CC BY
63
УДК 615.322:543.544.123
АНТОЦИАНЫ ЛЕПЕСТКОВ ЦВЕТКОВ CHAMOMIUSMPOMICA И C. MAUEI
A.Н. Чулков
B.И. Дейнека И.А. Навальнева Л.А. Дейнека В.Н. Сорокопудов
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, 308015 г.Белгород, ул.Победы 85
e-mail: [email protected]
Спектрофотометрическим и хроматографическим (с масс-селективным детектированием) методами определены основные компоненты антоциановых комплексов цветков Chaenomelesjaponica и C. maulei. Установлено, что во всех исследованных образцах присутствуют 3-галактозиды и 3-гексозилгалактозиды цианидина и пеларгонидина, причем комплексы различаются относительной активностью флаво-ноид-з'-гидроксилазы (F-з'-Ы), что может служить основанием для разделения исследованных растений по различным видам рода Хеномелес.
Ключевые слова: Chaenomeles japonica, C. maulei, лепестки цветков, антоцианы, ВЭЖХ-МС.
Введение
Хеномелес - новая перспективная плодовая культура [1], принадлежит к роду Chaenomeles Lindl. По разным данным в природе выделяют три (или четыре) вида и несколько гибридных групп, возникших в культуре. В Европе в качестве отдельных видов признаются: хеномелес японский (I, C. japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach.), хеномелес прекрасный (II, C. speciosa (Sweet) Nakai) и хеномелес катаянский (III, C. cathayen-sis (Hemsl.) Schneid.) [1, 2], в отдельный вид по данным китайских ученых выделяется C. thibetica. Различают также четыре гибридных вида: C. х superba (Frahm) Rehder; C. japonica х C. speciosa, группа Superba, C. х clarkiana Weber (C. cathayensis х C. japonica, группа Clarkiana), C. х vilmoriniana Weber (C. cathayensis х C. speciosa, группа Vilmoriniana) и C. х californica Clarke ex Weber [C. cathayensis х (C. х superba), группа Californica]. В советской литературе выделяли четыре вида хеномелеса: I, III, хеномелес Маулея (айва низкая, C. maulei (Mast.) C.K. Schneid), хеномелес китайский (C. sinensis (Thouin) Koehne) [3], хотя в мировой литературе C. maulei отождествляют с С. japonica [4], а C. sinensis рассматривается в настоящее время в иностранной литературе как важный источник лекарственных соединений.
Плоды растений рода Chaenomeles - не только пищевая, но и лечебнопрофилактическая культура. Плоды C. speciosa в традиционной китайской медицине использовали для лечения диспепсии и различных воспалительных процессов, ревматоидного артрита, невралгии тройчатого нерва, заболеваний печени и др, поскольку они содержат компоненты с высоким антиоксидантным действием [5], включая витамин С. Наличие ингибиторов глюкозидазы делает плоды этих растений полезными при лечении диабета II типа [6], а плоды C. sinensis рассматриаются как эффективные источники веществ, обладающих противовирусной активностью [7].
В ботаническом саду Белгородского государственного университета с 2002 года произрастает два вида хеномелеса: C. japonica и C. maulei. Большинство из имеющихся образцов были привезены из Липецка («Липецкая опытно-селекционная станция») и из Латвии («Латвийский ботанический сад»). Все растения ежегодно обильно цветут и плодоносят.
Поскольку ранее было отмечено, что относительно C. japonica и C. maulei существуют разночтения в их видовой идентификации, то представляет интерес использо-
1 Работа выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 гг., государственные контракты № П425 и № П267 «Скрининг морфолого-биологических особенностей растений рода СЬаепошеІев как основа создания адаптивного сортимента».
вание хемосистематики для решения данной проблемы. Эти растения хорошо известны как высоко декоративные благодаря обильному цветению - ветви куста усеяны цветками с шарлахово-красной, оранжевой, малиновой, розовой и белой окраской. По литературным данным антоциановый комплекс цветков C. speciosa представлен необычными дигликозидами (образованными глюкозой и галактозой) [8] пеларгониди-на и цианидина и обычными для плодов растений подсемейства яблоневые 3-галактозидами [9] тех же агликонов со следами 3-глюкозидов пеларгонидина. В работе китайских исследователей [10] в цветках того же вида хеномелеса найдены в основном аналогичные производные цианидина, а доля производных пеларгонидина оказалась минимальной, причем для дигликозидов предполагается присоединение дигликозид-ного радикала в положение 3, и найден еще один минорный компонент - цианидин-3-сукциниларабинозид. При этом исследованные растения по окраске цветков, несмотря на большое преобладание цианидиновых компонент в цветках всех 24 исследованных растений (в системе CIE Lab), были разделены на две группы.
В настоящей работе предполагалось исследовать антоциановый состав окрашенных цветков для выяснения различий между C. japónica и C. maulei.
Объект и методы исследования
Антоцианы экстрагировали из свежих лепестков цветков хеномелеса настаиванием в 0.1 М водном растворе HCl при разминании растительного материала для разрушения клеточных мембран. Полученный экстракт отфильтровывали на бумажном фильтре и очищали твердофазной экстракцией на патронах ДИАПАК С18. Спектры полученных экстрактов записывали в кварцевых кюветах на спектрофотометре СФ-56 и в ячейке детектора хроматографа. Разделение антоцианов экстракта и масс-спектры индивидуальных компонентов снимали с использованием хроматографической системы Agilent Infinity 1200 с диодно-матричным и масс-селективным детектором (MMES, positive, fragm. 200V). Хроматографическая колонка 4.6х250 мм Symmetry® С18; подвижная фаза 10 об.% муравьиной кислоты и 8 об.% ацетонитрила в воде, 1 мл/мин. Хроматограммы записывали при 510 нм.
Результаты и обсуждение
Спектрофотометрические исследования антоциановго комплекса цветков С. japónica и C. maulei показали, что различие в окраске цветков связано не только с различием в уровне накопления антоцианов, см. табл.1, но ив различии в основах (антоциа-нидинах) антоцианов. Для некоторых экстрактов максимум находился в относительно коротковолновом диапазоне - порядка 490 А 500 нм, что характерно для антоцианов, построенных на пеларгонидине. Для других экстрактов наблюдается батохромное смещение максимума абсорбции, рис.1, что характерно для комплексов антоцианов цианидинового ряда (производных цианидина и пеонидина).
Типичная хроматограмма экстракта цветков исследованных растений представлена на рис.2 на фоне хроматограммы экстракта плодов черной смородины, которую мы использовали в качестве стандартного образца [11], содержащего (в порядке элюирования) дельфинидина-3-глюкозид, Dp-3-Glu, дельфинидина-3-рутинозид, Dp-3-Rut, цианидина-3-глюкозид, Cy-3-Glu, и цианидина-3-рутинозид, Cy-3-Rut.
1.0
Рис. 1. Спектры экстрактов цветков Chaenomeles ер. Экстракты цветков растений: C. japonica -1, 2, 5; C. maulei - 3, 4
Рис. 2. Разделение антоцианов цветков хеномелеса:
А - экстракт цветков хеномелеса; Б - экстрактплодов черной смородины;
1 - Cy-3-Hex-Gala; 3 - Cy-3-Gala; 4 - Pg-3-Hex-Gala; 5 - Pg-3-Gala; 2, 6, 7 - не идентифицированные компоненты.
По спектрам компонентов экстракта цветков хеномелеса, записанным в ячейке детектора, можно утверждать, что пики 1, 2, 3 и 7 соответствуют антоцианам цианиди-нового ряда, а два пика 4, 5 и 6 - производные пеларгонидина, рис.3.
Сопоставляя удерживание компонентов экстракта цветков хеномелеса с удерживанием компонентов экстракта аронии, в котором основным компонентом является цианидина-3-галактозид, Cy-3-Gala, а также присутствуют Cy-3-Glu, цианидина-3-арабинозид, Cy-3-Ara, и цианидина-3-ксилозид, Cy-3-Xyl, [9], пик №3 идентифицируется как Cy-3-Gala, при этом ни в одном из экстрактов нет остальных компонентов экстракта плодов аронии.
Пик №3 с наименьшим удерживанием может соответствовать соединению, у которого в положении 3 находится дигликозидный заместитель, Cy-3-diGly. По аналогии можно предположить, что пики 4 и 5 относятся к пеларгонидин-3-дигликозиду Pg-3-diGly и Pg-3-Gala. Такое отнесение полностью подтверждается анализом масс-спектров этих соединений, рис.4.
Моггл. .
300-
250 - / / \ \’2’3’7
200 - / / \ \
150 - / 4,5,6\ \
100 -[ & \ \
50
Рис. 3. Спектры основных пиков на хроматограмме на рис. 2
Рис. 4. Масс-спектры пиков 1,2,4 и 5 на хроматограмме на рис. 2
Действительно, m/Z 611.2 и 595-2 соответствуют гексозилгексозидам цианидина и пеларгонидина, соответственно, а значения 449.1 и 433.1 - Cy-3-Gala и Pg-3-Gala [12]. Наконец, пик №2 имеет m/Z=581.2, что соответствует цианидин-3-дигликозиду, образованному пентозой и гексозой.
С использованием представленной выше идентификации пиков были проанализированы антоциановые комплексы образцов цветков, для которых было замечено большое расхождение в спектрах суммы антоцианов, рис.5 и табл.1. Все образцы разделились на 2 группы. В первой группе (для цветков всех исследованных растений C. japonica) в антоциановом комплексе преобладают производные цианидина, тогда как для растений второй группы (для всех растений С. maulei) очевидно преобладание антоцианов на основе пеларгонидина. Такое различие действительно может служить основанием отнесения С. japonica и C. maulei к различным видам хеномелеса.
Различие между соотношением количеств антоцианов, построенных на различных антоцианидинах определяется активностью флавоноид 3'- или 3',5'-гидроксилаз (F3'H или F3',5'H). При высокой активности F3'H основным антоцианом могут быть или производные цианидина, или производные пеонидина (при высокой активности
еще одного фермента - метилазы). Отсутствие в сумме антоцианов всех исследованных образцов производных дельфинидинового ряда свидетельствует о неактивности (или об отсутствии) Fз',5'H. Относительная активность Fз'H может быть оценена по простому соотношению, в котором число моль производных цианидина относят к числу моль суммы производных цианидина и пеларгонидина; в данной работе эту характеристику рассчитывали по площадям пиков, указанных на хроматограмме 5:
ZStjCy)
A(F3’H) = 100
2 Ct ((Су + Рд)
(l)
где ZSi(Cy) - сумма площадей пиков производных цианидина; ZSi(Cy+Pg) - сумма площадей всех пиков.
Рис. 5. Хроматограммы антоциановых экстрактов лепестков цветков С. maulei (А и Б) и C. japónica (В)
Сопоставление антоциановых комплексов лепестков цетков хеномелеса
Таблица і
Вид Chaenómeles № Гликозиды Активность ферментов
Цианидина пеларгонидина
З-Hex-Gala З-Gala З-Hex-Gala З-Gala A(F3'H),% %Hex
С. japónica 2-l4 44.5 i6.q 26.0 10.З 62.8 72.2
2-0l 25.6 52.q 4.5 1З.9 81.0 З1.1
5-2q 2q.4 4q.8 6.6 11.4 81.5 З7.0
C. maulei 6-8 4.4 7.2 З9.З 46.4 iiq 44.q
6-5 2.7 5.2 З1.5 58.4 8.1 З4.9
6-і 6.7 8.4 З1.1 51.8 15.4 З8.5
Второй показатель, включенный в таблицу, предполагает оценку активности фермента, определяющего гликозилирование галактозидного радикала в положении 3 обоих антоцианов. Этот показатель можно рассчитать по формуле:
S(Cy — 3 — HexGala) + S(Pg — 3 — HexGcila)
A(kex) = 100 (2)
ZCf {Cy+Pg)
Эта активность не обязательно должна зависеть от строения кольца В антоциана, поэтому не удивительно, что она не выявляет различий между С. japónica и C. maulei.
Наконец суммарное содержание антоцианов по спектрофотометрическим данным в пересчете на цианидин-3-глюкозид [14] составило для большинства исследованных образцов 120 А 180 мг на 100 г исходного материала, а для одного из образцов C. japónica (5-29) даже превысило 400 мг. Таким образом, лепестки этого растения можно рассматривать в качестве ценного источника колорантов с сильными антиокси-дантными свойствами.
Заключение
Таким образом, окраска цветков Chaenomelesjapónica и C. maulei. обусловлена накоплением 3- гликозидов цианидина и пеларгонидина, причем в качестве гликозид-ных фрагментов выступают радикалы галактозы и дигексозида. Различие в активности флавоноид з'-гидроксилазы обуславливает накопление в основном цианидиновых производных в случае C. japónica и пеларгонидиновых - в случае С. maulei, что может служить обоснованием отнесения этих растений к различным видам хеномелеса.
Список литературы
1. Rumpunen K. Chaenomeles: Potential New Fruit Crop for Northern Europe / "Trends in new crops and new uses" J. Janick and A. Whipkey (eds.). ASHS Press, Alexandria, VA., 2002. -P. 385-392.
2. Garkava L.P., Rumpunen R., Bartish I.V. Genetic relationships in Chaenomeles (Rosaceae) revealed by isozyme analysis // Scientia Horticulturae. - 2000. - V.85. - P. 21±35
3. Соколова О.В. Род 12. Хеномелес — Chaenomeles Lindl. // Деревья и кустарники СССР. Дикорастущие, культивируемые и перспективные для интродукции / Ред. тома С. Я. Соколов. — М.—Л.: Изд. АН СССР, 1954. — Т. III. Покрытосеменные. Семейства Троходендроновые — Розоцветные. — с. 370—374.
4. Ho-Dzun H., Knupffer H., K. Hammer K. Additional notes to the checklist of Korean cultivated plants // Genet. Resources Crop Evol. - 1997. - V.44. - P. 349-391.
5. Zhang L., Cheng Y.-X., Liu A.-L., Wang H.-D., Ya-Ling Wang Y.-L., Du G.-H. Antioxidant, anti-inflammatory and anti-Influenza properties of components from Chaenomeles speciosa // Molecules. - 2010. - V.15. -P. 8507-8517.
6. Sancheti S., Sancheti S., Seo S.-Y. Chaenomeles Sinensis: A Potent a-and P-Glucosidase Inhibitor // Amer. J. Pharmacol. Toxicol. - 2009. - V.4. - P. 8-11.
7. Sawai R., Kuroda K., Shibata T, Gomyou R., Osawa K., Shimizu K. Anti-influenza virus activity of Chaenomeles sinensis // J. Ethnopharmacol. - 2008. - V.118. - P. 108-112.
8. Timberlake C.F., Bridle P. Anthocyanins in petals of Chaenomeles speciosa // Phytochem. -1971. - V.10. - Р. 2265-2267.
9. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Дейнека Л.А., Ермаков А.М., Сиротин А.А., Староверов В.М. Анализ компонентного состава антоцианов плодов и жирных кислот масел семян некоторых видов семейства Rosaceae методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Растительные ресурсы. - 2005. - Вып.1. - С. 91 -98.
10. Zhang J., Wang L.-s., Gao J.-m., Li S.-b., Xu Y.-j., Li C.-h. Yang R.-z. Identification of Anthocyanins Involving in Petal Coloration in Chaenomeles speciosa cultivars // Acta Horticult. Sinica. - 2011. - V.38. - P. 527-535.
11. Дейнека Л.А., Шапошник Е.И., Гостищев Д.А., Дейнека В.И., Сорокопудов В.Н., Селе-менев В.Ф. ВЭЖХ в контроле антоцианового состава плодов черной смородины // Сорбц. хром. процесс. - 2009. - Т.9, Вып.4. - С. 529-536
12. Giusti M.M., Rodriguez-Saona L.E., Griffin D., Wrolstad R.E. Electrospray and tandem mass spectroscopy as tools for anthocyanins characterization // J. Agric. Food Chem. - 1999. - V.47. -P.4657-4664.
13. Kobayashi H., Suzuki S., Tanzawa F., Takayanagi T. Low Expression of Flavonoid 3',5'-Hydroxylase (F3',5'H) Associated with Cyanidin-based Anthocyanins in Grape Leaf // Am. J. Enol. Vitic. - 2009. - V.60. - P. 362-367.
14. Giusti M.M., Wrolstad R.E. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy / Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001. Ed. John Wiley & Sons, Inc. - F1.2.1-F1.2.13.
ANTHOCYANINS OF PETALS OF mmmimmNm AND C MAUUI FLOWERS
A.N. Chulkov V.I. Deineka I.A. Navalneva L.A. Deineka V.N. Sorokopudov
Belgorod National Research University,
308015 RF Belgorod Pobeda str. 85
e-mail: [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]
Spectrophotometry and HPLC-MS were explored for the determination of main anthocyanins of Chaenomeles japónica and C. maulei petals. It has been established that all samples under investigations were composed of 3-galactosides as well as 3-hexosilgalactosides of cyanidine and pelargonidine. The main anthocyanin composition differences were due to relative activity of flavonoid-3'-hydroxylase being the base for differentiation of the Chaenomeles species.
Key words: Chaenomeles japónica, C. maulei, flowers petals,
anthocyanins, HPLC-MS.
