CC BY
20
ИММУНОЛОГИЯ
УДК 593.161.13:612.017.1:616-006
АНТИТЕЛА К TRYPANOSOMA CRUZI,
СОПРОВОЖДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИЗИРОВАННЫХ ЭПИМАСТИГОТ IN VIVO
В.Д. Калинникова, Ц. Батмонх, Э.Г. Кравцов, Л.П. Карпенко, Л.В. Пахорукова, Т.А. Оглоблина
(кафедра зоологии беспозвоночных биологического факультета МГУ, кафедра микробиологии РУДН; e-mail: [email protected])
Предположение об участии антител (АТ) в противораковом эффекте Trypanosoma cruzi (Роскин, Экземплярская, 1932; Каллиникова и др., 1994) в настоящее время подтвердилось двумя фактами. Во-первых, иммунизация против T. cruzi приводит к онкопротекторному эффекту (Каллиникова и др., 2003, 2005). Во-вторых, T. cruzi имеет обшие антигены (АГ) с клетками мышиной аденокарциномы Эрлиха (Ботмонх и др., 2004; Каллиникова и др., 2005) и способна индуцировать антитела к ним.
Все это сделало актуальным исследование АТ к T. cruzi в процессе испытания in vivo противораковой активности препарата из трипаносомы.
Материал и методика
В качестве противораковых препаратов испытывали лизаты культуральных эпимастиготных форм девяти клонов T. cruzi, принадлежащих различным генотипическим внутривидовым группировкам: P209-1, Gamba^ SP104-1 (группа DTU^), 86/2036, CL-Brener, Y7/2-1 (подгруппа DTU2e), MN (подгруппа DTU2d), MAS1 и Y7/1 (подгруппа DTU2b). Опыты состояли из следующих этапов.
1. Подкожная прививка аденокарциномы Эрлиха беспородным белым мышам опытной и контрольной групп.
2. Введение опытным животным лизатов T. cruzi на 6—20 дни после прививки в виде 12 ежедневных инъекций в дозах 5 и 15 ке (млн клеток) на мышь.
3. Наблюдение за ростом опухолей с 6 до 45—50 дней после прививки, измерения их площади каждые 4—6 дней, выражение разницы между опытом и контролем в виде индекса, равного отношению среднего размера аденокарциномы в контроле к таковому в опыте.
Используя в качестве АГ культуры трипаносо-мы, АТ к T. cruzi определяли методом непрямой иммунофлуоресценции по Кунсу в индивидуальных сыворотках контрольных и опытных мышей на следующих этапах экспериментов.
1. У интактных мышей перед началом опытов.
2. Через 6 дней после прививки аненокарцино-мы, т.е. перед началом введения лизатов опытной группе.
3. Через 6 и 22 дня после окончания такого лечения.
В каждом из девяти экспериментов сыворотки проверяли на наличие АТ к тем клонам Т. сги-21, лизаты которых испытывали в данном опыте. Учитывали частоту выявления АТ (экстенсивность) и их титр.
Экспериментальная часть
В сыворотке 465 интактных мышей, предназначенных для девяти опытов, были обнаружены АТ к Т. сгш1, никак не индуцированные сколько-нибудь целенаправленно. Частота обнаруженных фоновых (спонтанных) АТ колебалась от партии к партии животных, составляя в среднем 14,3 ± 1,7% популяции (рис. 1, а). Невысоким был и их титр — в большинстве случаев 1 : 10, редко 1 : 20—1 : 40.
Уже на первом этапе опытов, через 5—10 дней после прививки аденокарциномы, уровень АТ к Т. сги21 у 344 обследованных мышей возрос до 46% экстенсивности (рис. 1, а) и титра до 1 : 80. Это повышение было результатом собственно имплантации опухоли, очевидным в той группе животных, которые исходно не имели АТ спонтанно. Среди 226 таких мышей 87 (38,5 ± 3,2%) приобрели АТ чисто "опухолевого" происхождения уже через 6—8 дней после прививки, в титрах 1 : 10—1 : 80 (рис. 2, Б). Возникнув быстро, охватив в своем распространении более трети животных, эти АТ далее снижали свой уровень медленно и незначительно, сохраняя 31% экстенсивности к концу опытов.
Не стало неожиданностью, что испытуемые в качестве противоопухолевого препарата лиофилизи-рованные лизаты Т. сг^ оказались иммуногенны-ми, т.е. вызывали у опытных мышей образование АТ к трипаносоме. Содержание иммуногенного компонента и иммуногенность экстрактов Т. ста,
Рис. 1. Антитела к Т. сшг1 на разных этапах эксперимента.
а — общий пул АТ (------в контроле;--у леченых мышей); б, в — АТ к различным клонам Т. сгиг1 (б — в контроле,
в — у леченых мышей); Р—У/7 — клоны Т. сгиг1. I — момент прививки аденокарциномы; _ — период лечения лизатами опытной группы. Абсцисса — дни после прививки опухоли, ордината — процент мышей с АТ к Т. сгиг1
30
50
80 60 40 20
1
I
Б*
1
Б*
р д Эр 86 С1. У МЫ МАБ У7
7/2
5 дней 15 дней 25 дней 35 дней 45 дней
ю 00
40 " 30 ■ 20 ■ 10 ■ 0
8 дней 30 дней 50 дней
8 дней 30 дней 50 дней
80 60 40 20
80 60 40 20
Ш
§
I
I
1
1
д
р д Эр 86 С1. У МЫ МАБ У7
7/2
ЖшЖ.
1Щ1
р д Эр 86 С1. У МЫ МАБ У7
7/2
0Т111
оти2
5 ■ 4 ■
3 2 1
О
2,5 2 1,5 1
0,5 О
5 дней 15 дней 25 дней 35 дней 45 дней
5 дней 15 дней 25 дней 35 дней 45 дней
Рис. 2. Антитела к Т. спш, индуцированные различными факторами.
А—В — последовательное появление АТ, происходящих из трех источников; (процент серо-позитивных мышей); Г—Е — гомология АТ различным клонам Т. спш: Р-У7 — клоны Т. спш,
(% мышей с АТ к указанным клонам); Ж—И — противораковый эффект АТ. Размер опухоли (см2) в контроле (-----) и у леченых мышей (-).
Абсцисса для А—А и Ж—И — дни после прививки опухоли. А, Г, Ж — спонтанные АТ к Т. спш; Б, Д, 3 — АТ, вызванные прививкой опухоли; В, Е, И — АТ, индуцированные лечением лизатами
И
И Г) н ас
О Г)
ас
Ё
п и ч
и §
О
-I
м о о
оо £
К)
использовавшихся в онкотерапии, констатировались в прежних работах Г.И. Роскина и позже (Клюева, 1963), хотя специально не исследовались. Из современной литературы известно, что антигенно-стью обладают тотальный лизат и сырой лизатный экстракт эпимастиготных форм трипаносомы (Mo-retti et al., 1985; Villas Boas, Boretti-Bergter, 1993).
В результате введения лизатов мышам опытной группы общий уровень АТ к T. cruzi повышался еще более — до экстенсивности 60% и титра до 1 : 160 (рис. 1, а). Чисто "лизатное" происхождение прироста можно было обнаружить у тех животных, которые до введения препаратов не имели этих АТ, ни спонтанных, ни индуцированных прививкой аденокарциномы. Среди 46 таких мышей 43,9 ± 7,7% через 6—10 дней после лечения ли-затами имели АТ к T. cruzi в титрах 1 : 12—1 : 160 (рис. 2, В). В дальнейшем до конца экспериментов уровень индуцированных лизатами АТ как по экстенсивности, так и по титру, не только не снижался, но даже несколько возрастал.
Таким образом, in vivo противоопухолевое действие лизатов T. cruzi осуществлялось на фоне значительного пула АТ к трипаносоме. Обнаружено три их индуктора: спонтанное возникновение, прививка аденокарциномы и введение лизатов T. cruzi. Даже в контроле их уровень существен и слагается из двух первых источников: спонтанных и индуцированных прививкой опухоли АТ. В опытной группе к этому добавляются АТ, вызванные введением лизатов. Разница между опытом и контролем становилась особенно заметной через три недели лечения лизатами (25—30 дней после прививки опухоли), когда уровень АТ, привнесенных опухолью, начинал снижаться, а у мышей, получавших лизат, оставался высоким (рис. 1, а).
Обнаруженные АТ к T. cruzi постепенно вступали в процесс взаимодействия организма с опухолью, различались по вызывающим их факторам, уровню, динамике, а также отражали неодинаковые процессы.
Спонтанные АТ имели место уже к моменту прививки опухоли, характеризовались невысоким и достаточно постоянным уровнем (рис. 2, А) как по распространенности среди мышей, так и по титру. Они индуцировались неизвестным фактором, скорее всего общими антигенными детерминантами с кишечной флорой мышей (Galili et al., 1988) и отражали эту общность. Их существование имеет важное методологическое следствие. В испытаниях противоопухолевого эффекта T. cruzi, в которых определенную роль играют АТ к трипаносоме, адекватным контролем следует считать только "чистых", изначально лишенных этих АТ животных.
АТ, возникающие после имплантации опухоли, отличались более значительным охватом популяции мышей, более высоким титром, динамическими изменениями по ходу опытов, базировались на уже
показанной общности антигенов Т. сгш1 и аденокарциномы и потому важны для ее конкретизации.
Привнесенные введением лизатов АТ к Т. сг^ возникали позже других, имели особенно высокий уровень экстенсивности и титра, достигали максимума к концу опытов, индуцировались клоноспе-цифическими антигенами самих паразитов и свидетельствовали о том, что лечение лизатами сопровождалось иммунизацией против Т. сгш1.
Наряду с различиями обнаруженные у мышей АТ к Т. сг^ проявили и общие свойства.
Прежде всего все они были поликлональными, в том смысле, что представляли богатый ассортимент клоново-антигенной специфичности, т.е. положительно реагировали (чаще или реже, в больших или меньших титрах) со всеми девятью использованными клонами Т. сг^1 (рис. 2, Г—Е). Следовательно, если возникновение АТ к Т. сг^ было обусловлено антигенной общностью с кишечной флорой мышей или их аденокарциномой, эта общность касалась многих антигенных детерминант. Это соответствует поликлональному гуморальному ответу на живую трипаносому — индукции большого набора АТ к различным тканям хозяина и даже к каждой из них (Юе^епЬаит, 1999).
Однако частота встречаемости к тем или иным клонам Т. сг^1 была разной.
Среди спонтанных чаще (примерно у 20% мышей) встречались АТ к клонам Р, ¥7/2, МА8, ММ и реже (у 5—10% мышей) к клонам О, 8р, 86, СЬ, ¥7 (рис. 2, Г). Эти различия плохо совпадали с генетическими группами клонов. Клоновые антигенные варианты, которые редко находили себе гомологию в этих не индуцированных целенаправленно АТ (прежде всего 86, СЬ, ¥7), могут рассматриваться как более видоспецифические для Т. сгии.
АГ-специфический репертуар АТ, вызванных прививкой опухоли, имел свои особенности. Среди АТ чисто опухолевого происхождения немногочисленными оставались АТ к клонам 86, СЬ, а также к ¥7/2 (все — подгруппа ОТЦ2е), и господствовали АТ к клонам О и МА8. Это определяло и общий спектр АТ после прививки: редкая гомология к клонам 86 и СЬ и преобладание АТ ко всем клонам гр. БТЦ (Р, О, 8р), а также к ММ и особенно к МА8 (рис. 2, Д).
В то время как клоново-специфический ассортимент АТ опухолевого происхождения несколько отличался от такового спонтанных АТ, он весьма четко воспроизводился в спектре АТ после лечения (рис. 2, Е), хотя они были результатом клоново-на-правленной иммунизации лизатами. Такая иммунизация была наиболее успешной от использования лизатов клонов группы ОТЦ и клона МА8. Менее успешным было введение лизата клона ММ и еще менее эффективной от клонов СЬ и ¥7/2.
В зависимости от гомологии тем или иным клоновым антигенам Т. сг^1 находилась и динами-
ка АТ, вызванных прививкой опухоли или введением лизатов. И зависимость эта была одинаковой для АТ обоих сортов (рис. 1, б, в).
После прививки опухоли в контроле (рис. 1, б) и лечения лизатами в опыте (рис. 1, в) только уровень АТ к клонам подгруппы БТЦ2е (86, СЬ, ¥7/2) изменялся мало, оставался низким и не имел четкой динамики. АТ к другим клонам Т. сги21, быстро достигнув максимума, затем либо так же быстро снижали свой уровень (АТ к клону ММ и клону ¥7), либо сохраняли его высоким достаточно долго (АТ ко всем клонам ДТИ^, особенно после введения лизатов) или на протяжении всего опыта (АТ к клону МА8).
В результате общий пул АТ к Т. сгш1 и в контроле, и в опыте представлял баланс далеко не одинаковых изменений уровня АТ к тем или другим клонам трипаносомы. И на протяжении 45—50 дней эксперимента изменялся не только общий уровень АТ к Т. сги21 (рис. 1, а), но и их клоново-специ-фический ассортимент (рис. 1, б, в). В целом опухолевый рост и в контроле, и у леченных лизата-ми мышей осуществлялся на фоне преобладания АТ к клонам гр. БТО^ (Р, О, 8р) и к клону МА8 п/гр. БТ^ь, что было особенно очевидно к концу опытов и специально в опытной группе.
Как следует из полученных результатов, сходство свойств в наибольшей степени касалось АТ, индуцированных прививкой аденокарциномы и вызванных лизатами Т. сгш1. Среди тех и других преобладала гомология одним и тем же клонам трипа-носомы: Р, О, 8р (гр. БТ^) и МА8 (п/гр. БТи2Ь), а динамика АТ той или иной специфичности имела одинаковый характер. Видимо, на роль общих с раковыми клетками могут претендовать именно эти антигенные варианты, которым наиболее часто гомологичны АТ, вызванные опухолью. Напротив, антигенная общность менее всего касается АГ-ва-риантов п/гр. БТи2е (клоны 86, СЬ и ¥7/2), что косвенно может подтверждать их большую специфичность для вида Т. сги21.
Все обнаруженные АТ к Т. сги21, независимо от инициирующего их фактора, проявили еще одно общее свойство — все они были важны для роста прививной аденокарциномы (рис. 2, Ж—И).
Лизаты Т. сгж1 в испытанных дозах 5 и 15 ке индуцировали одинаковый уровень АТ к трипано-соме, однако их противораковый эффект прямо зависел от дозы содержащегося в лизатах фактора прямого избирательного повреждающего действия на злокачественные клетки. Тем не менее в тех же опытах проявилась и вторая сторона двойственного механизма противоракового эффекта Т. сгж1 — опосредованное влияние АТ на опухолевый рост. И в контроле, и в опыте рост аденокарциномы у мышей в немалой степени зависел от наличия в их крови АТ к трипаносоме.
Несмотря на низкие титры спонтанных АТ, их исходное наличие в момент прививки аденокарциномы приводило к ингибиции опухолевого роста. Опухоли контрольных мышей, имеющих АТ к T. cruzi, были достоверно (р < 0,03) меньше опухолей животных "чистого" контроля, лишенных этих АТ (рис. 2, ж). Разница нарастала постепенно, достигая 1,5 раза к 25—35-м дням после прививки опухоли, и прямо зависела от титра.
Опухолевый рост был подавлен еще более значительно у мышей, которые приобрели АТ к T. cruzi в результате имплантации аденокарцино-мы. На 15—35 день их опухоли были в 2—3 раза меньше, чем у мышей, не ответивших на прививку образованием АТ к трипаносоме (рис. 2, 3).
Примерно в той же степени и в те же сроки рост аденокарциномы был подавлен у мышей, приобретших АТ к T. cruzi в результате лечения лизатами (рис. 2, И). Однако отношение к противораковому эффекту этих АТ, направленных на сам лечебный препарат и, возможно, непосредственно на его активное начало, не могло быть простым, и четкой положительной зависимости ингибиции от титра этих АТ не наблюдалось.
Таким образом, с наличием в крови мышей АТ к T. cruzi связано подавление опухолевого роста. В то время как в их отсутствие рост аденокар-циномы неуклонно прогрессировал, АТ к T. cruzi, происходящие из всех трех обнаруженных источников, задерживали его и временно стабилизировали. Максимальная ингибиция примерно на 35-й день после прививки совпадала с пиком АТ (особенно у леченых мышей) и преобладанием их гомологии к клонам P, G, Sp (гр. DTU1) и MAS (п/гр. DTU2b).
Подтверждая общность антигенов трипаносо-мы с раковыми клетками, конкретизируя ее, обнаруживая антигенность лизированных эпимастигот, другие индукторы АТ к T. cruzi и значительное участие последних в противораковом эффекте этих препаратов in vivo, — результаты настоящей работы создают перспективы онкопрофилактического использования уникальных свойств T. cruzi.
Выводы
1. Противоопухолевое действие лизатов T. cruzi in vivo осуществляется на фоне значительного пула АТ к трипаносоме, имеющих разное происхождение: фоновых, индуцированных прививкой аденокарциномы и самими препаратами.
2. Этот пул представляет богатый ассортимент АТ, гомологичных генетически различным клонам T. cruzi, и в процессе испытания препаратов меняет свой уровень и клоново-специфический репертуар.
3. АТ всех трех источников влияют на противораковый эффект трипаносомы, подавляя опухолевый рост.
4. AT, индуцированные прививкой опухоли и лизатами, проявляют сходство в гомологии клонам
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Батмонх Ц., Кравцов Э.Г., Каллини-кова В.Д., Карпенко Л.П. 2004. Исследование общности антигенов Trypanosoma cruzi и опухоли // Сб. тр. Моск. науч. теор.-практич. конф. монгольских студентов, магистрантов, аспирантов и докторантов, обучающихся в вузах РФ. М. Вып. 1. 15—17.
Каллиникова В.Д., Оглоблина Т.А., Кононенко А.Ф., Лейкина М.И., Соколова Н.М., Погодина Л.С., Матекин П.В. 1994. Противораковые свойства паразитического жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi, Chagas, 1909. 2.
Отдаленные последствия введения мышам T. cruzi для развития саркомы-180 // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 3. 25—34.
Каллиникова В.Д., Кравцов Э.Г., Борисова Е.Н., Оглоблина Т.А., Пахоруко-ва Л.В., Батмонх Ц., Карпенко Л.П., Дали н М . В . 2003. Развитие перевивных опухолей у мышей, иммунизированных против Trypanosoma cruzi // Мат-лы Междунар. конф. и III съезда Паразитол. общ. РАН. Ч. 1. СПб. C. 190.
Каллиникова В.Д., Борисова Е.Н., Кравцов Э.Г., Батмонх Ц., Карпенко Л.П.
Т. cruzi, динамике на протяжении экспериментов и степени подавления опухолевого роста.
К иммунологическим механизмам противоопухолевого феномена Trypanosoma cruzi. 2005 // Вестн. Рос. ун-та Дружбы Народов. № 1 (29). 60—64.
Клюева Н.Г. 1963. Круцин как противораковый антибиотик // Круцин в терапии рака. M. C. 12—18.
Роскин Г., Экземплярская Е. 1932. Про-тозойная инфекция и экспериментальный рак // Журн. микробиол. и иммунол. 9. Вып. 3. 339—349.
Galili U., Mandrell R.E., Hamadah R.M., Shotet S.B., Griffis Y.M. 1988. Interaction between human natural antigalactosyl immunoglobulin G and bacterie of the human flora // Infact. Immunol. 56. 1730—1736.
Kierszenbaum T. 1999. Chagas disease and the autoimmunity hypothesis // Clin. Microbiol. Rev. 12. 210—223.
Moretti E.A., Basso B., Voltero-Cima E. 1985. Exoantigens of Trypanosoma cruzi. 1. Conditions for their detection and immunogenic properties in experimental infactions // J. Protozool. 32. N 1. 150—153.
Villas Boas M.H., B a r r e t o - B e r g t e r E. 1993. Reactivity of Chagas sera with crude and highly pu-rifed glycosphingolipid fractions from Trypfnosoma cruzi epimastigotes as detected by ELISA // Abstr. IX Intern. Congr. Protozool. Berlin. P. 131.
Поступила в редакцию 18.05.06
ANTIBODIES AGAINST TRYPANOSOMA CRUZI ACCOMPANYING
ANTITUMORAL ACTION OF LYSED EPIMASTIGOTES IN VIVO
V.D. Kallinikova, Z. Batmonch, E.G. Kravzov, L.P. Karpenko,
L.V. Pachorukova, T.A. Ogloblina
Three sources of antibodies against T. cruzi have been discovered in mouse blood: 1) spontaneous origin; 2) implantation of adenocarcinoma; 3) injection of lysed epimastigotes forms of trypanosome.
In all these cases they represent the assortment of antibodies to the genetically different clones of T. cruzi. Their presence in mouse blood correlates with the inhibition of tumor growth.
There are significant similarities between antibodies induced by lysed T. cruzi and by tumor implantation one, the main of which is the prevalence of homology to the same clones: G, P, Sp (group DTU1) and MAS (subgroup DTU2b).
