CC BY
132
THE INFLUENCE OF BIONANOSTRUCTURES -LIPOSOMES CONTAINING DRUGS - ON FREE-RADICAL OXIDATION PROCESSES IN BLOOD OF WHITE MICE IN THE CASE OF CARBON TETRACHLORIDE INTOXICATION
ROMANOVA L.V., EFREMENKO V.I.,
KREMNEVA G.M., LITVINENKO I.L.,
EFREMENKO A.A., KILINKAROVA N.N.,
NIKOLENKO T.V.
Acute liver failure (ALF) is caused by influence of he-patotropic poison like carbon tetrachloride (CCl4). The method for forming ALF was the intraperitoneal injection of carbon tetrachloride in dose 0,25 lD50. The experimen-
tal animals were treated intraperitoneally during 6 days by: ascorbic acid, ATP, a-tocopherol, sodium selenite, Essenciale. The other experimental animals were intraperitoneally injected with liposomal drugs once and per os on the 2, 5, 8, 11, 14, 17 days of the ALF. The result was that the CCL4 poisoning of experimental animals increased the activity of lipid peroxidation and prooxidative systems. The treatment with drugs decreased the level of malondi-aldehyde and catalase except the total peroxidase activity. Results showed that the application of liposomal drugs, especially used per os, demonstrated quick corrective effect in the case of ALF.
Key words: carbon tetrachloride, liposomal drugs, free-radical oxidation, acute liver failure
© Коллектив авторов, 2010 УДК 612.826
АНТИСТРЕССОРНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЭПИФИЗАРНОГО ГОРМОНА МЕЛАТОНИНА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ И ВЫРАЖЕННОСТИ СТРЕССА
Э.В. Бейер, А.С. Булгакова, А.А. Скорняков, Э.Б. Арушанян Ставропольская государственная медицинская академия
Небольшая мозговая железа эпифиз является уникальным адаптогенным органом, обеспечивающим приспособление сложно устроенных организмов к меняющимся условиям внешней и внутренней среды. В том числе с помощью своего основного гормона - мелатонина эпифиз обеспечивает защиту от неблагоприятных последствий стрессорного воздействия. Это положение было постулировано и подробно аргументировано нами прежде [1, 3, 4]. В настоящей работе на основе собственного опыта предпринята попытка определить надёжность антистрессорных протек-тивных свойств гормона при использовании его в стандартной и достаточно низкой дозе при стрессе разной выраженности и при оценке различных физиологических показателей.
Материал и методы. Опыты выполнены на белых нелинейных крысах самцах массой 200-250 г, содержавшихся в условиях вивария при фиксированном
Бейер Эдуард Владимирович, доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии СтГМА, тел.: 8(8652) 35-48-81.
Булгакова Александра Сергеевна, соискатель кафедры фармакологии СтГМА, врач МУЗ ДП №2, тел.: 8(8652) 23-47-75.
Скорняков Антон Александрович, соискатель кафедры фармакологии СтГМА, врач ГУЗ СККПЦ, тел.: 8(8652) 32-23-93.
Арушанян Эдуард Бениаминович, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой фармакологии СтГМА, тел.: 8(8652) 35-34-29, e-mail: arushanyan@inbox.ru.
световом режиме (свет-темнота 12:12) и свободном доступе к воде и пище. Для оценки поведения и адаптационных способностей животных использовали несколько методических подходов.
Спонтанную локомоцию и поисковую активность крыс регистрировали методом «открытого поля». Оно представляло собой круглую арену (диаметром 2 м), разделённую на 16 периферических и 8 центральных сегментов. У помещённого в один из периферических сегментов животного в течение 5 минут учитывали число пересеченных сегментов обоего типа и количество вертикальных стоек. Многопараметрическая методика [12] позволяла судить о тревожно-фобическом состоянии крыс. С этой целью в специальной камере им последовательно предъявляли 8 тестов, включая такие как спуск с высоты, прохождение через отверстие, выход из тёмного бокса, реакция на руку экспериментатора, вокализация и т.п. Ответ на каждый тест оценивали от 0 до 3 баллов. Чем выше был суммарный балл, тем значительнее оказывался тревожно-фобический статус животного. Приподнятый крестообразный лабиринт, также позволяющий судить о степени тревожности обследованной особи, состоял из 4 перпендикулярных рукавов (по два открытых и закрытых), приподнятых над полом. Регистрировали число посещений обоих рукавов, длительность пребывания в них, количество вертикальных стоек и све-шиваний с горизонтальной платформы. Последние два параметра характеризуют исследовательскую активность крыс. Для оценки вариативности сердечного ритма использовали метод кардиоинтерва-лографии [9]. У предварительно адаптированных к
специальному пеналу с контактными электродами животных регистрировали ЭКГ, которую подвергали математическому анализу по данным измерения 500 последовательных интервалов R-R. Запись и регистрацию параметров кардиоинтервалограммы (КИГ) осуществляли посредством автоматизированного комплекса «Валента». Рассчитывали следующие показатели: моду - наиболее часто встречающееся значение интервалов R-R, её амплитуду - число кардиоинтервалов, соответствующих наибольшему значению моды, вариационный размах, а также индекс напряжения (ИН) - интегральный показатель, позволяющий наглядно оценить соотношение активности симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы. Кроме того, с помощью спектрального анализа выявляли волновую структуру сердечного ритма и раздельно учитывали мощность волн I и II порядка, а также их соотношение в виде индекса централизации (ИЦ), отражающего степень централизации управления ритмом сердца.
После регистрации исходных физиологических параметров по всем использованным тестам животные были подразделены на три равные подгруппы (по 20 особей). Первая - контрольная - состояла из интакт-ных крыс, во второй за 40 мин. до тестирования вну-трибрюшинно вводили в небольшом объёме (0,5 мл) физиологический раствор. Эта часть животных слу-
жила контролем для третьей группы, получавшей по той же схеме мелатонин (препарат мелаксен фирмы игпр1пагт USA в дозе 0,1 мг/кг). Одновременно вторая группа отражала реакцию на слабый инъекционный стресс. Спустя три дня все крысы подвергались более сильному стрессорному воздействию в виде принудительного плавания (24 мин. в резервуаре с водой, !-26-27°), после чего описанное исследование повторяли. Полученные результаты были обработаны методами вариационной статистики посредством компьютерных программ с применением ^критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. «Открытое поле». Поведение интактных крыс в «поле», несмотря на некоторые индивидуальные различия, имело общие черты. После непродолжительной адаптации они обычно пересекали несколько (6-12) периферических сегментов, редко посещая центральные, и совершали ряд (3-8) вертикальных стоек. Животные, получавшие физиологические раствор, выглядели менее активными, очевидно, в силу стрессирующего характера самой процедуры инъекции. Это проявлялось в некотором ослаблении спонтанной подвижности в форме тенденции к уменьшению количества пересечённых периферических сегментов. Отмечено и нарастание тревожности, судя по снижению числа вертикальных стоек и значимому урежению посещений центральных сегментов (рис. 1).
Мелатонин оказывал отчётливое активирующее и одновременно антистрес-сорное действие. Несмотря на существование и в этих опытах неизбежного инъекционного стресса, под влиянием гормонального препарата происходил значительный и статистически достоверный рост локомоторной активности животных с понижением их тревожности, о чём свидетельствовали повышение количества вертикальных стоек, визитов в центр «поля», усиление груминга. Более выраженный плавательный стресс, особенно в сочетании с инъекционным, по всем критериям сильнее нарушал поведение крыс. Мелатонин на таком фоне значимо ограничивал выраженность поведенческих нарушений. При этом можно констатировать почти полную нормализацию изученных показателей и в то же время отсутствие того выраженного активирующего эффекта вещества, который наблюдался в условиях менее резкого (инъекционного) стрессирования, когда вводили один мелатонин (рис. 1).
Многопараметрическая оценка поведения. Введение физиологического раствора провоцировало у крыс фоби-ческие реакции. По сравнению с интактными животны-
Периферические сегменты
Центральные сегменты
1-Н о
Вертикальные стойки
Груминг
1 2 3
4 5 6
8 6 4
2-Н
1 2 3
4 5 6
Рис 1. Ослабление мелатонином стрессорных нарушений в поведении крыс в «открытом поле».
По вертикали оси - абсолютные значения показателя. Здесь и на остальных рисунках цифрами показаны группы животных: 1 - интакные, 2 - инъекции физиологического раствора (инъекционный стресс), 3 - введение мелатонина (0,1 мг/кг), 4 - плавательный стресс, 5 - плавание в сочетании с инъекциями физ. раствора, 6 - то же с введением мелатонина. * и ** - статистически значимые сдвиги (Р<0,05 и 0,01) при сравнении 3-2 и 6-5 групп.
5
о
ми они сильнее реагировали на приближение руки экспериментатора, гораздо чаще отмечались прижимание ушей, вокализация и движение назад (пя-чение). В результате у них выше оказывался общий уровень тревожности. Мелатонин несколько уменьшал подвижность крыс, что проявлялось в некотором замедлении спуска с высоты и прохождения через отверстие, а бокс вообще ни одно животное не покинуло. Одновременно падали реакция на руку экспериментатора и вокализация. Животные внешне выглядели спокойными; находясь на высоте или в затемнённом боксе, они обычно умывались либо дремали. Подобные сдвиги в поведении совокупно обусловливали достоверное снижение общего балла тревожности по сравнению с контрольной группой. После плавательного стресса, напротив, отмечалась моторная заторможенность. Крысы иногда спускались с высоты, но практически не отмечено случаев выхода из домика и прохождения через отверстие. Одновременно выявлено усиление фобического ответа на руку экспериментатора, прежде всего в виде возрастания вокализации, зафиксированной почти у всех животных. По данным балльной оценки, уровень тревожности существенно возрастал. Сочетание принудительного плавания и инъекционного стресса обусловливало дальнейшее усугубление тревожно-фобического статуса крыс.
Мелатонин в подобных условиях обеспечивал де-стрессирующий эффект при некотором ограничении подвижности. Внешне животные казались не столь скованными, тем не менее за время тестирования ни одно не покинуло домик. В целом же суммарный балл тревожности, как и в тесте «открытого поля», оказывался значимо ниже. И в этом случае по своей абсолютной величине сдвиг превосходил данный показатель при использовании одного мелатонина, свидетельствуя о меньшей эффективности препарата в условиях более выраженного стресса.
Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ). Интактные крысы в первые минуты после помещения в ПКЛ демонстрировали определённую активность, посещая его центр и открытые рукава, но чаще предпочитали закрытые. Изредка они совершали вертикальные стойки и свешивания с горизонтальной платформы, хотя к концу эксперимента количество таких актов падало, свидетельствуя об адаптации и ослаблении исследовательского поведения. Стрес-сирование при введении физиологического раствора отражалось на профиле активности животных в виде тенденции к укорочению времени пребывания в открытых и некоторой задержке в закрытых рукавах ПКЛ, а также в форме снижения частоты познавательных действий (рис. 2). У животных, получавших мелатонин, наблюдали обратно направленные, по большинству критериев (помимо частоты свешиваний) статистически значимые сдвиги, указывающие на понижение тревожности и
поведенческую активацию. Плавательный стресс в сочетании с инъекционным вызывал более грубые поведенческие нарушения, чем изолированное применение последнего. При оценке всех изученных параметров можно было констатировать ослабление локомоторной и исследовательской деятельности крыс, что проявлялось в особенно резком укорочении времени нахождения в открытых рукавах ПКЛ и наибольшей задержке в закрытых при минимуме вертикальных стоек и свешиваний.
Мелатонин в таких условиях способствовал отчётливой нормализации поведения, приближая отдельные показатели его (длительность пребывания в закрытых рукавах, число вертикальных стоек) к исходному уровню (рис.2). Следовательно, и на этой модели эпифизарный гормон выступал в той же роли анти-стрессорного агента, впрочем, менее эффективного при более сильном стрессировании.
Вариативность сердечного ритма. По сравнению с интактными животными, крысы, получавшие контрольные инъекции физиологического раствора, не обнаруживали резких нарушений основных параметров КИГ. Тем не менее в качестве обычной реакции на стресс отмечались признаки симпатизации ритма. На это указывали возрастание амплитуды моды, некоторое понижение мощности колебательного процесса и ограниченная представленность волн различного диапазона на спектрограмме. В конечном счёте отмечалась тенденция к увеличению интегральных показателей - индексов напряжения и централизации. В случае
плавательного стресса и, особенно, его сочетания с
Открытые рукава Закрытые рукава
Вертикальные стойки Свешивания
123 456 123 456
Рис. 2. Изменение мелатонином поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте при стрессе.
По вертикали вверху - время (сек.), внизу - число актов.
инъекционным такие изменения приобретали ещё более выраженный характер (рис. 3).
Стресспротективная активность мелатонина при изолированном применении вещества на данной модели проявлялась в ограничении признаков симпа-тикотонии. Под его влиянием происходило возрастание вариативности сердечного ритма со смещением моды вправо по оси абсцисс, снижением её амплитуды и индекса напряжения. Особенно чётко менялись спектральные характеристики КИГ в виде увеличения мощности дыхательных волн, в результате чего значимо понижалась величина индекса централизации. На фоне сочетания стрессорных воздействий разного типа антистрессорный эффект гормонального препарата проявлялся слабее, однако достаточно отчётливо, судя по тенденции к нормализации обоих интегральных показателей (рис. 3).
Таким образом, исходя из представленных данных, эпифизарный мелатонин в низкой дозе, близкой физиологическому уровню гормона в крови животных [14], ослабляет проявления острого стресса на разных экспериментальных моделях, характеризующих как поведение («открытое поле», многопараметрическая оценка, ПКЛ), так и вегетативный статус (КИГ) крыс. Для такого эффекта, по-видимому, не имеет особого значения природа стрессора, коль скоро ослабляется реакция и на саму инъекцию вещества, и на принудительное плавание. К тому же ранее нами была установлена способность мелатонина, подобно анксиолитику диазепаму, успешно подавлять страх и тревожность,
ИН
5Т^ 4
з У
2
1
1 2
5 6
Рис. 3. Сдвиги вариативности сердечного ритма при стрессе и действии мелатонина по данным кардио-интервалографии.
Приведены абсолютные величины интегральных показателей - индекса напряжения (ИН) и индекса централизации (ИЦ).
вызванные повреждением одного из лимбических образований мозга - амигдалы [8]. В то же время представленные факты подчёркивают важность исходной силы стрессорного воздействия для выраженности защитной активности гормона, ибо на всех моделях она оказывалась явно слабее в случае сочетания обоих стрессоров.
Происхождение антистрессорных свойств мелатонина может определяться комплексом причин. К ним относятся хронобиологический, нейрофизиологический, гормональный, иммунологический и некоторые другие механизмы, ранее уже обсуждавшиеся достаточно подробно [3]. Среди них, по-видимому, особенно важной является зависимость антистрессорно-го эффекта от способности гормона в естественных условиях обеспечивать стабилизацию колебательных процессов в организме и модулировать функцию эмо-циогенных церебральных структур.
Согласно нашим в прошлом подробно аргументированным представлениям, стрессорной реакции любого генеза неизменно аккомпанирует дезорганизация биологических ритмов, а предшествующая дизритмия облегчает её развёртывание [5]. Между тем физиологическая роль эпифиза и его биологически активных соединений, в первую очередь, сводится к устранению десинхронозов, ресинхронизации нарушенных биоритмов. С этим же фактором отчасти связывают происхождение противотревожной, антистрессорной активности и традиционных анксиолитиков [2].
С другой стороны, известно, что повышенная эмоциональная реактивность, обязательно сопровождающая любой стресс, определяется возбуждением целого ряда эмоциогенных лимбических образований головного мозга, среди которых лидирующее место принадлежит гиппокампу. К числу наиболее значимых нейрохимических механизмов ограничения эмоциональной реактивности, в том числе за счёт подавления возбудимости гиппокампа, принадлежит, как известно, ГАМК. По нашим наблюдениям, наравне с другими анксиолитиками мелатонин ограничивает тревожность крыс, возникающую после прекращения длительной электростимуляции дорсального гиппокампа, и ослабляет стрессорную активацию гиппокампальных нейронов [7,10]. Происходит это, очевидно, во многом за счёт его способности усиливать центральную ГАМК-ергическую передачу [13].
Исходя из установленной в настоящей работе достаточно универсальной антистрессорной активности мелатонина, резонно рассматривать это гормональное средство в качества серьёзной клинической альтернативы классическим и по-прежнему весьма популярным анксиолитикам бензодиазепинового ряда ещё и потому, что по ряду критериев он их превосходит. В самом деле, как показало выполненное ранее сравнительное изучение малых эквивалентных доз мелатонина и эталонного бензодиазепинового препарата диазепама, эпифизарный гормон оказывает более адекватное оптимизирующее влияние на расстроенную стрессом ритмику циркадианной локомоции крыс, быстрее ликвидирует постстрессорный рост индекса напряжения, по данным КИГ [6]. К тому же наблюдениями на людях установлено, что в отличие от бензодиазепинов, он вызывает очень мягкий снотворный эффект [11] и, наконец, обладая крайне низкой токсичностью, лишён присущих им побочных свойств.
Заключение. На разных экспериментальных моделях стресса в низких дозах эпифизарный гормон мелатонин демонстрирует защитные свойства, ослабляя стрессорные сдвиги в поведении и вегетативном статусе животных. При большей выраженности стрес-
0
3
4
са его протективная активность проявляется слабее, однако вполне достаточна для экстраполяции обнаруженных изменений на клиническую практику, чтобы рассматривать мелатонин в качестве альтернативы бензодиазепиновым анксиолитикам.
Литература
1. Арушанян, Э.Б. Участие эпифиза в антистрессовой защите мозга / Э.Б.Арушанян // Успехи физиол. наук. - 1996. - №3. - С. 31-50.
2. Арушанян, Э.Б. Анксиолитические средства / Э.Б.Арушанян // Ставрополь, 2001. - 246 с.
3. Арушанян, Э.Б. Антистрессорные возможности эпифизарного мелатонина / Э.Б. Арушанян // В кн. Мелатонин в норме и патологии. - М.,
2004. - С. 198-222.
4. Арушанян, Э.Б. Эпифизарный мелатонин как антистрессорный агент / Э.Б. Арушанян, Л.Г. Арушанян // Экспер. и клин. фармакол. -1997. - №6. - С. 71-77.
5. Арушанян, Э.Б. Место гиппокампа в биорит-мической организации поведения / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер // Успехи физиол. наук. -2001. - №1. - С. 79-85.
6. Арушанян, Э.Б. Сравнительная оценка анти-стрессорной активности эпифизарного гормона мелатонина и диазепама / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер, А.С. Булгакова // Экспер. и клин. фармакол. - 2007. - №6. - С. 9-12.
7. Арушанян, Э.Б. Гистохимические и морфометрические доказательства участия нейронов дорсального гиппокампа в антистрессор-ном действии мелатонина / Э.Б. Арушанян,
Э.В. Бейер, Н.А. Локтев II Экспер. и клин. фармакол. - 2001. - №6. - С. 10-12.
8. Арушанян, Э.Б. Сравнительное влияние мелатонина и диазепама на сдвиги в тревожно-фобическом состоянии крыс, вызванные повреждением амигдалы I Э.Б. Арушанян, Е.М.Чернышёва II Экспер. и клин. фармакол. -1997. - №1. - С. 7-9.
9. Баевский, РМ. Прогнозирование состояний на грани нормы и патологии I Р.М.Баевский. - М., 1979. - З24 с.
10. Бейер, Э.В. Влияние различных анксиолитиков на тревожное состояние, возникающее у крыс после прекращения электрической стимуляции дорсального гиппокампа I Э.В. Бейер, Э.Б. Арушанян II Экспер. и клин. фармакол. - 1999. -№5. - С. 7-12.
11. Левин, Я.И. Мелатонин (мелаксен) в терапии инсомнии I Я.И.Левин II Рус. мед. журн. -
2005. - №7. - С.1-4.
12. Родина, В.И. Многопараметрический метод комплексной оценки тревожно-фобического состояния у крыс I В.И. Родина, Н.А. Крупина, Г.Н. Крыжановский II Журн. высш. нервн. деят. - 199З. - №5. - С. 1006-1011.
13. Golombek, D.A. Melatonin effects on behavior: possible mediation by the central GABAergic system I D.A. Golombek, P Pevet, D.P Cardinali II Neurosci. Biobehav. Rev. - 1996. - №5. - P 40З-412.
14. Reiter, R.J. Melatonin: that ubiquitously acting pineal hormone I R.J. Reiter II News Physiol. Sci. -1991. - №6. - P 22З-227.
АНТИСТРЕССОРНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЭПИФИЗАРНОГО ГОРМОНА МЕЛАТОНИНА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ И ВЫРАЖЕННОСТИ СТРЕССА
Э.В. БЕЙЕР, А.С. БУЛГАКОВА, А .А. СКОРНЯКОВ, Э.Б. АРУШАНЯН
Эпифизарный гормон мелатонин ослабляет стрес-сорные проявления в поведении и вегетативном состоянии животных. Это действие проявляется на разных экспериментальных моделях в низких дозах. При сильном стрессе защитное действие мелатонина проявляется слабее. Мелатонин может использоваться в клинике как альтернатива бензодиазепиновым анксиолитикам.
Ключевые слова: мелатонин, стрессорные нарушения
ANTISTRESSOR PROPERTIES OF PINEAL HORMONE MELATONIN IN DEPENDENCE OF EXPERIMENTAL MODEL AND KIND OF STRESS
BEYER E.V., BULGACOVA A.S.,
SCORNYACOV A.A., ARUSHANIAN E.B.
Pineal hormone melatonin attenuated stress-induced shifts in a behavior and autonomic state of animals. This action showed up on different experimental models in low doses of drug. At strong stress the protective action of melatonin was weaker. Suggested that melatonin can be used in a clinical practice as an alternative of benzodiazepine anxiolytics.
Key words: melatonin, stress-induced disturbances
