Антитела к кардиолипину в элюатах кожи и мышцы у больных первичным и вторичным антифосфолипидным синдромом Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

АНТИТЕЛА К КАРДИОЛИПИНУ В ЭЛЮАТАХ КОЖИ И МЫШЦЫ У БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНЫМ И ВТОРИЧНЫМ АНТИФОСФОЛИПИДНЫМ СИНДРОМОМ

З.С.А/7екберова. Я.Запек', Т.М. Решетняк, Б. Войцеховска', С.Г. Раденска-Лоповок, В.А.Насонова ГУ Институт ревматологии РАМН, Москва, Институт ревматологии, Варшава1

Резюме

Цель. Определить наличие аКЛ. антител к Рт-ГП 1, фракции комплемента СЗ и С4 и составе иммунных комплексов, в том числе содержащих аКЛ о элюатах кожи и мышц больных СКВ и АФС.

Материал и методы. У 7 больных, 6 из которых - с тромботическими осложнениями (6 жен. и

I муж.), 2 с ПАФС, 3-х с СКВ+ АФС и у 2-х с СКВ, была проведена биопсия кожно-мышеч-пого лоскута. Размеры биоптатов равнялись 1,5 х 0,5 см и 0,5x0,5 см соответственно. Из-за малых размеров биоптатов применение традиционных методов дробления тканей, таких как острая гомогенизация в гомогенаторах с растиркой и последующим процессом замораживания-размораживания, сопровождающегося большой потерей белка, делало невозможным серологический анализ тканей. Использование метода кислых элюатов Т.ЕЛУТеккатр и 1Н.Воос1с в собственной модификации позволило обеспечить минимальные потери тканевого белка и дало возможность серологического исследования тканей.

Результаты. У всех больных в сыворотке крови выявлялись аФЛ: у 3-х lgG-aK.fl и у 5 - сочетание и ^М- аКЛ.В 5 из 7 элюатов выявлялись 1ёС-аКЛ, превышавшие значения 0,109 ед.ОП., в некоторых обнаруживались комплекс комлемента СЗ и С4 и различные белковые продукты, среди которых преобладали иммуноглобулины. Антитела к Р^-ГП I отсутствовали.

Заключение. Впервые показано наличие в тканях больных АФС аКЛ, что представляет особый интерес при изучении морфогенеза местных тканевых нарушений с участием иммунных комплексов, содержащих аКЛ.

Ключеоый слова: антифосфолшшдный синдром, антифосфолипидные антитела, системная красна» волчанка, элюаты биоптатов кожи и мышцы

Наличие антител к фосфолипидам (аФЛ) в крови ассоциируется с определенным клиническим симитомокомн-лексом - антифосфолипидным синдромом (АФС) 11,2,3,41, основными проявлениями которого являются рецидивирующие артериальные и\или венозные тромбозы, акушерская патология, тромбоцитопения [5,6,71. Спектр клинических проявлений, связанных с окклюзией сосудов различной локализации и калибра, довольно широк и во многом зависит от свойств органов или тканей, вовлеченных в процесс окклюзии. Другими признаками АФС являются сетчатое ли-ведо. гемолитическая анемия, патология клапанов сердца, язвы на нижних конечностях, неврологические нарушения, артериальная гипертония.

Предполагается, что важную роль в процессе взаимодействия аФЛ и эндотелиальных клеток (ЭК) играет плазменный белок р2-гликопротеин I (р2-ГП I) [7,8|. В настоящее время получены данные о том, что антитела, присутствующие в сыворотке больных АФС, на самом деле распознают антигенные детерминанты не кардиолнпина, а кон-формационных эпитопов, формирующихся в процессе взаимодействия Р2-ГП I или реже других плазменных белков крови с кардиолнпином. Этот эпитоп может экспрессироваться в молекуле кардиолнпина или, что более вероятно, в молекуле Р2-ГП I [7,9). Часто в тканях больных АФС при гистологическом исследовании имеют место изменения, напоминающие васкулит 110], однако остается не ясным, каким образом аФЛ вызывают нарушения в системе свертывания крови и повреждения тканей различных органов. В этой связи уместно привести гипотезу о механизме развития поражения клапанов сердца при АФС, согласно ко-

Адрсс: 115522 Москва. Каширское ш., 34а ГУ Институт ревматологии РАМИ. Тел.; 114-44-52

торой аФЛ активируют ЭК и тромбоциты 111,12], при этом не исключается возможность иммунокомилексного повреждения эндотелия сосудов и эндокарда 113,141. На основании гистохимических исследований сердечных клапанов, полученных на аутопсии и при операциях протезирования клапанов у больных АФС, L. Ziporen и соавт. |!4| предположили патогенетическое значение аФЛ в повреждении клапанного аппарата сердца, выявив лентообразные (ribbon-like) субэндотелпальные депозиты иммуноглобулинов, содержавших компоненты комплемента и антиидиоти-пические антитела к кардиолипнну (аКЛ). Важно, что подобные иммуноморфологические нарушения в клапанах были обнаружены только при АФС и не выявлялись в нормальных клапанах и при других заболеваниях, ассоциирующихся с поражением клапанного аппарата сердца.

Целью настоящего исследования было определить наличие различных классов аКЛ, антител к р2-ГП1, фракции комплемента СЗ и С4 в составе иммунных комплексов в элюатах биоптатов кожи и мышцы у больных СКВ с/ без АФС и ПАФС, используя разработанный метод элюации, позволяющий оценить состав антител, находящихся в тканях.

Материал и методы

У 7 больных (6 жен. и I муж.): 2-х с первичным АФС (ПАФС), 4-х- с СКВ + АФС и 1-го - с СКВ - была проведена биопсия кожно-мышечного лоскута.

Всем больным в сыворотке крови определяли аКЛ и вол-чаночный антикоагулянт (ВА). Определение аКЛ проводилось иммупоферментным методом (ИФМ) согласно методике, описанной ранее в ГУ Институт ревматологии РАМН |9|. За верхнюю границу нормы была принята концентрация аКЛ, превышавшая среднее значение данного показателя у доноров на 5 стандартных отклонений (SD) (M+5SD), что

составило 23 GPL для IgG-аКЛ и 26 MPL для IgM-aKJI. Клинико-иммунологическая характеристика больных на момент проведения биопсии приведена в табл. 1.

Всего было получено 7 фрагментов кожи и мышечной ткани размером 1,5x0,5 см и 0,5x0,5 см соответственно. Из-за малого размера биоптатов применение традиционных методов дробления тканей, таких как острая гомогенизация в гомогенаторах с растиркой их и с последующим процессом замораживания-размораживания, сопровождающихся большой потерей белка, делает невозможным серологический анализ тканей. Использование метода кислых элюатов T.E.W. Feltkamp и J.H. Boodc |15| в собственной модификации позволило выполнить два важных условия: обеспечить минимальные потери тканевого белка и возможность серологического исследования тканей. Методика исследования элюата представлена на рисунке .

Рисунок

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЮАТОВ ИЗ БИОПТАТОВ КОЖИ И МЫШЦЫ

нейтрализация

Белок в элюате-1 после промывки в PBS составил от 0.1 до 0,5 мг/мл, а в элюате-2 (рН=2,5) - от 0,01 до 0,05 мг/мл, что позволило провести их иммунологическое и серологическое исследование методами ELISA и Western - blotting. Определяли белок методом Lowry О.Н. с соав. (16|, уровни lgG-аКЛ, а также антитела к р2 ГП I ИФМ. Тест-системы фирмы Cogent (Великобритания) в Western - blotting использовали для выявления иммуноглобулинов, определения уровня комплемента и антител к р2 ГП1. ЦИК определяли комбинированным методом, описанным ранее [17]. Уровень аКЛ дан в ед. ОП450 пт или в виде отношения активности к количеству белка в данном элюате в мг , как это принято в энзимологии, что лучше показывает соотношение уровня аКЛ к другим белкам в элюатах тканей (табл. 2).

Уровни lgG-аКЛ и lgG-aHTH-p22-rni в тканях определяли ИФМ. Уровень IgG -аити-р22-ГП1 в крови более 0,184 ед. ОП (М + 5SD) считался позитивным, от 0,147 до 0.184 - сомнительными и - до 0,147 ед.ОП. - отрииателыми Положительными для IgG-аКЛ значениями были выше 0,109 ед.ОП (средний уровень у здоровых лиц, определенный ранее, плюс 4 стандартных отклонения), значения от

0,092 ед. ОП до 0,109 ед.ОП считались сомнительными.

Результаты и обсуждение

Как видно из табл. 2, в 5 из 7 элюатов-1 ИФМ выявлялись IgG-аКЛ, превышавшие значения 0,109 ед ОП. Ни в одном случае в элюатах-2 не были выявлены аКЛ, превышающие значения 0,109 ед ОП. Однако, ед. ОП измерений аКЛ при ИФМ в элюатах-2 имели такие величины, что мы предположили необходимость повышения концентрации белка тканей в 5 - 10 раз (т.е. до его уровня в элюате-1). В связи с отсутствием возможности увеличения исследуемого материала в элюатах-2 для выявления антител ОП была со-

отнесена к весу белка в мг (отношение активости к количеству белка -в столбце табл. 2 -белок по методу Lowry), что позволило уравнять концентрацию аКЛ с белковой концентрацией в обоих элюатах. Такой подход к оценке количества белка в тканях позволил соотнести содержание аКЛ в обоих элюатах, причем в 4-х случаях в элюатах-2 оно оказалось значительным. При этом были получены результаты, свидетельствовавшие о повышении концентрации белка в элютах-2 в 5-10 раз (т.е. до его уровня в элюатах-I). Подобная методика, описанная нами, позволяет придти к заключению о наличии в элюатах IgG -анти-р2-ГП1 кожи и мышцы больных с АФС IgG-аКЛ. При этом не были обнаружены. Количественный анализ состава белка методом Western-blotting в элюатах I выявил лишь следы иммуноглобулинов G и М, а также СЗ и С4 компоненты комплемента.

У всех исследованных нами больных в сыворотке крови выявлялись аФЛ (табл. I): у 3-х - IgG-аКЛ и у 5 - сочетание IgG- и lgM-аКЛ. Тромботические осложнения имели 6 из 7 пациентов при этом 3 ( больные N 4,6,7) из них находились в пероид острого тромбоза (период времени после эпизода тромбоза не превышал I мес.). В элюатах тканей обнаруживались IgG-аКЛ именно у этих трех больных, а также у одной больной (N 5) без клиники тромбоза, но в период обострения СКВ, еще до назначения ей глюкокор-тикоидов. Последняя, кроме клинических проявлений, соответствующих обострению СКВ, имела выраженные иммунологические нарушения, и по-видимому, выявление аКЛ в тканях в данном случае ассоциировалось с активностью СКВ.

Гистологический анализ биоптатов кожи и мышцы показал наличие деструктивного васкулита в 4-х из 7-и образцов (I- с СКВ, 3 СКВ+АФС). Продуктивный иаскулит имел место только у одной больной СКВ (№5). В двух случаях (I- с ПАФС и I -СКВ+АФС) отмечались признаки ва-скулопатин при отсутствии воспалительной инфильтрации в биоптатах тканей. Иммуногистохимическим методом в биитатах тканей как в стенке сосудов, так и дермо-эпидер-мальном стыке были обнаружены IgG, IgM, IgA и СЗ-фракция комплемента.

Отложения иммунных комплексов в дермо-эпидермаль-иом стыке кожи, известное как Lupus band test (LBT). является диагностическим тестом для СКВ. LBT отмечался в нашем исследовании и при ПАФС (больные 2,3), что подтверждает аутоиммунную природу этого синдрома. Этот феномен, вероятно, носит более универсальный характер, чем считали до сих пор. Отрицательный LBT у двух больных СКВ можно объяснить влиянием гормональной терапии, а также минимальной активностью СКВ. Выявление аКЛ в элюатах в различной комбинации с иммуноглобулинами и иммунными комплексами в сосудах биоптатов и позитивный LBT при первичном и вторичном варианте АФС, а также гистологические признаки как васкулита, так и васкулопатии, свидетельствуют об иммунокомплексном характере сосудистых изменений при АФС и о возможной роли аКЛ в патологическом процессе. Следует отметить, что изучение биоптатов кожи и мышцы больных СКВ с/без АФС и ПАФС на наличие в них депозитов различных классов иммуноглобулинов, компонентов комплемента, аКЛ и lgG-aHTH-p2-rni было предпринято в определенной степени по аналогии с СКВ, при которой много лет обсуждается значимость суб-эпидермальных отложений иммуноглобулинов. Еще более важной представляется расшифровка антитсльпого состава иммунных комплексов. Так например, доказано, что депозиты иммунных комплексов не только в дермо-эпидермальном стыке 118], но и в других тканевых структурах, включая почечные клубочки и капилляры, чаше всего содержат иммуноглобулины и компоненты комплемента [19,20]. Сочетание иммуноглобулинов нескольких классов в дермо-эпидермальном стыке кожи встречается чаще у больных активной СКВ и в случаях выраженности органных поражений. В экстрактах почечной ткани больных СКВ обнаруживаются также антитела к одно- и двуспиральной ДНК и к нуклеопрогеину G (20).Известно и то, что тканевое повреждение при волча-ночном нефрите является следствием иммунокомплексного воспаления.

Заключая, можно предположить, что в генезе тканевого повреждения при как СКВ с/без АФС, так и ПАФС уча-

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ ВО ВРЕМЯ ВЗЯТИЯ БИОПСИИ КОЖИ И МЫШЦЫ.

Таблица I

Ф, возраст, (годы) пол Диагноз Клинические признаки СКВ АФ Л-ассоци ированн ые признаки Иммунологические нарушения Иммуногистохимия биоптатов

1 М, 22,Ж СКВ+АФС Полисерозит, лихорадка, «бабочка» СЛ, с-м Рейно, тромбоз артерии стопы АНФ1/32, а-ДНК-53,1§С-аКЛ-78, ВА+ Депозиты 1§С, ^М в стенке сосудов, ЬВТ+

2 Г, 23, М ПАФС Рецидив.тромбозы нижней полой вены, ТЭЛА, трикуспид. порок,легочная гипертензия, дигнт. некрозы РФ 1/40,1§<3 аКЛ-43, ВА+ Депозиты 1§0, Сз в стенке сосудов, ЬВТ+

3 Л, 28, Ж ПАФС ТФ, язвы ног, СЛ, ПНМК ^в-аКЛ-вб, ^М-аКЛ - 46, ВА+ Депозиты ^М, Сз в стенке сосудов, ЬВТ+

4 Ф, 46,Ж СКВ+АФС Артриты, полисерозит, капилляриты, мочевой синдром ТФ, СЛ, с-м Рейно РФ 1/40, АНФ 1/64Н, ЛПРВ, ВА+, 1йО-аКЛ-56 Депозиты в стенке сосудов

5 Р, 20, Ж СКВ Лихорадка, эритема, капилляриты, артриты, полисерозит, . лейкопения, анемия, ТЦП АНФ 1/512, а-ДНК >100, ^С-аКЛ- 120 Депозиты 1§М, Сз в стенке сосудов, ЬВТ+

6 Р, 49,Ж СКВ+АФС Артриты, полисерозит, капилляриты,анемия, лейкопения ТФ, СЛ, с-м Рейно АНФ 1/128, ДО-аКЛ - 200, ^М-аКЛ - 98, ВА+, ЛПРВ Депозиты 1§0, Сз в стенке сосудов

7 В, 45,Ж СКВ+АФС Артриты, нефрит, полисерозит, анемия, ТЦП Рецидив.НМК, ПНМК, СЛ, ТФ, язвы ног, митр, порок, энцефалопатия с когнитивными нарушениями АНФ 1/512, а-ДНК-70,1§С-аКЛ 198, ВА+ Депозиты Сз. ^М в стенке сосудов, ЬВТ+

Примечание: в клинические признаки внесены проявления, имевшиеся на момент проведения биопсии; В иммунологических нарушениях - те показатели, которые были повышенными. Аббревеатура: СП- сетчатое ливело, ТФ- тромбофлебит глубоких вен ног, НМК - нарушение мозгового кровообращения, ПНМК - преходящее нарушение мозгового кровообращения. ЛПРВ -ложноположительная реакция Вассермана

, ТЦП - тромбоиитопення, 1_ВТ - линейные депозиты иммунных комплексов в дермо-эпидермальном стыке биоптата кожи.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ № 4, 2004

Таблица 2

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭЛЮАТОВ ИЗ БИОПТАТОВ КОЖИ И МЫШЦЫ

Диагноз Ткань Белок в мг по методу О.Н. Ьои/гу ОПб50шп Антитела в элюате в ед.ОП \Vestem-blotting в элюате 1

Элюат-Г Элюат-2* 18С- аКЛ АНЦА а-р2-ГП1 Иммуногло- а-р2-ГП1 Комплемент

Элюат-1 Элюат-2 булины Сз и С4

1 СКВ+АФС Кожа + мышца 0,55 0,055 0,125 0,043 (-) (-) -КЗ (-) Следы

2 ПАФС Кожа + мышца 0,44 0,01 0,048 0,019 (-) (-) (-) (-) (-)

3 ПАФС Кожа 0,35 0,01 0,083 0,019 (-) (-) (-) (-) (-)

4 СКВ+АФС Кожа + мышца 0,75 0,095 0,163 0,024 (-) • (-) +в (-) Следы

5 СКВ Кожа + мышца 0,33 0,017 0,17 0,035 (-) (-) (-) (-) (-)

6 СКВ+АФС Кожа 0,505 0,075 0,418 0,034 (-) (-) +в (-) Следы

7 СКВ+АФС Кожа + мышца 0,515 0,07 0,486 0,026 (-) (-) +С (-) Следы

* - средняя величина из 3-х измерений, ОП — оптическая плотность

• - средняя величина из 3-х измерений. ОП - оптическая плотность

(О

—Л

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ № 4, 2004

ствуют не только ранее известные антитела, но и аФЛ. В то же время при ПАФС выявление иммунных комплексов и фракции комплемента подтверждает иммунные механизмы повреждении тканей. Обнаружение аКЛ в элюатах из био-птатоп тканей при АФС является важным этапом изучения местных механизмов повреждения, индуцированного им-

мунными комплексами, содержащими аКЛ. Представляется, что дальнейшие исследования биопсийного материала различных органов послужат основанием для выработки усовершенствованных диагностических и терапевтических методик при АФС.

ЛИТЕРАТУРА

1. Hughes G.R.V. Thrombosis, abortion, cerebral disease and the "lupus anticoagulant”. Brit. Med, J., 1983, 287, 10881089

2. Hughes G.R.V., Harris E.N., Charavi A.E. The anticardi-olipin syndrome. J.Reumatol.,1986, 13, 4S6-4S9

3. Asherson R.A., Rhamashta M.A., Ordi-Ros J. et al. The "primary" antiphosphilipid syndrome: major clinical and serological features. Medicine (Baltimire), I9S9, 68, 366374

4. Alarcon-Segovia D., Deleze М., Oria C.V., Sanchez-Guerrero J, el al. Anliphospholipid antibodies and anliphospholipid syndrome in systemic lupus tryrthemalo-sus. Medicine, 1989, 6S. 353-365

5. Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром: клиническая и иммунологическая характеристика. Клии.мед., 1989, I. 5-13

6. Wilson W.A., Gharavi А.Е., Koike Т., Lockshin M.D., et al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome:report of an international workshop. Arthr. Rheum., 1999. 42. 1309-1311

7. Насоноп Е.Л. Патогенетические механизмы антифос-фолипидного синдрома. В книге ‘‘Антифосфолипидный синдром" М,,Литтера, 2004, 73-109

8. Насонов ЕЛ., Баранов А.А., Шилкина Н.П., Алекберо-ва З.С. Патология сосудов при антифосфолипидном синдроме (клиника, диагностика, лечение). Москва-Я росла иль. 1995, 161

9. Насонов Е.Л., Алекберова З.С., Александрова Л.З., и соавт. Антитела к карлиолипину: метод определения и клиническое значение. Клин.мед., 1987, 11, 100-104

10. Алекберона З.С., Решетняк Т.М., Раденска-Лоповок С.Г., и соавт. Васкулопатия у больных системной красной волчанкой с антифосфалипидным синдромом. Тер.архив, 1995, 5, 41-44

11. Afck A., Shoenfeld Y., Manor R. et al. Increased endothelial cell expression of alpha3betal integrin in cardiac valvu-lopathy in the primary (Hughes) and second aryantiphos-pholipid syndrome. Lupus, 1999, 8, 502-507

12. Cervera R. Recent advances in antiphospholipid antibody-related valvulopathies. J.Autoimmun., 2000, 15, 123-125

13. Amital H., Langevitz P., Levy Y., Afek A. et al. Valvular deposition of anliphospholipid antibodies in the antiphospholipid syndrome: A clue to the origin of the disease. Clin.Exp.Rheumatol., 1999. 17, 99-102

14. Ziporen L., Golberg Arod M. et al. Libnian-Sacks endocarditis in the antiphospholipid syndrome: immunopatho-logic findings inderformed heart valve. Lupus, 1996, 5, 196205

15. Feltkamp T.E.W., Boode J.H.: Elution of autoantibodies from biopsy tissue. J, Clin. Pathol., 1970, 23, 629-631

16. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent, i. Biol. Chem., 1951, 193, 265

17. Zabek J., Radenska S., Reshetniak T. et al. The presence of anti-cardiolipin antibodies in eluates from skin and skin-muscle bioptaics in the group of SLE, primary and secondary antiphospholipid syndrome. Reuniatologia (Pol)., 2000, 38. 8-10

18. Dahl M,V. Usefulness of direct immunofluorescence in patients with lupus erythematosus. Arch, Dermatol,. 1983, 119, 1010-1017

19. KolTer D., Sehur P.H., Kunkel H.G. Immunological studies concerning the nephritis of SLE. J.Exp. Med. ,1967. 126, 607

20. Davis B.M., Gilliam J.N. Prognostic significance of subepidermal immune deposits in uninvolved skin of patients with systemic lupus erythematosus: 10-year longitudinal study. J.Invest.Dermatol., 1984. 83. 242-247

nocrymum 20.08.1H

Abstract

Z.S. Alekberova, Y, Zabek, T.M. Reshetnyak, B. Voycehovska, S.G. Radenska-Lopovok, V.A. Nassonova Anticardiolipine antibodies in skin and muscle eluates of pis with primary and secondary antipliospliolipid syndrome.

Objective. To detect anticardiolipin antibodies (ACA), anti-p2-GPI antibodies, C3 and C4 complement components in immune complexes including those containing ACA in skin and muscle eluates of pts with systemic lupus erythematosus (SLE) and antipliospliolipid syndrome (APS).

Material and methods . In 7 pts (6 female and I male, 2 with primary APS, 3 with SLE+APS and 2 with SLE) skin and muscle biopsies were taken. 6 from 7 pts had thrombotic complications. Eluates were obtained from frozen skin and skeletal muscle biopsies (size was 1,5x0,5 and 0,5x0,5 respectively). Because of small size of biopsies it was not possible to use traditional methods of tissue pounding such as sharp homogenization of tissues in homogenizers with pulverizing and subsequent process of freezing-unfreezing which lead to large protein loss and make impossible serological tissue analysis. Application of acid eluates method by T.E.W. Feltkamp and J,H. Boode of own modification allowed to minimize tissue protein loss and perform serological tissue analysis.

Results. Serum of all 7 pts contained antipliospliolipid antibodies - IgG-ACA in 3, combination of IgG-and IgM-ACA in 5. In 5 from 7 eluates lgG ACA exceeded 0,109 OO units were revealed. They contained C3, C4 and different protein products mostly immunoglobulines. Anii-fl2GPl antiboddie;. were absent.

Conclusion. For the first time presence of ACA in tissues of APS pts was showed which may be of particular interest in studying morphogenesis of local tissue disturbances with participation of immune complexes containing ACA.

Key words: anliphospholipid syndrome, anliphospholipid antibodies, systemic lupus erythematosus, skin and muscles biopsies eluates