онкологические заболевания, 4 СРМ 10-11 М
Aptamer / ПСА P07288 Онкологические заболевания, 10 РРББ - 10-8 М
(контроль)
Aptamer / TGIF 1 Q15583 Нет данных СРМ 10-11 М
Aptamer / Rax Q9Y2V3 Нет данных СРМ 10-10 М
mAb* - моноклональное антитело против целевого белка;
Медицинская значимость (Z-score)** - по данным Disease (http://diseases.jensenlab.org/); HPP*** - The Human Proteome Project (https://hupo.org/human-proteome-project); PPDB4* - Plasma Proteome Database (http://www.plasmaproteomedatabase.org/); СРМ5* анализ - (от англ. "selected reaction monitoring") масс-спектрометрический метод направленного мониторинга выбранных реакций.
Масс-спектрометрический мониторинг множественных реакций (СРМ) целевых белков проводили на масс-спектрометре Agilent 6490 (США) в сочетании с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии Infinity 1260/1290 (Agilent, США). Измерения проводили в режиме положительной ионизации. Температура осушающего газа (азот) была 280 °C, расход газа составлял 14 л/мин, напряжение на капилляре - 4000 В, напряжение в фрагментаторе - 380 В. Анализ проводили для 3 триптических пептидов целевого белка и 5 транзиций для каждого пептида. Анализ результатов измерений выполняли с помощью ПО Skyline ver.2.5.0.6079 (https://skyline.ms) [6].
Рис. 1: Оптическое изображения чипа с каплями иммобилизационного раствора на маркированной поверхности маркированного АСМ-чипа (а), примеры АСМ-изображений поверхности сенсорных зон чипа с иммобилизованными антителами против белков CNDP2 (б), serpin Ъ3 (в), и функции плотности распределения по высотам визуализированных объектов р{Н) (г).
Результаты и обсуждение. Конфигурация АСМ-чипа позволяет организовать до 48 сенсорных зон, содержащих различные типы аффинных реагентов - молекулярных
зондов (антитела "mAb" и аптамеры "aptamer"), способных специфически связывать целевые молекулы белка в процессе инкубации (рис. 1(а)).
На рис. 1((б)—(г)) представлены данные сканирования АСМ с целью контроля эффективности иммобилизации антител. Увеличение вклада в правое крыло графика функции p(h) на рис. 1(г) после процедуры иммобилизации свидетельствует о присутствии на поверхности иммобилизованных антител. Так, высота зарегистрированных объектов составляет от 1.2 до 3 нм, и эти объекты были отнесены к антителам, т.к. в контрольной зоне высота зарегистрированных объектов не превышала 1 нм (данные не представлены). Максимум распределения составляет (1.8 ± 0.2) нм, что соответствует высоте иммобилизованных антител класса IgG при сканировании на воздухе [7], к которым относятся используемые в данной работе антитела. Но как видно из рис. 1(г) в одном случае (обозначение p_8), наблюдается слабое увеличение в правом крыле распределения p(h). Обозначения "p_1"... "p_8" соответствуют сенсорным зонам с иммобилизованными антителами различных типов. Поэтому в примере, приведенном на рис. 1(г), эффективная иммобилизация антител наблюдается в случае семи сенсорных зон. На последующих этапах, на стадии иммобилизации, концентрация антител в инкубационном растворе была увеличена для повышение эффективности иммобилизации антитела в сенсорной зоне "p_8".
Результаты АСМ-сканирования поверхности рабочих зон после инкубации в анализируемых растворах показали, что на поверхности сенсорных зон регистрируются комплексы аптамер/белок или антитело/белок во всех случаях анализа, кроме контрольных сенсорных зон. Заключение о присутствии на поверхности комплексов делалось на основе анализа графиков функции p(h), построенной по данным сканирования каждой сенсорной зоны. Высота комплекса выше, чем высота его компонентов [8, 9], поэтому в случае комплексообразования должно наблюдаться увеличение правого крыла функции распределения частиц по высотам p(h), а также сдвиг максимума этой функции. Таким образом, формирование комплексов констатировалось в следующих случаях: увеличение двух показателей максимума распределения (hmax) и ширины на полувысоте (Ahi/2) на 0.2 нм или одного из показателей более чем на 0.2 нм по сравнению с уровнем после иммобилизации аффинных реагентов.
Масс-спектрометрический анализ методом направленного мониторинга выбранных реакций СРМ-МС) гидролитических смывов с поверхности АСМ-чипов позволил выявить в образцах биологического происхождения целевые белки. Были получены результаты, приведённые в таблице 2.
Таблица 2
Результаты АСМ/СРМ-МС анализа гидролитических смывов с АСМ-чипов после инкубации АСМ-чипов в образцах плазмы крови больных раком яичников
Аффинный реагент/ UniProt-код целевого Результаты АСМ/МС анализа
целевой белок белка белков, число образцов
mAb/serpin b3 P29508 5
mAb/GATA 6 Q92908 5
mAb/ TYMS P04818 5
mAb/Desmoglein 1 Q02413 6
mAb/N-cadherin P19022 6
mAb/CNDP2 Q96KP4 6
mAb/ Bcl2 Q92934 -
mAb/ PSA (контроль) P07288 -
aptamer/NFATcl O95644 4
aptamer/TNFR P25118 -
aptamer/YES P07947 6
aptamer/TCF4 P15884 6
aptamer/GATA6 Q92908 -
aptamer/PSA (контроль) P07288 -
aptamer/TGIF 1 Q15583 5
aptamer/Rax Q9Y2V3 6
Таким образом, в ходе выполненного исследования было установлено, что:
- большая часть целевых белков была выявлена посредством АСМ-СРМ анализа,
- не удалось обнаружить две белковые пары для каждого аффинного реагента. В случае использования моноклональных антител не были обнаружены mAb/Bcl2 и mAb/PSA, в случае использования аптамеров - aptamer/GATA6 и aptamer/PSA. Данные целевые пары являются отрицательными контролями для исследуемых биообразцов.
зЗаключение. Основными областями применения подхода АСМ/МС являются фундаментальные и прикладные биомедицинские исследования. Детекция целевых белков на плоских поверхностях АСМ-чипов позволяет решать важные фундаментальные биологические задачи - инвентаризация белкового состава образцов биологического происхождения (проект "Протеом человека", Immune Proteomics Projecta др.),
изучение механизмов физиологических и патологических процессов, биологического разнообразия. С другой стороны, предлагаемое направление применимо для решения прикладных медицинских задач - ранней и высокочувствительной детекции серологических кандидатных маркеров белковой природы, ассоциированных с развитием социально значимых заболеваний, в том числе рака яичников. Предложенный метод масс-спектрометрической детекции белков с использованием мультиплексных АСМ-чипов эффективнее стандартных масс-спектрометрических методов для образцов биологического происхождения. На поверхности АСМ-чипа происходит эффективное концентрирование различных типов белков, обеспечивая многофакторный анализ.
Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 годы.
ЛИТЕРАТУРА
[1] E. K. Crane, J. Brown. Gynecol Oncol. pii: S0090-8258(18)30074-X. (2018); doi: 10.1016/j.ygyno.2018.01.035.
[2] A. L. Kaysheva, A. T. Kopylov, N. E. Kushlinskii, et al., Vopr. ginekol. akus. perinatol., 17(3), 5 (2018); doi: 10.20953/1726-1678-2018-3-5-13.
[3] T. O. Pleshakova, A. L. Kaysheva, I. D. Shumov, et al., Micromachines (Basel), 10(2), 129 (2019); doi:10.3390/mi10020129.
[4] A. L. Kaysheva, Iu. D. Ivanov, V. G. Zgoda, et al., Biomed Khim, 56(1), 26 (2010); PMID: 21328909.
[5] A. L. Kaysheva, Yu. D. Ivanov, P. A. Frantsuzov, et al., J Virol Methods, 229, 86
(2016); doi: 10.1016/j.jviromet.2015.12.012.
[6] T. O. Pleshakova, K. A. Malsagova, A. L. Kaysheva, et al., FEBS Open Bio 7(8), 1186
(2017); doi: 10.1002/2211-5463.12253.
[7] N. H. Thomson, J. Microsc. 217(3), 193 (2005).
[8] Y. F. Dufrêne et al., Nat. Nanotechnol. 12(4), 295 (2017).
[9] T. Pleshakova et al., International journal of molecular sciences 19(4), 1142 (2018).
Поступила в редакцию 26 июня 2019 г.
После доработки 25 июля 2019 г.
Принята к публикации 25 июля 2019 г.
