CC BY
57
Л. Н. Шилова, И. П. Гонтарь, И. А. Зборовская
АНТИТЕЛА К ФЕРМЕНТАМ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА КАК ОДИН ИЗ ФАКТОРОВ ЭНДОГЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИИ
ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии, РАМН, лаборатория клинической иммунологии, г. Волгоград;
ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»
Ферменты являются биологически активными веществами, играющими важную роль в различных метаболических процессах организма. Высокая каталитическая активность и специфичность действия любого фермента обусловлена уникальной структурой активного центра. Поэтому для проявления функций ферментов, помимо оптимальных условий реакций, первостепенное значение имеет сохранение целостности активного центра и пространственной структуры белковой глобулы, которая обеспечивается взаимодействиями боковых групп полипептидной цепи [1].
В нормальных условиях собственные белки приводят к развитию естественной толерантности, так как основные антигенные детерминанты собственных белков распознаются Т-клетками в отсутствие ко-стимулирующего сигнала, следовательно, не могут вызвать образование антител. В случае изменения конформации белка на его поверхности появляются «скрытые эпитопы», т. е. те антигенные детерминанты, которые не участвовали в процессе выработки иммунологической толерантности, а, значит, распознаются как чужеродные антигены [2]. В литературе имеются данные об обнаружении антител к различным ферментам, в том числе и при ревматических заболеваниях: к супероксиддисмутазе (СОД) у больных РА [3], к пируватдегидрогеназе у больных с синдромом Шегрена [4]. При изучении механизма взаимодействия антител с антигеном, установлено, что в момент связывания возникает конформационная перестройка специфического иммуноглобулина. При этом, например, образовавшаяся структура «антиген-антитело» становится более устойчивой к действию различных денатурирующих агентов, а также и к гидролизу протеолитическими ферментами. Взаимодействие специфического иммуноглобулина с молекулой антигена сопровождается, в свою очередь, изменениями пространственной структуры антигена. Результат этого взаимодействия может быть различным: с одной стороны, это может быть ингибирование ферментативной активности под влиянием специфических антител (например, антитела к стрептолизину О), с другой — наоборот, усиление или сохранение активности [5] и защита активного центра от внешних факторов [6, 7].
Системная склеродермия (ССД) — аутоиммунное заболевание соединительной ткани, основные проявления которого связаны с ишемией и фиброзом органов и тканей, характеризуется полисиндромностью поражения и распространенными вазоспастическими нарушениями по типу синдрома Рейно [8, 9]. В развитии клинических проявлений ССД большая роль принадлежит нарушениям микроциркуляции, приводящим к ишемии и гипоксии органов и тканей. Неизбежным последствием длительной тканевой гипоксии является перестройка метаболизма пуринов по катаболическому
© Л. Н. Шилова, И. П. Гонтарь, И. А. Зборовская, 2011
пути, а концентрация пуриновых метаболитов коррелирует со степенью тяжести ишемии [10], другой причиной нарушения пуринового обмена могут быть аутоантитела к ферментам этой системы. Одним из ведущих ферментов адениловой ветви пуринового метаболизма является аденозиндезаминаза (АДА, ЕС 3.5.4.4), гуаниловой — гуа-ниндезаминаза (ГДА, ЕС 3.5.4.3).
Цель работы — выявление антител к АДА, ГДА в крови больных ССД в зависимости от разных клинических форм патологии и определение возможной роли антител в изменении активности ферментов.
Материалы и методы исследования. Под наблюдением находилось 40 больных с достоверным диагнозом ССД, поставленным на основании критериев АРА [11] и отечественной классификации болезни [8], и 30 практически здоровых лиц — доноров станции переливания крови, в возрасте от 25 до 47 лет, среди которых 17 женщин и 13 мужчин.
Больные с системной склеродермией (клиническая характеристика). Среди обследованных больных ССД было 38 (95%) женщин и 2 (5%) мужчин. Средний возраст больных — 38 ± 3,3 г., продолжительность болезни — 14 ± 2,6 г. Из наблюдавшихся больных 29 (72,5%) имели лимитированную форму болезни, 11 (27,5%) — диффузную.
I степень активности установлена у 15 (37,5%), II — у 24 (60%), III — у 1 (2,5%) больных.
Хроническое течение выявлено у 16 (40%) пациентов, подострое — у 23 (57,5%), острое — у 1 (2,5%). Больные с подострым и острым течением заболевания, II и III степенями активности, в дальнейшем будут рассматриваться в одной группе, вследствие малого количества больных с острым течением и III степенью активности.
I стадия заболевания (начальная) диагностирована у 11 (27,5%) больных, II (генерализованная) — у 25 (62,5%), III (терминальная) — у 4 (10%).
У всех больных (100%) выявлен синдром Рейно разной степени выраженности (по классификации Н. Г. Гусевой, 2005): без трофических расстройств — I степень — у 15 пациентов (37,5%), с различными дигитальными трофическими нарушениями (рубчики, язвочки, некрозы) — II, III, IV степени — у 25 больных (62,5%).
Биохимические методы. Для определения активности АДА в сыворотке крови использовалась методика, основанная на калориметрическом определении аммиака с помощью фенолгипохлоритного реактива [12]. Для определения активности ГДА — методика, основанная на колориметрическом определении свободного аммиака, образующегося при дезаминировании гуанина в ксантин, с использованием цветной реакции Бертелота [13].
Иммунологические методы. В качестве антигена использовались коммерческие препараты АДА и ГДА производства «Sigma», США, с активностью 130 ЕД/мг и концентрацией белка 95,6 мг/мл, 94,5 мг/мл соответственно. Антитела к ГДА, АДА определяли в сыворотке крови больных по разработанной нами методике непрямого иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированных антигенных форм энзимов [14]. Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля. Положительными считались результаты, превышающие 2 стандартных отклонения показателей, полученных при обследовании здоровых лиц.
Изучение влияния антител к АДА, ГДА на их активность проводили в опытах in vitro с растворимой и иммобилизированной формами ферментов. Источником
специфических иммуноглобулинов служили сыворотки больных ССД с заранее высоким титром антител (экстинкция 0,2-0,6 е.о.п.). «Чистые» антитела к АДА и ГДА получали с помощью соответствующего антигенного иммуносорбента. После диализа против забуференного физиологического раствора и последующего концентрирования через полупроницаемую мембрану системы «Sartorius» до первоначального объема сыворотки, антитела использовали в эксперименте по изучению их взаимодействия с ферментом. Количество фермента в иммобилизированной и растворимой формах было сопоставимо. В качестве контроля использовали физиологический раствор и сыворотки доноров. Иммуноглобулины доноров получали методом высаливания сульфатом аммония. После диализа и концентрирования до первоначального объема сыворотки, иммуноглобулины использовали для изучения их влияния на активность энзимов. Иммуноглобулины доноров были взяты в тех же концентрациях по белку, что и специфические антитела.
Все исследования проводились при поступлении и при выписке из стационара после завершения лечения.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программных пакетов «STATISTICA 6.0», «Excel 5.0», «STATGRAPHICS 3.0».
Результаты исследования и их обсуждение. Здоровые лица. При исследовании сывороток здоровых лиц уровень антител к АДА составил 0,05 ± 0,004, к ГДА — 0,04 ± 0,002. Показатели, превышающие эти значения на величину 2 стандартных отклонений, были приняты за верхнюю границу нормы: для АТ к АДА — 0,094, к ГДА — 0,062. Общая активность АДА в группе здоровых лиц составила 8,5 ± 0,2 МЕ, ГДА — 1,16 ± 0,2 нмоль/ мин/мл. Существенных различий уровня антител к энзимам в зависимости от пола, возраста не выявлено.
Больные ССД. При поступлении на стационарное лечение у больных ССД (группа в целом) наблюдалось незначительное снижение активности АДА (8,3 ± 0,4, р > 0,2), причем отмечалась тенденция к более выраженному снижению активности по мере нарастания активности процесса. У больных ССД (группа в целом) антитела к АДА выявлены у 15 больных (37,5%). Активность ГДА в крови больных ССД (группа в целом) достоверно отличалась от здоровых лиц и составила 1,63 ± 0,02 нмоль/мин/мл, причем при минимальной активности практически не отличалась от здоровых и значительно увеличивалась по мере возрастания активности патологического процесса (табл. 1). Антитела к ГДА обнаружены у 14 больных ССД (35%).
В группе больных ССД с разным характером течения болезни нами выявлены достоверно более высокие уровни антител к ферментам по сравнению со здоровыми (р < 0,05), при подостром и остром течении процесса (р < 0,005) по сравнению с хроническим. Активность АДА достоверно снижалась, а ГДА повышалась при подостром течении процесса (р < 0,002). Высокие уровни антител к АДА обнаружены у 5 (31,3%), к ГДА — у 4 (25%) больных с хроническим течением и у 10 (41,7,6%) с подострым.
Как известно, антитела играют двоякую роль: с одной стороны, это белки, нацеленные на удаление фрагментов деградации клеток, биополимеров и не повреждающие свои клетки, т. е. они выполняют функции естественного иммунитета, с другой — могут опосредовать каскад аутоиммунных и аллергических реакций, вызывая развитие тяжелой патологии [15]. В опытах in vitro, проведенных нами для определения патогенетической роли антител к изучаемым ферментам, были выявлены закономерности, представленные в таблице 2.
Таблица 1. Показатели активности АДА, ГДА и содержание антител к ферментам в сыворотке крови здоровых лиц и больных ССД в зависимости от активности процесса
Контингент N Статистические показатели Активность АДА ^E) Ат к АДА (е. о. п.) Активность ГДА (нмоль/мин/мл) Ат к ГДА (е. о. п.)
М 8,5 0,05 1,16 0,04
Здоровые 30 а 1,1 0,022 1,1 0,011
m 0,2 0,004 0,2 0.002
Больные I ст. акт. 15 М а m 10,3*# 1,93 0,5 0,076*# 0,035 0,009 1,3# 0,58 0,15 0,057*# 0,02 0,004
Больные II-III ст. 25 М а m 5,72*# 1,0 0,2 0,176*# 0,05 0,01 1,76*# 0,39 0,078 0,19*# 0,09 0,018
Примечание. Ат — антитела, * — достоверные различия с группой доноров, # — достоверные различия между клиническими группами.
Таблица 2. Сравнительная характеристика активности иммобилизированной и растворимой форм ферментов после взаимодействия с антителами
Форма фермента (исходная активность) Активность фермента после взаимодействия
Фермент с антителами (n = 30) с сывороткой доноров контроль (физ. раствор)
АДА Иммобилизированная (54,3 МЕ) 16,3 ± 2,8* 51,5 ± 3,75 53,2 ± 4,16
^E) Растворимая (56,1 МЕ) 33,7 ± 3,14* 52,3 ± 4,1 53,7 ± 3,97
ГДА (нмоль/мин/ мл) Иммобилизированная (1,2 нмоль/мин/мл) 1,6 ± 0,08* 1,2 ± 0,18 1,16 ± 0,2
Растворимая (1,2 нмоль/мин/мл) 2,04 ± 0,07* 1,3 ± 0,16 1,18 ± 0,2
Примечание. * — достоверные отличия с контролем и донорами.
При проведении исследования активности иммобилизированной формы АДА после взаимодействия с антителами in vitro, нами выявлено снижение активности фермента на 70% по сравнению с исходной, кроме того, получены статистически достоверные различия с контролем (физиологический раствор) и донорами (р < 0,05) (табл. 2). Эти изменения связаны, вероятно, с блокированием активного центра фермента, являющегося одновременно и антигенной детерминантой. При исследовании взаимодействия растворимой формы АДА нами обнаружено снижение активности фермента на 40%, вероятно, это можно объяснить конформационными изменениями структуры молекулы, приводящими к неполному совпадению активного центра фермента и его антигенной детерминанты. Подобные изменения получены ранее для данного энзима при других ревматических патологиях [16]. При проведении исследования активно-
сти иммобилизированной формы ГДА in vitro нами выявлено увеличение активности фермента на 30% по сравнению с контролем (физ. раствор) и донорами (р < 0,05). При исследовании взаимодействия растворимой формы фермента обнаружено повышение активности фермента на 70 % (табл. 2).
По данным литературы удалось выявить широкий набор факторов, определяющих активность и стабильность ферментов, обнаружить функциональные группы, входящие в активные центры энзимов, осуществляющие катализ, изучить данные о химических характеристиках микросреды, различную конформационную подвижность и аллостерический механизм регулирования при взаимодействии фермента со специфическим иммуноглобулином [1]. Увеличение активности фермента в нашей работе можно объяснить, с одной стороны, тем, что антигенные детерминанты и активный центр фермента, вероятно, не совпадают, а в процессе взаимодействия «антиген-антитело» происходят значительные конформационные изменения молекулы энзима, способствующие более полному высвобождению частично скрытых SH-групп, непосредственно участвующих в катализе ГДА [17]. С другой стороны, само взаимодействие «антиген-антитело» может явиться одним из способов генерации абзимов по так называемому антиидиотипическому механизму. В рамках данной теории антигеном, запускающим продукцию первичных антител, является «обычный» фермент. Далее на первичные антитела формируется вторичный иммунный ответ, что приводит к появлению вторичных, так называемых антиидиотипических антител. Такие вторичные антитела по структуре своего антиген-связывающего центра похожи на исходный фермент и, следовательно, могут обладать той же активностью [18]. Учитывая, что активность растворимой формы фермента после взаимодействия с антителами более выражена, чем иммобилизированной, можно предположить, что аллостерический механизм регулирования каталитической активности энзимов имеет большое значение.
Кроме того, нами выявлено, что все больные с высоким содержанием антител к изучаемым ферментам имели высокую степень синдрома Рейно (II-IV). Известно, что синдром Рейно приводит к ишемии и, следовательно, гипоксии тканей [8, 9]. В условиях гипоксии наблюдается накопление пуриновых нуклеозидов и оснований как в клеточном, так и во внеклеточном пространстве, идет избыточное образование гипоксантина и ксантина. В результате этих процессов происходит усиление перокси-дации мембранных структур, апоптоза клеток, что при снижении антиоксидантной защиты, наблюдающейся при системных заболеваниях соединительной ткани [3], способствует развитию различной висцеральной патологии. Помимо этого, апоптоз, приводящий к усилению секвестрации аутоантигенов в апоптотические тельца, будет способствовать срыву толерантности и увеличению выработки аутоантител [19].
Таким образом, в крови больных с системной склеродермией выявляются антитела к АДА, ГДА, продукция которых увеличивается с возрастанием активности процесса, наличием более тяжелых форм течения заболевания и сопровождается снижением активности АДА и увеличением ГДА. Следовательно, одной из возможных причин изменения активности ферментов пуринового метаболизма при ССД, вероятно, могут явиться аутоантитела, выступающие в роли аллостерических регуляторов ферментативной активности. Это еще раз подчеркивает значимость современной концепции регуляторного иммунитета [20]. Выявленные закономерности могут иметь прогностическую и диагностическую значимость.
1. Казанская Н. Ф. Научные основы применения биокатализаторов // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2: Химия. 1988. Т. 29, № 3. С. 255-258.
2. Deshmukh U. S., Gaskin F., Lewis J. E., Kannapell C. C., Fu S. M. Mechanisms of autoantibody diversification to SLE-related autoantigens // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. Vol. 987. P. 91-98.
3. Зборовская И. А. Ревматические болезни и антиоксидантная система. М: Медицина, 2005. 127 с.
4. Юну П., Пеннек И.Л., Ламур А. Синдром Шегрена: некоторые новые факты // Тер. архив. 1992. Т. 64. С. 97-102.
5. Насонов Е.Л., Бекетова Т.В., Баранов А. А. и др. Антинейтрофильные цитоплазматические антитела при системных васкулитах // Клин. мед. 1992. № 11-12. С. 21-27.
6. Jabeen R., Saleemuddin M., Petersen J., Mohammad A. Inactivation and modification of superoxide dismutase by glyoxal: prevention by antibodies // Biochimie. 2007. Vol. 89, N 3. Р. 311-318.
7. Зайчик А. Ш. и соавт. Влияние иммунологических стимуляторов стероидогенеза на активность некоторых окислительных ферментов в надпочечниках и других органах // Вопр. мед. химии. 1986. Т. 32, № 2. С. 54-58.
8. Гусева Н. Г. Системная склеродермия и псевдосклеродермические синдромы. М.: Медицина, 1993. 268 с.
9. Малахов А. Б., Давтян В. Г., Геппе Н. А., Осминина М. К. Системная склеродермия: современные аспекты проблемы // Consilium medicum. 2006. Т. 8, № 2. С. 62-68.
10. Рябов Г. А., Ладыгин С. С., Азизов Ю. М., Пасечник И. Н. Оценка гипоксии по метаболизму пуриновых соединений // Вестн. акад. мед. наук СССР. 1991. № 7. С. 3-7.
11. Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Subcommittee for scleroderma criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee // Arthritis Rheum. 1980. Vol. 23. P. 581-590.
12. Martinek R. G. Micromethod for estimation of serum adenosine deaminase // Clin. Chem. 1963. Vol. 9, N 5. P. 620-625.
13. Caraway W. T. Colometric determination of serum guanase activity // Clin. Chem. 1966, Vol. 12. P. 187-193.
14. Гонтарь И. П. Эмульсионная полимеризация как метод, модифицирующий ферменты с сохранением биологических свойств их наноструктур / И. П. Гонтарь, Г. Ф. Сычева, А. В. Александров, Л. Н. Шилова, Е. С. Симакова, Н. Н. Емельянов, Н. Н. Матасова, Л. А. Маслакова, А. Б. Зборовский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. № 12. С. 715-719.
15. Leo J. Конформационное многообразие как новый механизм перекрестной реактивности аутоантител. Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии / под ред. А. Б. Полетаева, А. Н. Данилова. Материалы 2-й Московской международной конференции 26-28 сентября 2008. М.: Иммункулус, 2008. 246 с.
16. Александров А. В. Клинико-патогенетическое значение исследования аутоантител к ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма у больных ревматоидным артритом: автореф. дис.... д-ра мед. наук. Волгоград, 2009. 59 с.
17. Ito S., Honda H., Shimizu I. Guanase // Nippon. Rinsho. 2004. N 62, Suppl. 11. P. 415-417.
18. Канышкова Т. Антитела-нуклеазы человека в норме и при аутоиммунных патологиях // Наука в Сибири. 1999. № 30.
19. Ahsan H., Ali A., Ali R. Oxygen free radicals and systemic autoimmunity // Clin. Exp. Immunol. 2003. Vol. 131, N 3. P. 398-404.
20. Zaichik A. Sh., Churilov L. P., Utekhin V. J. Autoimmune regulation of genetically determined cell functions in health and disease // Pathophysiology (Elsevier). 2008 (October). Vol. 15, N 3. P. 191-207.
Статья поступила в редакцию 15 июля 2011 г.
