CC BY-ND
23
42
ЗНиСО июнь №С (20/)
АПРОБАЦИЯ НОВЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА ЧДС-28 И ЧДС-37 В ХОДЕ ТАКТИКО-СПЕЦИАЛЬНОГО УЧЕНИЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОМ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОЙ БРИГАДЫ
А.Б. Мазрухо, Д.И. Каминский, Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, К.К. Рожков, И.М. Алутин, О.Г. Булахова, И.А. Фирсова, Ю.М. Пухов, О.С. Бурлакова, Л.М. Веркина, Н.Г. Олейник, О.А. Шалу, М.И. Ежова, Н.В. Дроботковская, А.В. Тришина, Е.В. Гончаренко, В.В. Евдокимова, О.А. Татаренко, А.Л. Трухачев, С.О. Водопьянов, Р.В. Писанов, О.В. Дуванова, В.П. Зюзина, Н.Л. Пичурина
APPROBATION OF NEW NUTRIENT MEDIA FOR CULTIVATION AND SEGREGATION OF PLAGUE MICROBE ЧДС-28 И ЧДС-37 I N THE COURSE OF SPECIAL TACTICAL TRAINING EXERCISES OF SPECIALIZED EPIDEMIOLOGICAL GROUP
А.B. Mazrukho, D.I. Kaminskiy, Yu.М. Lomov, N.R. Telesmanich, К.К. Rozhkov, ГМ. Alutin, О.G. Bukhalova, ЬА. Firsova, Yu.М. Pukhov, О.S. Burlakova, L.М. Verkina, N.G. Oleynik, О.А. Shalu, М.I. Ezhova, N.V. Drobotkovskaya, AV. Trishina, ЕУ. Goncharenko, V.V. Evdokimova, О.А. Tatarenko, AL. Trukhachev, S..О. Vodop'yanov, R.V. Pisanov, ОУ. Duvanova, V.P. Zyuzina, N.L. Pichurina
ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»
Роспотребнадзора
Впервые в ходе проведенного ТСУ наряду с традиционными питательными средами для выделения чумного микроба, применяемыми при специфической индикации ПБА, были использованы разработанные в институте среды ЧДС-28 и ЧДС-37, которые характеризуются высоким уровнем продукции капсульно-го антигена. В перспективе разработанные среды могут быть предложены для включения в схему специфической индикации ПБА и рекомендованы как элемент мобилизационной составляющей резерва питательных сред СПЭБ.
For the first time in the course of the special tactical training exercises along with traditional nutrient media for segregation of plague microbe applicable for specific indication of pathogenic biological agents, media ЧДС-28 and ЧДС-37 elaborated in the institute were used; they are characterized by the high level of production of capsular antigen. Over the long term the elaborated media may be suggested for the incorporation into the scheme of PBA specific indication and recommended as an element of mobilizable component of the nutrient media reserve of specialized epidemiological groups.
В целях реализации распоряжения Правительства Российской Федерации от21.05.2007 г. № 642-р и приказа Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребите-
лей и благополучия человека от 20.07.2007 г № 225 «О совершенствовании организации работы специализированных противоэпидемических бригад, сформированных на базе
июнь (20/)
43
ФГУЗ «Научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора» в период с 27 по 31 июля 2009 г. было проведено тактико-специальное учение (ТСУ) специализированной противоэпидемической бригады (СПЭБ) ФГУЗ «Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института» на тему «Развертывание и работа СПЭБ в автономном режиме по проведению специфической индикации патогенных биологических агентов с использованием пневмокаркасных систем» [1].
При подготовке учения специалистами института была разработана оригинальная легенда о применении патогенного биологического агента (ПБА) в качестве оружия массового поражения на территории мегаполиса. После получения донесения об обнаружении осколков взрывного устройства с признаками возможного применения ПБА был введен в действие режим чрезвычайной ситуации, реализованы схемы оповещения и сбора личного состава СПЭБ и осуществлена мобилизация бригады для проведения специфической индикации ПБА.
В проведенном ТСУ приняли участие 47 членов СПЭБ и сотрудников института, было задействовано 7 единиц автотранспорта. В ходе учения были развернуты пневмокаркасные системы (ПКС): индикационная лаборатория, лаборатория особо опасных инфекций и блок поддержки бактериологических исследований, необходимые для проведения специфической индикации ПБА. С помощью штатных внутренних утеплителей провели зонирование развернутых ПКС. В индикационной лаборатории согласно предписаниям «Регламента (стандарта) функционирования СПЭБ» были сформированы следующие отсеки:
— санпропускник из трех помещений;
— отсек приема, регистрации, сортировки проб, подготовки проб к исследованиям;
— отсек выделения ДНК;
— отсек амплификации;
— отсек электрофореза;
— отсек для постановки серологических реакций и люминесцентной микроскопии.
В лаборатории особо опасных инфекций были развернуты:
— санпропускник из трех помещений;
— отсек для приема, регистрации и сортировки заразного материала;
— отсек для проведения первичных посевов;
— термостатный отсек;
— отсек для учета результатов и идентификации;
— отсек для заражения и вскрытия лабораторных животных.
Блок поддержки бактериологических исследований был разделен на:
— санпропускник;
— отсек для приготовления питательных сред и стерилизации лабораторной посуды;
— отсек для деструкции заразного материала.
Были полностью развернуты все рабочие места в указанных лабораториях. Работа СПЭБ осуществлялась в автономном режиме: для энергообеспечения всех ПКС был задействован мобильный трехфазный дизельный генератор «Вепрь» мощностью 25 кВт/ч; водоснабжение обеспечивалось привозной водопроводной водой в трех штатных емкостях по 200 л. На каждом рабочем месте групп специалистов было использовано новейшее табельное оборудование, в т. ч. впервые в ТСУ были апробированы современные мобильные термостаты объемом 90 л с встроенными системами охлаждения, предназначенные для функционирования в условиях жаркого климата.
Наряду с техническими средствами в ходе настоящего учения были проведены испытания новых диагностических препаратов, разработанных специалистами ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» и поэтапно внедряемых в микробиологическую практику, в т. ч. двух питательных сред для культивирования и выделения чумного микроба при 28°С (ЧДС-28) и 37°С (ЧДС-37). Данные среды сконструированы на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей (ПППД), также разработанного в нашем институте и запатентованного по способу его получения (положительное решение о выдаче патента на изобретение от 15.06.2009 г. (заявка № 2008100689/13). Указанный белковый гидролизат готовится из стандартизованного сырья—дрожжей хлебопекарных прессованных (ГОСТ 171-81), гидролиз которого осуществляют соответствующим отраслевому стандарту ферментным препаратом — панкреатином крупного рогатого скота сухим (ОСТ 49167-92). ПППД характеризуется низкой себестоимостью, обеспечивает питательные потребности широкого круга микроорганизмов, может быть использован в качестве универсальной питательной основы сред для культивирования и выделения возбудителей холеры, чумы и дру-
44
ЗНиСО июнь №С (20/)
гих иерсиниозов, сибирской язвы, бруцеллеза, острых кишечных инфекций. Питательные среды ЧДС-28 и ЧДС-37 содержат ПППД в качестве моноосновы.
Проведенные ранее лабораторные испытания вышеуказанных питательных сред с использованием 10 штаммов Yersinia pestis (в т. ч. четырех вакцинных и шести штаммов, отличающихся по вирулентности, из различных природных очагов) показали преимущества разработанных сред перед используемыми в микробиологической практике аналогами по биологическим показателям — чувствительности, показателям прорастания и эффективности, скорости роста, диаметру колоний.
Особый интерес представляет сконструированная питательная среда ЧДС-37, предназначенная для культивирования и выделения Y. pestis при 37°С (температуре тела восприимчивых к чуме теплокровных животных и человека), так как современные чумные им-муноглобулиновые диагностикумы направлены, преимущественно, на выявление капсуль-ного антигена (фракции I) чумного микроба, оптимальной температурой синтеза которого является именно 37 °С. Отсутствие доступ -ных питательных сред для этой температуры культивирования ограничивает применение ускоренных и экспрессных методов в схеме специфической индикации ПБА — метода флюоресцирующих антител (МФА), реакции агломерации объемной (РАО), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Результаты ранее проведенных исследований свидетельствуют, что уже через 48 ч культивирования штаммов Y. pestis на среде ЧДС-37 формировались колонии чумного микроба диаметром 0,5—0,7 мм, которые можно было исследовать люминесцентно-серологическим методом, в то время как на других средах для данной температуры (ДК-37, ДХ-37, СО) видимый рост культуры регистрировался только через 72 ч. Было также установлено, что культуры Y.pestis, выращенные на разработанной среде ЧДС-37, отличались более высокими титрами капсульного антигена (фракции I) в серологических тестах (РАО, РНГА) по сравнению с культурами, полученными на вышеуказанных контрольных средах. Среда ЧДС-37 была запатентована как составляющая способа определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций.
Согласно ранее полученным результатам лабораторных исследований, вторая скон-
струированная на основе ПППД питательная среда ЧДС-28, предназначенная для культивирования и выделения чумного микроба при 28°С, превосходит традиционно используемый в схеме специфической индикации ПБА агар Хоттингера не только по ряду биологических показателей (скорости роста, диаметру колоний, выходу биомассы с единицы объема среды), но и по продукции капсульного антигена (фракции I). Так, уже через 24 ч выращивания FraI+ штаммов У.ре8Й8 на этой среде в приготовленных из культур мазках регистрировали типичное специфическое свечение микробных клеток при постановке МФА и положительный результат в РАО и РНГА, в то время как на агаре Хоттингера при 28°С продукция капсульного антигена была ниже порога чувствительности указанных серологических методов.
В ходе проведения настоящего ТСУ, согласно разработанной легенде, на этапе биологической разведки были отобраны три пробы материала, подозрительного на заражение ПБА, в т. ч. проба № 1 (воздух из зоны обнаружения осколков взрывного устройства с признаками возможного применения ПБА), проба № 2 и проба № 3 (мазки из зева людей, находившихся в очаге вероятного биологического заражения). Отобранные пробы № 1 и № 2 были дополнительно искусственно кон-таминированы вакцинным штаммом Уре8Й8 EV 1290 до конечной концентрации чумного микроба 107 и 104 микробных клеток в 1 мл пробы соответственно.
Исследование поступивших проб осуществляли методами специфической индикации и идентификации ПБА, рекомендованными современными практическими руководствами по лабораторной диагностике опасных инфекционных болезней и специфической индикации ПБА [3; 4]. При этом, наряду с традиционными диагностическими препаратами, в ходе учения были использованы разработанный в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском противочумном институте полимерный чумной диагностикум для РАО и видоспецифические в отношении Уре8Й8 праймеры у1ш12&г, 18геу216, предложенные специалистами нашего института для ПЦР-идентификации типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы [5; 6].
Анализ результатов апробации разработанных питательных сред ЧДС-28 и ЧДС-37 в ходе настоящего ТСУ показал, что чумной микроб был обнаружен в пробе № 1 при культивиро-
Ш №6 (20/)
45
вании посевов нативного материала в условиях 28°С как на среде ЧДС-28 в базовом и элективном (с добавлением генцианвиолета) вариантах, так и на контрольном агаре Хоттингера (предварительно отконтролированном и соответствующем требованиям МУ 3.3.2.2124—06) уже через 24 ч [7]. Однако наличие интенсивного специфического свечения в МФА, а также положительные результаты в РАО и РНГА были зарегистрированы при постановке этих реакций только с культурой, изолированной на среде ЧДС-28. Инкубирование посевов нативного материала пробы № 1 в условиях 37 °С позволило выделить культуру У.ре8Й8 на опытной среде ЧДС-37 через 48 ч, а на агаре Хоттингера — только через 72 ч. Положительный результат всех вышеуказанных идентификационных серологических тестов был получен при исследовании культуры, выделенной на среде ЧДС-37, в то время как у изолированной на агаре Хоттингера при 37 °С культуры чумного микроба отмечалось лишь слабое свечение при постановке МФА.
Из пробы № 2, в которой концентрация возбудителя (104 м.к./ мл) была ниже, чем в пробе № 1 (107 м.к./мл), культура чумного микроба была выявлена через 48 ч только на опытных средах ЧДС-28 и ЧДС-37 при соответствующих температурах культивирования. При использовании контрольного агара Хот-тингера возбудитель чумы в пробе № 2 обнаружен не был.
Изолированные на опытных и контрольной средах культуры чумного микроба были идентифицированы методом ПЦР с помощью видоспецифических праймеров у1ш12Юг, 18геу216. Данная пара праймеров, как показали результаты настоящего учения, может быть эффективно использована не только для идентификации выделенных культур, но и для детекции возбудителя чумы в нативном материале.
Выводы. Таким образом, впервые, в ходе проведенного ТСУ наряду с традиционными питательными средами для выделения чумного микроба, применяемыми при специфической индикации ПБА, были использованы разработанные в нашем институте среды ЧДС-28 и ЧДС-37. Об эффективности сконструированных сред свидетельствует выделение с их помощью культуры чумного микроба из обе-
их проб с разной степенью их контаминации вакцинным штаммом Y.pestis EV 1290 при двух температурах культивирования (28 °С и 37 °С), в то время как на контрольном агаре Хоттингера чумной микроб был изолирован только из пробы № 1 (с более высокой концентрацией возбудителя). Культуры, полученные на средах ЧДС-28 и ЧДС-37, отличались высоким уровнем продукции капсульного антигена (фракции I), что подтверждалось положительными результатами постановки серологических реакций МФА, РАО и РНГА. В перспективе разработанные среды могут быть предложены для включения в схему специфической индикации ПБА и рекомендованы как элемент мобилизационной составляющей резерва питательных сред СПЭБ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Сборник нормативно-методических документов по организации работы специализированных противоэпидемических бригад Роспотребнадзора / Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко и чл.-корр. РАМН В.В. Ку-тырева, Саратов: ОАО «Приволжское издательство», 2008. С. 10, 12-14, 79-82.
2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко и чл.-корр. РАМН В.В. Кутырева. М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. С. 27—61.
3. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство / Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. 288с.
4. Motin VL., Georgescu A.M., Elliot J.M. et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate degidrogenase (glpD) //J. Bacteriol. 2002. V. 184. № 4. P. 1019—1027.
5. Трухачев А.Л., Иванова В.С., Арсе-ньева Т.Е. и др. Поиск праймеров на основе хромосомной ДНК Yersinia pestis для наиболее эффективной ПЦР-идентификации типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы //Клинич. лабораторная диагностика. 2008. № 12. С. 49—52.
6. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионел-леза: МУ 3.3.2.2124—06. М., 2006. 26 с.
