CC BY
25
УДК 577.2:616-006:578.828
Антиретровирусная активность нового производного пиримидил-ди(диазодиспироалкана)
Е. А. Новоселова1*, О. Б. Рябова2, И. А. Ленева3, В. Г. Нестеренко1, Р. Н. Болгарин1, В. А. Макаров2
1 ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», 125252, Москва, ул. Авиаконструктора Микояна, 12
2 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Институт биохимии, лаборатория биомедицинской химии, 119071, Москва,
Ленинский просп., 33-2б
3Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, лаборатория
экспериментальной вирусологии, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5
*E-mail: helen.novoselova@gmail.com
Поступило в редакцию 01.02.2017
Принято к печати 16.02.2017
РЕФЕРАТ Синтезирован 3,3'-(2-метил-5-нитропиримидин-4,6-диил)бис-3,12-диаза-6,9-диазониа-диспиро[5.2.5.2]гексадекан тетрахлорид дигидрохлорида, соединение, ингибирующее репликацию вирусов различных семейств, использующих гепарансульфатпротеогликаны для прикрепления к клетке хозяина. Это соединение показало высокую эффективность в отношении ряда штаммов ВИЧ. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА HIV, ВИЧ, гепарансульфат, диспиросоединения, противовирусная активность.
ВВЕДЕНИЕ
Считается, что наиболее перспективным направлением в области поиска как противовирусных, так и противомикробных лекарственных препаратов, является поиск соединений, блокирующих взаимодействие между патогеном и клеткой хозяина. Этот подход имеет ряд преимуществ, особенно в случае противовирусных средств, поскольку активному соединению нет необходимости проникать внутрь клетки, что позволяет резко снизить как цитоток-сичность, так и общую токсичность используемого вещества.
Действительно, на первом этапе развития вирусной инфекции происходит адгезия вируса к клетке, что реализуется через связывание специфических вирусных белков с определенными молекулами клеточной поверхности. Наиболее часто адгезия осуществляется за счет специфического присоединения к гепарансульфатпротеогликанам (HSPG), находящимся на поверхности клетки. Известно, что этот механизм используют такие вирусы, относящиеся к разным семействам, как герпесвирусы типа 1 и 2 (HSV-1, -2) [1], папилломавирусы (HPV) [2], цитоме-галовирус человека (HCMV) [3], некоторые штаммы вируса иммунодефицита человека (HIV) [4], респи-раторно-синцитиальный вирус человека (HRSV) [5], вирусы гепатита В и С (HBV и HCV) [6] и др.
Наиболее известным и подробно изученным ингибитором процесса адгезии является N,N-6^(1-оксидо[1,2,5]оксадиазоло[3,4d]пиримидин-7-ил)-3,12-диаза-6,9-диазония(5,2,5,2)диспирогексадекана дихлорид 1 (рисунок), ранее синтезированный нами. Показано, что данное соединение 1 и его аналоги, включающие диспиротрипиперазиновый фрагмент, эффективно обратимо связываются с HSPG клетки и таким образом препятствуют прикреплению вирусов [7]. Диспиросоединение 1 ингибирует репликацию у представителей семейства вирусов герпеса [8], а также вирусов других семейств, использующих Н8 в качестве рецептора либо корецептора [3]. Однако метаболическая нестабильность соединения 1, обусловленная разложением с выделением оксида азота, не позволила изучить его биологические свойства [9].
Поэтому нами была предпринята попытка получения нового производного диспиротрипиперазиния: проведен дизайн оптимального соединения, способного связываться с известными HSPG с учетом потенциальной метаболической стабильности целевого соединения, и осуществлен синтез 3,3'-(2-метил-5-нитропиримидин-4,6-диил)бис-3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан тетрахлорид дигидрохлорида 2. Предполагалось, что диспиропи-перазин 2, представляя собой химически более стабильную структуру, будет так же эффективно бло-
N
N N-O
- +O O —N N
М
N
N^
of of N „
N
of
N
of
2 HOI
Строение ^^бис(1-оксидо[1,2,5]окса-диазоло[3,4d]-пиримидин-7-ил)-3,12-диаза-6,9-диазония(5,2,5,2)-диспирогексадекана дихлорид (1) и 3,3'-(2-метил-5-нитропиримидин-4,6-диил)бис-3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан тетра-хлорид дигидрохлорида(2)
Противовирусная активность диспиропиперазина 2 в отношении различных штаммов вируса
Штамм вируса Линия клеток CC CC50, мкМ мкМ TI (CC50/IC50)
HIV-1 6S MT-2 98.2 1.4 71.4
HIV-1 IIIB MT-4 200.0 5.7 35.0
HIV-1 RF CEM-SS 197.0 150.0 1.3
HIV-1 N119 MT-4 200.0 31.7 6.3
HIV-1 DPS MT-4 200.0 1.2 170.0
HIV-1 A-17 MT-2 79.1 4.7 16.7
HIV-1 A-17 MT-4 200.0 33.7 5.9
HIV-2 ROD CEM-SS 200.0 13.3 15.0
SIV MAC 251 MT-4 200.0 6.3 31.5
Примечание. CC50 - цитотоксическая концентрация; IC50 - концентрация полумаксимального ингибирова-ния; TI - терапевтический индекс.
кировать HSPG клетки и тем самым препятствовать адгезии вируса к клетке, что должно привести к нарушению жизненного цикла вируса и снижению его титра.
В настоящей работе мы сообщаем о высокой анти-ретровирусной активности нового производного ди-спиротрипиперазиния 2, что полностью подтверждает выдвинутую нами гипотезу. В данный момент диспиросоединение 2 проходит углубленные доклинические исследования.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования проводили в Национальном институте рака (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, США). Противовирусную активность определяли с использованием ХТТ-теста [10] при различных концентрациях соединения и инкубировании клеток (линии CEM-SS, MT-2, MT-4) в присутствии серийных разведений диспиропиперазина 2 (растворяли в диметилсульфоксиде, DMSO) в течение 6 дней при температуре 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2 с последующим добавлением реагентов ХТТ. Метод основан на спектрометрическом определении уровня формазана, трансформированного живыми клетками из водорастворимой тетразолиевой соли ХТТ.
Использовали следующие штаммы ВИЧ: эталонный HIV-1 IIIB; чувствительные к азидотимиди-ну HIV-1 6S, HIV-1 RF; лекарственно-устойчивые штаммы HIV-1 N119 (устойчив к невирапину, мутация Y181C), HIV-1 DPS (устойчив к дифенил-сульфону, мутация Y181C) и HIV-1 A-17 (устойчив к невирапину, мутации K103N, Y181C). Также ис-
пользовали штамм HIV-2 ROD и вирус иммунодефицита обезьян SIV MAC 251.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты, представленные в таблице, показывают, что синтезированный нами диспиротрипипера-зин 2 эффективно ингибирует репликацию HIV-1 и -2 и SIV. При этом, в отличие от полученных ранее данных об активности соединения 1 против вирусов герпеса, наблюдали достаточно широкий диапазон чувствительности HIVh SIV.
Среди проверенных штаммов наиболее чувствительными к ингибирующему действию диспи-росоединения 2 оказались HIV-1 6S и HIV-1 DPS - ICc„ = 1.37 и 1.17 мкM соответственно. В отличие
50
от этих штаммов, HIV-1 RF оказался в 100 раз менее чувствительным к исследуемому соединению (IC50 = 150 м^).
В отличие от вирусов HSV, где значения IC50 устанавливались в одном диапазоне, как и значения, задаваемые для всех испытываемых штаммов (от 8.2 до 20.4 мкM), ингибирование репликации HIV сильно зависело от используемых штаммов, где значения IC50 варьировались от 150 мкM (HIV-1 RF на клеточной линии CEM-SS) до 1.4 мкM (HIV-1 6S на клетках MT-2). В случае штамма HIV-1 A-17 значения IC50 определяли на разных клеточных линиях, и они варьировали от 33.7 мкМ в линии МТ-4 до 4.7 мкM в линии МТ-2.
Столь существенные различия в значениях IC50 (как для одной клеточной линии, но разных штаммов HIV, так и для одного штамма, но на разных клеточных культурах) могут быть обусловлены двумя
ТОМ 9 № 1 (32) 2017 | ACTA NATURAE | 113
причинами. Во-первых, различные клеточные линии могут иметь разную концентрацию поверхностных гепарансульфатпротеогликанов. Во-вторых, достоверно показано, что штаммы ВИЧ значительно отличаются друг от друга по эффективности использования корецепторов (CCR5 и CXCR4) на этапе прикрепления к клетке-мишени [11].
В отличие от вирусов герпеса, структура присоединения HIV при поддержке гепарансульфата до сих пор не получила подтверждения методом рентгено-структурного анализа, и возможность взаимодействия с клеткой хозяина с использованием гепаран-сульфатпротеогликанов для HIV известна только по литературным данным.
Предполагается, что новый класс производных пиримидил-ди(диазодиспироалканов) можно будет использовать в качестве противовирусных средств.
На это указывают такие факторы, как специфичность ингибирующего действия, показанная на примере диспиротрипиперазиния 2 в отношении штаммов вирусов; способность диспиросоединений формировать очень стабильные связи с некоторыми вирусными рецепторами или корецепторами; состав с химически определяемой низкой молекулярной массой [7].
Необходимо отметить, что такой механизм действия очень перспективен в плане преодоления резистентности вирусов к официнальным лекарственным средствам, так как он воздействует не на сам вирус, а на клетку. Благодаря указанным свойствам соединения данного класса могут служить ценным инструментом для изучения взаимодействий между вирусом и клеткой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shukla D., Spear P.G. // J. Clin. Invest. 2001. V. 108. № 4. P. 503-510.
2. Selinka H.C., Giroglou T., Sapp M. // Virology. 2002. V. 299. № 2. P. 279-287.
3. Paeschke R., Woskobojnik I., Makarov V., Schmidtke M., Bogner E. // Antimicrob. Agents Chemother. 2014. V. 58. № 4. P. 1963-1971.
4. Patel V., Ferguson M., Minor P.D. // Virology. 1993. V. 192. № 1. P. 361-364.
5. Hallak L.K., Spillmann D., Collins P.L., Peeples M.E. // J. Virol. 2000. V. 74. № 22. P. 10508-10513.
6. Jiang Y.F., He B., Ma J., Li N.P., Gong G.Z., Cheng D. // Acta Gastroenterol. Belg. 2012. V. 75. № 3. P. 316-321.
7. Schmidtke M., Wutzler P., Makarov V. // Lett. Drug Design & Discovery. 2004. V. 1. № 4. Р. 293-299.
8. Artemenko A.G., Muratov E.N., Kuz'min V.E., Kovdienko N.A., Hromov A.I., Makarov V.A., Riabova O.B., Wutzler P., Schmidtke M. // J. Antimicrobial Chemotherapy. 2007. V. 60. № 1. P. 68-77.
9. Каминка М.Э., Калинкина М.А., Пушкина Т.В., Тупикина С.М., Рябова О.Б., Макаров В.А., Граник В.Г. // Эксп. и клин. фармакол. 2004. Т. 67. № 3. С. 30-33.
10. Weislow O.S., Kiser R., Fine D.L., Bader J., Shoemaker R.H., Boyd M.R. // J. Natl. Cancer Inst. 1989. V. 81. № 8. P. 577-586.
11. O'Brien S.J., Moore J.P. // Immunol. Rev. 2000. V. 177. Р. 99-111.
