CC BY
70
Ишемическая болезнь сердца
21
АПОПТОЗ КАРДИОМИОЦИТОВ В РАЗВИТИИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА У КАРДИОХИРУРГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
А.П. Хлапов, Ю.Ю. Вечерский*, В.М. Шипулин*, Н.В. Рязанцева, Л.Р. Мустафина
ГОУ «ВПО СибГМУ Росздрава» * ГУ «НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН», Томск
Апоптоз кардиомиоцитов является одним из ключевых факторов развития ИБС. Фундаментальные свойства апоптоза - упорядоченность и регулируемость - позволяют рассматривать его регуляторные компоненты в качестве потенциальных «мишеней» в терапии ИБС, а также универсальных маркеров в предикторной диагностике хронической сердечной недостаточности (ХСН). Однако вопрос о начале соответствующей терапии, ее продолжительности и диагностической достоверности ключевых белков-регуляторов апоптоза остается открытым. Исследованы биоптаты миокарда левого желудочка (ЛЖ) 50 пациентов, разделенных по группам на основании величин конечного диастолического объема (КДО). Коронарную перфузию оценивали на основании данных коронаровентрикулографии, выявление апоп-тотических ядер кардиомиоцитов - методом ТиЫЕЦ ключевых белков-регуляторов апоптоза - имму-ногистохимически. Проведенное нами исследование позволяет говорить о максимальной значимости апоптоза кардиомиоцитов на ранних этапах развития дилатационного процесса в ЛЖ. При увеличении КДО роль апоптоза кардиомиоцитов снижается. Полученные результаты свидетельствуют о важной предикторной роли регуляторных элементов апоптотического каскада и максимальной эффективности терапии ИБС и ХСН на ранних этапах их развития.
Ишемическая болезнь сердца - одно из наиболее часто встречающихся заболеваний сердечно-сосудистой системы, и именно эта форма патологии в значительной степени определяет уровень летальности в популяции. По данным Всероссийского института профилактической медицины, показатели летальности при ИБС на сегодняшний день составляют более 800 случаев на 100 тыс. населения у мужчин и около 550 случаев у женщин [3], из которых на долю ХСН приходится более 90% [9].
Современной наукой признается существование двух форм гибели кардиомиоцитов: некроза и апоптоза (программированной клеточной гибели). Во время инфаркта миокарда в основном процессе, определяющем потерю клеточной массы, участвует некроз кардиомиоци-тов, приводящий к возникновению воспалительной реакции, пролиферации сосудистых клеток, макрофагальной инфильтрации, активации фиб-робластов и в конечном итоге формированию рубца. Апоптоз кардиомиоцитов оканчивается образованием апоптотических тел без активации воспалительной реакции и является доминирующей формой гибели в условиях хронической ишемии [8].
В условиях хронической ишемии миокарда имеет место запуск внешнего (рецепторного) и внутреннего (митохондриального) путей апоптоза кардиомиоцитов. Причиной запуска внешнего пути апоптоза служит как повышение содержания проапоптотических лигандов (Fas-L,
ТЫР-а) в плазме крови, так и повышение количества рецепторов к соответствующим факторам на поверхности кардиомиоцитов [6]. В основе внутреннего пути лежат несколько принципиальных механизмов: ацидоз, развивающийся на фоне хронической ишемии, повышение содержания внутриклеточного кальция и активных форм кислорода, повышение активности проапоптотических белков семейства Вс1-2 (Вах, ВтрЗ) и протеинкиназных систем сигнальной трансдукции ^ЫК, р38, протеинкина-за С5) и др. [11].
В отличие от некроза, апоптоз - упорядоченный и регулируемый процесс [10]. Это дает возможность рассматривать его как потенциальную терапевтическую «мишень» при лечении ИБС и универсальный диагностический маркер ХСН, способный патогенетически обосновать и скоординировать терапию, а также определить прогноз заболевания. В этой связи изучение роли ключевых регуляторных элементов апоп-тотического каскада кардиомиоцитов (про- и ан-тиапоптотических представителей митохондри-альных белков семейства Вс1-2) в качестве предикторных маркеров ХСН ишемического ге-неза может иметь большое значение для теоретической науки и практической медицины. Цель настоящего исследования - выявление апоптоза кардиомиоцитов и определение мито-хондриальных белков Вс1-2 и Вах при разных величинах КДО ЛЖ на фоне ишемического поражения миокарда.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были биоптаты миокарда ЛЖ, полученные во время операции коронарного шунтирования у 50 пациентов в возрасте 45-65 лет в условиях фармакохоло-довой кардиоплегии. Критерием включения в настоящее исследование явилось наличие у пациентов ИБС: стенокардии напряжения II-IV ФК с документально подтвержденным атерос-клеротическим поражением коронарных артерий и ХСН I-III ФК. Критериями исключения стали кардиомиопатии неишемического генеза, патологии миокарда, ассоциированные с различными эндокринопатиями (кроме сахарного диабета) и сочетание ИБС с поражением клапанного аппарата различной этиологии.
Коронарную перфузию оценивали на основании данных коронаровентрикулографии путем подсчета коронарного индекса (КИ) [2], который позволяет охарактеризовать степень коронарной окклюзии и значимость окклюзированной артерии в кровоснабжении миокарда.
Для оценки роли апоптоза кардиомиоцитов в развитии ХСН пациенты были разделены на 3 группы в соответствии с величиной КДО. Первую группу составили пациенты с КДО менее 120 мл, вторую - с КДО от 120 до 150 мл, третью - с КДО более150 мл.
У всех пациентов в условиях фармакохо-лодовой кардиоплегии был получен биопсийный материал ЛЖ, который затем фиксировался в 10% забуференном нейтральном формалине.
Экспрессия кардиомиоцитами ключевых белков-регуляторов апоптоза, Bcl-2 и Вах определялась при помощи двухэтапного авидин-биотинового метода с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) на парафиновых срезах с использованием монокло-нальных антител и визуализирующей системы фирмы Dako Cytomation [5]. После проведения депарафинизации и высокотемпературной обработки ткани в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0) в течение 5,5 мин производилось блокирование эндогенной пероксидазы стандартным блокирующим раствором PEROXIDASE BLOCK (3% раствор перекиси водорода) по методике, предложенной фирмой-производителем. После последующей промывки в дистиллированной воде и фосфатном буфере осуществляли инкубацию биоптатов с первичными (специфическими) антителами против Bcl-2 и Вах в течение ночи в холодильнике при температуре +4 °С. На следующий день после промывки в фосфатном буфере образцы миокарда подвергались инкубации со
вторыми (связанными с биотином) антителами (BIOTINYLATED LINK UNIVERSAL) в течение 10 мин при 25 °С по схеме, предложенной фирмой-производителем. Далее производилась инкубация со стрептавидин-биотин-пероксидазным комплексом (STREPTAVIDIN-HRP) в течение 10 мин при 25 °С. Следующим шагом было выявление пероксидазы хрена диаминобензидином по методике фирмы-производителя, для чего использовались соответствующие стандартные растворы (40 мкл DAB+CHROMOGEN и 1000 мкл DAB+SUBSTRATE BUFFER). Проявление реакции контролировалось под микроскопом. Результаты иммуногистохимической реакции оценивались в световом микроскопе как отношение прореагировавших клеток к их общему количеству в 10 полях зрения.
Для выявления апоптоза кардиомиоцитов методом TUNEL был использован стандартный набор MEBSTAIN Apoptosis kit Direct (IMMUNOTECH, Франция) согласно инструкции, предложенной фирмой-производителем. Образцы, фиксированные в течение 24 ч в 10% забуференном нейтральном формалине (рН 7,4), заливались в парафин. После приготовления срезов (толщина 3 мкм) производилась депарафинизация в ксилоле по стандартной методике [1]. Депарафини-зированные образцы обрабатывали протеиназой К в течение 30 мин + 37 °С, затем инкубировались в течение 10 мин при комнатной температуре с TdT-буфером. Следующим шагом было ме-чение FITC-dUTP при + 37 °С в течение 10 мин, промывка ТВ-буфером и дистиллированной водой и анализ в флуоресцентном микроскопе. Результаты реакции оценивались как среднее количество прореагировавших ядер в 10 случайно выбранных участках по 100 мкм2.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ статистического анализа «Statistica» (2002, версия 6.0). Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением для каждой выборки среднего арифметического (М) и среднего квадратичного отклонения (SD). Для всех имеющихся выборок проверяли гипотезу нормальности распределения, используя критерий Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности различий выборок использовали параметрический t-критерий Стью-дента и непараметрический критерий Манна-Уитни. Различие двух сравниваемых величин считали статистически достоверным, если вероятность их тождества оказывалась меньше 5%. Непрерывные величины представляли в виде M±SD.
Ишемическая болезнь сердца
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенное исследование показало достоверное увеличение КИ у пациентов III группы в сравнении с группами I и II (табл.). Иммуно-гистохимическое исследование (табл.) не выявило достоверных различий в частоте экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 ни в одной из клинических групп. Это может отражать одинаковую степень напряженности анти-апоптотической системы при различных величинах КДО.
Частота экспрессии проапоптотического белка Вах в клинической группе I достоверно отличалась от аналогичного показателя во II и III группах (табл.). Преобладание Вах+-клеток в клинической группе с КДО менее 120 мл наводит на мысль о готовности кардиомиоцитов к апоптозу на ранних этапах ишемического ре-моделирования миокарда и ХСН. Группы II и III статистически достоверных отличий не имели.
Исследование экспрессии ключевых белков-регуляторов апоптоза, Вс1-2 и Вах, позволяет косвенно судить об эффективности функционирования митохондрия - опосредованной про- и антиапоптотической системы. Преобладание белка Вс1-2, основного представителя анти-апоптотической системы, над Вах, проапопто-тическим белком, может говорить о более вероятной активации антиапоптотической системы, тогда как при преобладании Вах над Вс1-2 более вероятна активация апоптоза. Таким образом, исследование отношения концентраций Вах и Вс1-2 прогностически значимо. Проведенное нами исследование отношения Вах/Вс1-2 позволило подтвердить статистически достоверное увеличение этого показателя в первой клинической группе. Показатель Вах/Вс1-2 во II и III группах достоверно не отличался.
Повышенная чувствительность кардиомио-цитов к индукции апоптоза, характерная для ранних этапов ремоделирования миокарда и ХСН, подтверждается также результатами
TUNEL-теста. Было показано, что наибольшая встречаемость TUNEL+^дер кардиомиоцитов характерна для I и II клинических групп, достоверных отличий между которыми не наблюдалось (табл.). Однако присутствие TUNEL+-ядер во всех клинических группах может прямо свидетельствовать о значимости апоптоза кардиомиоцитов в развитии ишемического ремоделирования миокарда и ХСН, определяя тяжесть течения заболевания и прогноз.
ОБСУЖДЕНИЕ
Ишемическое повреждение миокарда - универсальный патогенетический механизм, лежащий в основе ИБС. Возникнув однажды, оно запускает сложный каскад метаболических реакций, обуславливающих ишемическое ремоде-лирование миокарда и формирование ХСН [4], в частности апоптоз кардиомиоцитов. Однако существующие на сегодняшний день представления относительно вклада этого процесса в развитие ХСН достаточно противоречивы [6]. На основании полученных нами данных может быть выдвинуто предположение о ключевой роли апоптоза кардиомиоцитов в развитии ишемического ремоделирования миокарда и ХСН. Наибольшая встречаемость TUNEL+^дер наблюдалась при значениях КДО менее 150 мл, тогда как при увеличении КДО частота встречаемости TUNEL+^дер заметно снижалась.
Полученные при проведении TUNEL-теста данные подтверждаются также иммуногистохи-мически. Анализ соотношения Bax/Bcl-2 максимален именно в I клинической группе (КДО менее 120 мл), что отражает готовность кардиомиоцитов к индукции апоптоза. Незначительная представленность белка Bcl-2 во всех клинических группах указывает на слабую напряженность аниапоптотической системы в условиях хронической ишемии. Сдвиг отношения Bax/Bcl-2 при увеличении КДО может объясняться депрессией синтеза проапоптоти-
Коронарный индекс, частота Bcl-2+- и Вах+-кардиомиоцитов и TUNEL+^дер в различных клинических группах
Клиническая группа КИ Bcl-2+-кардиомиоциты Bax+-кардиомиоциты Bax/Bcl-2 TUNEL+^дра
I 3,96±1,13 0,04±0,02 0,53±0,17 13,25±2,31 0,65±0,25
II 5,14±1,62 0,05±0,02 0,24±0,11 4,8±1,64 0,58±0,15
III 9,37±1,84 0,04±0,01 0,21±0,09 5,25±1,30 0,35±0,13
р<0,05
ческого белка Вах, что находит отражение в подавлении апоптоза кардиомиоцитов.
Таким образом, можно предположить следующий сценарий развития драматических событий индукции апоптоза кардиомиоцитов. В условиях хронической ишемии снижается эффективность антиапоптотической системы, в то время как синтез проапоптотического белка Вах увеличивается [4], приводя к запуску эф-фекторных звеньев апоптотической программы. По мере усиления ишемии, сопровождаемой увеличением КИ, происходит прогрессивное подавление синтеза проапоптотического белка Вах, что приводит к подавлению апоптоза. Ведущими компонентами ишемического ремоде-лирования миокарда и ХСН становятся другие факторы, такие как заместительный фиброз, скольжение кардиомиоцитов относительно друг друга и др. [7].
Оценивая роль апоптоза кардиомиоцитов в клинической практике, отметим, что максимальную эффективность лечебных мероприятий, направленных на терапию ишемического ремоделирования миокарда, можно ожидать лишь на ранних стадиях заболевания. На более поздних стадиях антиапоптотическая терапия может оказаться малоэффективной.
выводы
Результаты проведенного нами исследования позволяют утверждать, что готовность кар-диомиоцитов к активации программы апоптоза характерна для ранних этапов ишемического ремоделирования миокарда и ХСН. В последующих стадиях ремоделирования, ассоциированных с ухудшением коронарного кровотока и
усилением кардиосклероза, роль апоптоза кардиомиоцитов в патогенезе ХСН снижена. Полученные данные могут способствовать разработке новых направлений терапии ИБС и ХСН, определения прогноза и профилактики этих заболеваний.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Автандилов Г.Г. Основы патологоанатомичес-кой практики. М.: Медицина, 1994.
2. Белов Ю.В., Вараксин В.А. Постинфарктное ремоделирование левого желудочка сердца. От концепции к хирургическому лечению. М.: ДеНово, 2002. 194 с.
3. Карпов Р.С., Мордвин В.Ф. Диагностика и лечение ишемической болезни сердца у женщин. Томск, 2002. 196 с.
4. Крыжановский Г.Н. Дизрегуляционная патология: рук-во для врачей и биологов. М.: Медицина, 2002.
5. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистоцитохимия: методические рекомендации. СПб.: ВЦЭРМ МЧС России, 2002.
6. Garg S., Narula J., Chandrashekhar Y. // J. Molecular Cellular Cardiology. 2005. V. 38. P. 73-79.
7. Khoynezhad A., Jalali Z., Tortolani A.J. // Ann. Thorac. Surg. 2004. V. 78. P. 1109-1118.
8. Kitsis R.N., Mann D.L. // J. Molecular Cellular Cardiology. 2005. V. 38. P. 1-2.
9. Lip G.Y.H., Gibbs C.R., Beevers D.G. //Aetiology. BMJ. 2000. V. 320. P. 104-107.
10. Logue S.L., Gustafsson A..B, SamaliA, Gottlieb R.A. // J. Molecular Cellular Cardiology. 2005. V. 38. P. 21-33.
11. Regula K.M., Kirshenbaum L.A. // J. Molecular Cellular Cardiology. 2005. V. 38. P. 3-13.
