Апробирование системы детекции целевых групп микроорганизмов для экологического мониторинга пресноводных экосистем

Белькова Наталья Леонидовна; Дзюба Елена Владимировна; Деникина Наталья Николаевна; Кондратистов Юрий Леонидович

УДК 57.08:579.26:574.5

АПРОБИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ ЦЕЛЕВЫХ ГРУПП МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПРЕСНОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ

1 Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск 2 Иркутский государственный университет 3 Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория

Поступила в редакцию 14.05.2012

Актуальность использования молекулярно-генетических методов для проведения экологического мониторинга водных объектов обусловливает необходимость разработки методов количественной оценки состава микробных сообществ. Применение ДНК фага X как внутреннего контроля показало, что для эффективного выделения суммарных нуклеиновых кислот из природных проб необходимо оценивать численность бактериальных клеток и анализировать концентрации, не превышающие 105-106 КОЕ/мл. ПЦР в реальном времени позволила выявить невысокие концентрации энтерококков в поверхностных водах природных пресных водоемов Восточной Сибири в летний период по калибровочным кривым, основанным на концентрациях клеточных суспензий в КОЕ/мл. Детекция спектра таксономических групп и сравнительный анализ их значений СТ характеризуют структуру микробных сообществ и могут быть использованы для мониторинга их состояния и прогноза его изменений.

Ключевые слова: микробные сообщества, пресные водоемы, молекулярно-генетические методы, экологический мониторинг, специфичная амплификация в режиме реального времени

Сложность взаимосвязей в водных микробных сообществах, изменчивость их структуры и ее зависимость от сезонных и физико-химических параметров, растущая антропогенная нагрузка на водоемы, обусловливают необходимость совершенствования системы микробиологического мониторинга пресноводных экосистем [1, 2]. В настоящее время актуальной является задача создания современной методологической основы программы мониторинга, которая позволила бы не только обнаружить в тестируемых объектах патогенных и условно-патогенных бактерий, но и провести комплексную диагностику состояния пресноводных микробных сообществ с целью определения степени потенциальной опасности этой среды для здоровья человека [3, 4].

Известно, что бактерии играют значительную роль в биогеохимических процессах в озерных экосистемах и существенно влияют на кАчество озерных вод, однако доминирующие бактериальные таксоны, активно участвующие в этих превращениях, большей частью остаются не охарактеризованными [5]. Молекулярно-генетические

Белькова Наталья Леонидовна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник. E-mail: nlbelkova@gmail. com

Дзюба Елена Владимировна, кандидат биологических наук, исполняющая обязанности заведующей лабораторией. Email: [email protected]

Деникина Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник. E-mail: denikina@lin. irk. ru

Кондратистов Юрий Леонидович, заведующий отделом. Email: [email protected]

подходы, используемые для исследования бактериальные таксоны, активно участвующие в этих превращениях, большей частью остаются не охарактеризованными [5]. Молекулярно-генетические подходы, используемые для исследования разнообразия и состава бактериальных сообществ пресноводных экосистем, позволяют выявить численно доминирующие микроорганизмы и охарактеризовать их распространение. Ранее нами было показано, что для количественной оценки состава и структуры пресноводных микробных сообществ основными целевыми группами организмов должны быть протеобактерии, планктомицеты, цианобактерии и цитофаги-флавобактерии [6, 7].

Цель работы - апробация системы детекции целевых групп микроорганизмов в составе микробных сообществ различных пресноводных водоемов для их экологического мониторинга.

Материалы и методы. Отбор проб и первичная пробоподготовка. Для апробации системы отбирали пробы поверхностной воды из пресных водоемов Восточной Сибири и глубинную воду (оз. Байкал) в стерильные емкости объемом 5 л (табл. 1). Для проведения молекулярно-генетичес-ких исследований использовали бактериальный материал, сконцентрированный на бактериальном фильтре (диаметр пор 0,22 мкм, объем воды для фильтрации - не менее 1,5 л) и зафиксированный 70% этанолом. Выделение ДНК из чистых культур и бактериального материала, сконцентрированного на фильтре, проводили с помощью коммерческих наборов Bacterial genomic DNA isolation kit

2391

(Аху^еп, США) и ДНК-сорб Б (ФГУН ЦНИИ эпидемио-логии Роспотребнадзора, Москва) по адаптированным ранее методикам [8]. Для проведения количественных оценок использовали: 1) серию десятикратных разведений клеточной суспензии чистых культур (начальные концентрации

клеток составили 3,6*108 КОЕ/мл для Enterococcus sp., 2,3* 108 - для Aeromonas sp. и 3,0*108 - для Pseudomonas putida), 2) ДНК фага X, которую для контроля эффективности выделения ДНК добавляли в концентрациях 2,5, 12,5 или 25 мкг/мл к каждой аликвоте клеточной суспензии.

Таблица 1. Характеристика мест отбора проб и результаты детекции представителей эубактерий (EUB), таксономических групп гаммапротеобактерии (GAM) и цитофаги-флавобактерии (CF), а также количественная оценка Enterococcus sp. (ENT)

Название Место обора (общее количество проб, шт.) EUB* GAM CF ENT (КОЕ/мл) среднее±СО

озеро Байкал, южная котловина, центральная станция

LB-1 25 м (8) 14,48 25,79 32,88 нд**

LB-2 600 м (8) 16,86 24,97 25,69 нд

LB-3 1000 м (8) 18,49 23,00 30,50 нд

LB-4 1200 м (8) 13,67 28,56 28,41 нд

река Ангара, Братское водохранилище

А1 пос. Железнодорожный (3) 13,45 23,11 25,11 0,01±0,005

А2 г. Усолье-Сибирское (3) 12,96 24,06 24,24 0,14±0,035

А3 г. Свирск (3) 12,82 22,17 30,04 0,22±0,061

А4 пос. Балаганск (3) 13,30 24,47 31,61 0,01±0,001

А5 пос. Ключи (3) 15,03 25,06 21,67 2,02±0,085

А6 ст. Подволочная (3) 16,18 24,08 21,99 6,43±0,977

А7 пос. Шумилово (3) 15,15 25,67 24,28 0,23±0,070

А8 ст. Наратай (3) 20,96 28,11 24,18 2,87±1,504

А9 ст. Долоновское расширение (3) 18,13 26,76 34,13 66,29±12,682

А10 плотина БрГЭС (3) 20,94 28,82 30,83 3,56±0,689

пресноводные озе ра Восточных Саян

S1 оз. Изумрудное (12) 15,86 24,97 25,69 0,19±0,029

S2 оз. Малое Черное (8) 12,63 23,00 30,50 0,36±0,071

S3 оз. Большое Черное (12) 11,83 28,56 28,41 0,36±0,013

S4 оз. Перевальное (4) 12,12 25,99 23,38 1,27±0,143

S5 оз. Тухурен-Нур (4) 10,59 20,52 25,66 0,01±0,006

S7 оз. Аршантай-Нур (20) 14,22 24,43 18,43 0,01±0,005

холодные родники на территории национального па] рка «Алханай», Забайкальский край

All Родник 1 (12) 18,30 28,39 24,55 0,08±0,009

Al2 Родник 2 (12) 17,73 25,73 25,54 0,27±0,020

Al3 Родник 3 (12) 20,94 26,31 28,11 0,07±0,006

Al4 Ручей Сухой Убжогое (8) 18,13 25,71 26,76 0,04±0,003

Примечание: * Для детектируемых групп представлены значения СТ; ** не детектированы

Полимеразная цепная реакция. Структуры праймеров, использованных в работе, приведены в таблице 2 [8, 9]. Детекцию целевых групп микроорганизмов вели в режиме реального времени на амплификаторах Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и CFX®-Real Time System C1000 Thermal Cycler (BioRad, США), используя набор iTaqTM SYBR® Green Supermix with ROX (BioRad, США) или TaqMan зонды для специи-фической детекции (табл. 2, Биосан, Новосибирск).

Результаты и обсуждение. При проведении микробиологического мониторинга важна не только детекция отдельных санитарно-показатель-ных групп микроорганизмов, но и количественные оценки отдельных видов бактерий или представителей крупных таксонов. Для корректного анализа в этом случае необходимо введение внутренних контролей и калибровочных стандартов. С этой целью проведен эксперимент по использованию ДНК фага X как внутреннего контроля при выделении суммарных нуклеиновых кислот. Из рис. 1

видно, что эффективность выделения ДНК коммерческим набором с сорбентом выше при невысоких концентрациях бактериального материала. Количественные оценки, проведенные с использованием ПЦР в реальном времени со специфичными зондами для Enterococcus sp. показали, что потери ДНК фага X при использовании клеточ-ных суспензий с концентрациями бактериальных клее-ток от 107 до 108 КОЕ/мл составляют до 70% и существенно ниже при концентрациях от 10 до 105 КОЕ/мл - не более 20%. Аналогичные результаты были получены при неспецифической детекции ампликонов на групп-специфичных праймерах на эубактерии и гаммапротеобактерии, полученных для культур Aeromonas sp. и Pseudomonas putida. Таким образом, для эффективного выделения суммарных нуклеиновых кислот из природных проб необходимо оценивать численность бактериальных клеток и использовать концентрации, не превышающие 105-106 КОЕ/мл.

2392

Таблица 2. Структуры праймеров, использованных в работе

Название праймера Структура 5'-3' Целевая филогенетическая группа

консервативные праймеры

БиБ500Я TTЛCCGCGGCTGCTGGFЛCG эубактерии

БиБ338Ь ЛCTCCTЛCGGGЛGGCЛGCЛG эубактерии

специфичные праймеры

вЛМ395Ь CMATGCCGCGTGTGTGAA гаммапротеобактерии

БиБ29бЬ GЛGЛGGЛЛGGTCCCCCЛC цитофаги-бактероиды

БиБ412Я CGCTЛCTTGGCTGGTTCЛG цитофаги-бактероиды

БС8Т784Ь ЛGЛЛЛTTCCЛЛЛCGЛЛCTTG Е^егососсш'

БМС854Я CЛGTGCTCTЛCCTCCЛTCЛTT Е^егососсш'

lambda11F GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG фаг X

¡ашЪааНЯ TTGЛCЛCCЛGЛCCЛЛCTGGTЛЛTG фаг X

специфичные зонды для ПЦР в реальном времени

БИБ375 CCЛTTGЛCCЛЛTЛTTCCTCЛCTGCTGCCT цитофаги-бактероиды

БИБ975 CCTGGTЛЛGGTTCTTCGCGTTGC цитофаги-бактероиды

ОРЬ813ТО TGGTTCTCTCCGЛЛЛTЛGCTTTЛGGGCTЛ Е^егососсш'

Э О • 3

1 '* о •«

3 9

№ 4 ■ > •

,6*10 3,6* |(|2 3,6* Ю-* 3.6« ПН 3,(1 105 .5,6* об 3,6* 0? 3,6*1

Концентрации клеток КгЧегососсаз в суснсншк

Рис. 1. Определение оптимальной концентрации исходной бактериальной суспензии и фаговой ДНК, используемой в качестве внутреннего контроля. Белые кружки -ДНК фага X 25 мкг/мкл; черные - 12,5 мкг/мкл, серые - 2,5 мкг/мкл

При построении калибровочных кривых необходимо учитывать не только концентрацию выделенной ДНК, но и титр жизнеспособных клеток, который может быть учтен как число колониеобразующих единиц, дающих рост на питательной среде. Поэтому для разработки метода количественных оценок использовали суспензию Enterococcus 8р. с известными концентрациями колониеобразующих единиц. График калибровочной кривой для ЕШегососсш 8р., использованный для количественной оценки энтерококков в природных водах представлен на рис. 2, а результаты анализа в таблице 1. Следует отметить, что в поверхностных водах природных пресных водоемов Восточной Сибири в летний период отмечены невысокие концентрации энтерококков, а в глубинных водах озера Байкал в зимний период они не были детектированы с помощью данной диагностической системы.

Учитывая сложные цепи превращений, осуществляемые микроорганизмами в процессе биологического круговорота вещества, любое нарушение среды их обитания может повлечь за собою разрушение отлаженных закономерностей. Именно поэтому важен контроль за жизнедеятельностью микробных сообществ, и особенно тех представителей, которые могут резко изменить

экологическую или санитарную обстановку в отдельных природных водоемах. К таким группам относят представителей гамма-протеобактерий и цитофагов-флавобактерий.

Рис. 2. График калибровочной кривой для

детекции ЕШегососсш 8р. с помощью специфичного TaqMan зонда. В реакцию использовали следующие концентрации клеток тестируемой культуры 3,6*10б, 3,6* 105, 3,6* 104, 3,6х103 и 3,6х102 КОЕ/мл

В таблице 1 представлены результаты их детекции в сравнении с детекцией представителей эубактерий в разных природных водоемах. В данной работе для сравнения графиков накопления ампликонов использовали пороговый метод, определяли значение СТ, выраженное в циклах ПЦР,

2393

характеризующее каждый график. Сравнивая эти 3. значения, можно судить о начальной концентрации ДНК в исследуемых растворах: чем оно меньше, тем больше анализируемой ДНК в пробе. Следует отметить, что с помощью порогового метода детек- 4. тированы невысокие концентрации гаммапротео-бактерий и цитофагов-флавобактерий относительно значений для эубактерий во всех пресных озерах. Детекция спектра таксономических групп и сравнительный анализ их значений СТ позволяет 5 характеризовать структуру микробных сообществ и ее изменение в зависимости от физико-химических условий водоемов. 6.

Выводы: методы детекции микроорганизмов на основе видо- и групп-специфичной поли-меразной цепной реакции могут быть использованы для характеристики разнообразия и состава природных микробных сообществ, а применение рутинных аналитических процедур позволяет провести количественные оценки с целью мониторинга их состояния и прогноза его изменений. 7

Работа выполнена в рамках ГК № 16.512.11.2130 Министерства образования и науки Российской Федерации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Environmental Microbiology: Current technology and water application. Eds. K. Sen, N.J. Ashbolt. - Norfolk: Caister Academic Press, 2011. 316 p.

2. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 /колл. Авторов // под ред. А.С. Лабинской, Е.Г. Волиной. - М.: Издательство БИНОМ, 2008. 1080 с.

Дзюба, Е.В. Современные подходы и методология экологического мониторинга в условиях водоема и в аквакультуре / Е.В. Дзюба, Н.Л. Белькова, Н.Н. Деникина и др. // Известия Самарского научного центра РАН. 2009. Т. 11, №1(3). С. 466-471. Беликов, С.И. Молекулярная экология как основа современной методологической базы оценки состояния окружающей среды / С.И. Беликов, Н.Н. Деникина, Н.Л. Белькова и др. // Известия Самарского научного центра РАН. 2010. Т. 12, №1(4). С. 11031107.

Newton, R.J. A Guide to the Natural History of Freshwater Lake Bacteria / R.J. Newton, S.E. Jones, A. Eiler et al. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2011. Vol. 75, No. 1. P. 14-49. Белькова, Н.Л. Технологический потенциал унификации молекулярно-генетического анализа структуры и функционального статуса микробных сообществ для мониторинга и биоиндикации / Н.Л. Белькова, Н.Н. Деникина, Е.В. Дзюба, Е.В. Суханова // Всероссийская научная школа для молодежи «Инновации в биологии для развития биоиндуст-рии сельскохозяйственной продукции», 18-25 октября 2010 г. - Владивосток, 2010. С. 77-82. Белькова, Н.Л. Разработка системы праймеров разного уровня специфичности для определения состава и структуры микробных сообществ / Н.Л. Белькова, Е.Б. Матюгина, Н.Н. Деникина // Материалы II международной научно-практичес-кой конференции «Проблемы современной био-логии». - М.: Изд-во «Спутник+», 2011. С. 74-79.

Белькова, Н.Л. Введение в молекулярную экологию микроорганизмов: Учебно-методическое пособие / Н.Л. Белькова, АМ. Андреева. - Ярославль: Изд-во ООО «Принтхаус», 2009. 91 с.

Frahm, E. Application of the fluorogenic probe technique (TaqMan PCR) to the detection of Enterococcus spp. and Escherichia coli in water samples / E. Frahm, U. Obst // J. Microbiol. Methods. 2003. Vol. 52. P. 123- 131.

APPROBATION OF MARKER GROUPS DETECTION SYSTEM OF MICROORGANISMS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING OF FRESH-WATER ECOSYSTEMS

1 Limnological Institutes SB RAS, Irkutsk 2 Irkutsk State University 3 Irkutsk Interregional Veterinary Laboratory

The urgency of use the molecular and genetic methods for carrying out environmental monitoring of water objects causes need of development the methods of quantitative assessment of microbial communities structure. Application of phage X DNA as internal monitoring showed that for efficient selection of integral nucleic acids from natural tests it is necessary to estimate number of bacteriemic cells and to analyze the concentration which are not exceeding 10-10" CFU/ml. PCR in real time allowed to reveal low concentration of enterococci in the surface water of natural fresh reservoirs at Eastern Siberia during the summer period according to the calibration curves based on concentration of cellular suspensions in CFUh/ml. Detection a range of taxonomic groups and comparative analysis of their CT values characterize structure of microbial communities and can be used for monitoring of their condition and forecast of its changes.

Key words: microbial communities, fresh reservoirs, molecular and genetic methods, environmental monitoring, specific amplification in real time

Nataliya Belkova, Candidate of Biology, Associate Professor, Senior Research Fellow. E-mail: [email protected] Elena Dzyuba, Candidate of Biology, Acting as Chief of the Laboratory. E-mail: e_dzuba@lin. irk. ru Nataliya Denikina, Candidate of Biology, Associate Professor, Senior Research Fellow. E-mail: [email protected] Yuriy Kondratistov, Chief of the Department. E-mail: [email protected]

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2394

APPROBATION OF MARKER GROUPS DETECTION SYSTEM OF MICROORGANISMS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING OF FRESH-WATER ECOSYSTEMS

Текст научной работы на тему «Апробирование системы детекции целевых групп микроорганизмов для экологического мониторинга пресноводных экосистем»