CC BY
84
УДК 615.3 (571.6):678.746.47
В.Г.Спрыгин, Н.Ф.Кушнерова, С.Е. Фоменко, Т.Н.Гордейчук, Е.Е.Солодова
АНТИРАДИКАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ОЛИГОМЕРНЫЙ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВЫЙ КОМПЛЕКС
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И.Ильичева, ДВО РАН, отделение биохимических технологий, г. Владивосток
РЕЗЮМЕ
Изучено влияние фитопрепаратов из гребней калины (Viburnum Opuli), винограда Амурского (Vitis Amurensis) и лимонника китайского (Schi-zandra Chinensis), а так же выделенных из них фракций, обогащенных проантоцианидинами на процессы свободнорадикального окисления в модельных системах in vitro. Показано, что изучаемые препараты являлись эффективными поглотителями свободных радикалов, несущих, как положительный заряд (ABTS+), так и не спаренный электрон (ОН-), проявляя при этом как электронофорную, так и протонофорную активность. Фракция, обогащенная проантоцианидинами в препаратах из гребней калины и винограда, являлась основным носителем антирадикальной активности (более 80%) обоих типов и по уровню активности превосходила в 2,5 - 5,5 раз таковую препарата сравнения “пикногенол”.
SUMMARY
V.G.Sprygin, N.F.Kushnerova, S.E.Fomenko, T.N.Gordeychuk, E.E.Solodova
ANTI-RADICAL ACTIVITY OF FAR-EASTERN PLANT EXTRACTS CONTAINING OLIGOMERIC PROANTOCYANIDINE COMPLEX
We examined the effect of phyto-substances from guelder rose (Viburnum Opuli), Amur grapes (Vitis Amurensis) and Chinese lemon tree (Schizandra Chinensis) and as well as their extracts enriched by proan-tocyanidines on free-radical oxidation processes with models in vitro. These substances were shown to effectively absorb free radicals carrying positive charge (ABTS+) as well as coupled electron (OH).
These substances had both electonophornic and protonophornic activity.Fractions enriched by proan-tocyanidines in substances from guelder rose and grapes were the main carriers of anti-radical activity (more than 80%) of both types. In terms of activity they surpassed “piknogenol” 2,5 - 5.5 times.
В результате воздействия эндогенных и экзогенных факторов, а так же вследствие протекания нормальных метаболических процессов в организме человека постоянно образуется целый ряд высокоактивных форм кислорода и азота в виде свободных радикалов [5]. Они являются центральным звеном в концепции свободнорадикального механизма развития патологических процессов в организме [13] и поражения печени [8]. В результате массового образования свободных радикалов активизируется про-
цесс оксидативного разрушения липидов, белков и ДНК, ингибирование клеточной и антиоксидантной систем защиты, ряд других метаболических сдвигов [19], что вносит существенный вклад в патофизиологию заболеваний человека.
При этом известно, что применение различных антиоксидантов, способных инактивировать свободные радикалы имеет целый ряд положительных эффектов на здоровье человека и предотвращение заболеваний [22]. Олигомерные проантоцианидины (ОПЦ) - полимерные формы флаван-3-олов, природные антиоксиданты широко распространенные во фруктах, овощах, орехах, винограде, обладают широким спектром биологической, фармакологической и терапевтической активности, способностью нейтрализовать свободные радикалы и проявления оксидативного стресса [9]. Благодаря широкой распространенности данного класса полифенолов в растениях пищевого назначения, и длительной истории их поступления в организм человека (история виноградарства и виноделия насчитывает около 30 тыс. лет) [2], организм человека эволюционно адаптирован к включению ОПЦ в процесс метаболизма. Их регулярное поступление в организм связано с проявлением целого ряда благоприятных факторов для здоровья [21]. Однако высокая стоимость зарубежных препаратов, содержащих комплексы ОПЦ (пикногенол, экстракт виноградных косточек), ограничивают их широкое использование, не только в качестве компонентов пищевых продуктов, но даже и в качестве биологически активных пищевых добавок. В связи с этим приобретает актуальность поиск источников сырья для получения фитопрепаратов, обогащенных ОПЦ, для использования их в качестве биологически-активных пищевых добавок с антиоксидантными свойствами. Ранее было показано, что растительные препараты, полученные нами из гребней (кисти, освобожденные от ягод) калины (Viburnum Opuli), гребней лимонника китайского (Shizandra Chinensis) и гребней винограда Амурского (Vitis Amurensis), зарегистрированные соответственно под торговыми марками “Калифен”, “Экликит” и “Диприм”, обладают ярко выраженными гепатозащитными свойствами [3, 4] и содержат в своем составе флавоноиды группы катехинов и их олигомерные формы (проантоцианидины). В связи с тем, что в реализации гепатопротекторного эффекта ведущую роль играет антирадикальная активность, то целью данной работы явилась ее оценка у перечисленных выше препаратов, а так же у выделенных из них фракций обогащенных ОПЦ.
Методы исследования
Экстракты из растительного сырья готовили на 40% этиловом спирте методом реперколяции. Выход препаратов составлял 1 л на 1 кг сырья. В полученных экстрактах определяли содержание экстрактивных веществ.
Для выделения фракции, обогащенной ОПЦ, 10 мл исходного экстракта упаривали на роторном испарителе (t<35oC), для удаления спирта, разводили дистиллированной водой до исходного объема и доводили рН раствора до 7 титрованием 0,1 Н едким натром. Затем образец наносили на экстракционную колонку ENVI C18 (Waters, USA) содержащую 10 г сорбента. Экстракционную колонку после нанесения образца элюировали 50 мл воды (рН=7) для удаления феноловых кислот [20] не относящихся к проанто-цианидинам, а так же углеводов и органических кислот. После просушивания колонки в токе азота, фракцию проантоцианидинов элюировали 20 мл этанола и использовали при дальнейшей работе. Суммарное содержание полифенольных соединений в исходных экстрактах и выделенных фракциях определяли с помощью реактива Фолина-Чикалтео [18], используя в качестве стандарта галловую кислоту. Количественно содержание полифенольных соединений выражали в мг-экв галловой кислоты.
Уровень антирадикальной активности полученных препаратов и их фракций оценивали:
1. По способности восстанавливать органический катион радикал ABTS+ (2,2'-азинобис-3-этилбен-зотиазолин-6-сульфонат) [15]. Антирадикальную активность оценивали по снижению величины абсорбции при длине волны 734 нм на спектрофотометре Ultrospek II (LKB, Sweden). Перед определением исходный раствор ABTS+ разводили этанолом до величины абсорбции 0,9±0,02. Реакцию проводили непосредственно в кварцевой кювете объемом 1 мл, куда помещали 1 мл разведенного раствора ABTS+ и замеряли величину поглощения А734. После этого в кювету добавляли 10 мкл раствора растительного образца или модельного антиоксиданта сравнения (галловой кислоты) в этаноле, тщательно перемешивали и замеряли поглощение ровно через 3 мин. Реакцию проводили при комнатной температуре ^20°С. Каждое измерение проводили не менее 3 раз.
2. По способности предотвращать окислительную модификацию салициловой кислоты под действием гидроксил радикалов (ОН-) [6], генерируемых в же-лезо/аскорбатной модели [16]. Реакционную смесь (200цМ аскорбиновой кислоты, 4цМ ЕДТА, 350цМ салициловой кислоты, 2 цМ Fe3+, 100 цл образца) объемом 1 мл инкубировали в течение 60 мин при 35оС. Через 60 мин в инкубационной среде анализировали продукты окислительной модификации салициловой кислоты (2,3- и 2,5-дигидроксибензойные кислоты). Аликвоту реакционной смеси объемом 100 мкл, помещали в бутылочку для автоматического устройства ввода проб и анализировали методом ВЭЖХ [17]. Для анализа использовали колонку Сфе-рисорб RP18 (150х3 мм), которую элюировали в изократном режиме. Подвижная фаза: 0,03 М лимонной
кислоты и 0,03 М уксусной кислоты (рН=3,6); скорость элюирования 1,5 мл/мин.
Антирадикальную активность оценивали по уменьшению площади пика, соответствующего ди-гидроксибензойным кислотам по сравнению с контролем, когда вместо образца в реакционную смесь добавляли 0,1 мл дистиллированной воды.
За единицу антирадикальной активности принимали такое количество антиоксиданта, которое вызывало изменение оптической плотности А734 или уменьшение площади пика, соответствующего продуктам окисления салициловой кислоты, равное таковому при действии 1 цМ галловой кислоты (ГК). Для расчета величин антирадикальной активности в цМ-ГК полученных фракций строили калибровочный график в диапазоне от 0,46 до 11,04 нМ (0,08 до 1,88 цг) ГК для метода № 1 и от 0,46 до 5,87 нМ (0,08 до 1 цг) ГК для метода №2. Значения величин ДА734 и AS в указанных диапазонах концентраций имели линейную зависимость от концентрации ГК.
В качестве препарата сравнения, был использован пикногенол (Stryka Botanicals, Switzerland), представляющий собой комплекс ОПЦ выделенный из коры французской морской сосны (Pinus Maritima). Принимая во внимание паспортные данные о 95% содержании полифенольных соединений, мы готовили раствор пикногенола с концентрацией 7 мг/мл, что примерно соответствовало содержанию суммарной полифенольной фракции в экстракте гребней винограда (Диприм) и использовали его в качестве модельного комплекса ОПЦ.
Все измерения проводили не менее трех раз. Результаты выражали в виде М±т.
Результаты и обсуждение
Из данных табл. 1 видно, что содержание суммарной полифенольной фракции в изученных препаратах существенно различается. Так если в Калифене и Диприме ее содержание достигает 10,6-10,8%, то у Экли-кита этот показатель существенно ниже и составляет только 4,9%. При этом, содержание наиболее интересующей нас фракции, обогащенной ОПЦ в Экликите меньше, чем в Калифене и Диприме в 3,5 и 5,5 раз,
Таблица 1
Количественные характеристики изученных препаратов в пересчете на 1 мл исходного экстракта
Название препарата Названия показателей
Экстрак- тивные вещества, мг Общие полифенолы, мг-экв ГК Фракция, обогащенная проантоциа-нидинами, мг-экв ГК
Калифен 45±5 4,9±0,З 4,0±0,2
Диприм б5±4 б,9±0,3 б,б±0,3
Экликит 45±4 2,2±0,1 1,2±0,1
Пикногенол 7 б,75±0,25 б,42±0,2
Примечания: Количество опытов - 3; ГК - галловая кислота.
соответственно. Количественные характеристики пикногенола соответствуют паспортным данным (95% полифенолов; процианодоловый индекс 92%).
Для оценки антирадикальной активности исходных препаратов и выделенных из них фракций, обогащенных ОПЦ, были выбраны две модельные системы, позволяющие судить как об электронофорной (ЛВТ8+), так и о протонофорной (ОН-) активности исследуемых антиоксидантов.
Из данных табл. 2 следует, что наибольшей активностью восстанавливать катион радикал ЛВТ8+ обладает Диприм, при этом более 95% активности локализовано во фракции, обогащенной ОПЦ. Сходная картина наблюдается и с Калифеном. Почти 83% антирадикальной активности по отношению к катион-радикалу ЛВТ8+ ассоциировано с фракцией про-антоцианидинов. Следует отметить, что удельная антирадикальная активность (на 1 мг фракции проан-тоцианидинов) Калифена по отношению к ЛВТ8+ была на 23% выше, чем у Диприма. Можно предположить, что данный феномен может быть результатом различий характеристик комплексов ОПЦ, таких как соотношение отдельных компонентов, их степени полимеризации и галлоизации [14], которые у Кали-фена вероятно являются более оптимальными.
Антирадикальная активность Экликита в модельной системе №1 (ЛВТ8+), была самой низкой из всех изученных препаратов, что следовало и из количественного содержания полифенольной фракции. При равном содержании экстрактивных веществ в исходных препаратах, она составляла чуть более 50% от активности Калифена. При этом только 25% активности связано с фракцией проантоцианидинов. Известно, что основными носителями антиоксидантной активности в растительных препаратах, в силу особенности химического строения, являются полифе-нольные соединения [7], которые реализуют свое действие через систему фенол-семихинон-хинон [1]. Поэтому, можно предположить, что в Эликите содержится большое количество фенольных кислот, которые были отделены при очистке фракции проан-тоцианидинов, или антирадикальная активность по
отношению к ЛВТ8+ ассоциирована с другими низкомолекулярными веществами фенольной (лигнаны) или нефенольной (аскорбиновая кислота, восстановленный глютатион) природы.
Данные, полученные для пикногенола, показали, что 89% антирадикальной активности по отношению ЛВТ8+, ассоциированы с фракцией проантоцианиди-нов. Удельная антирадикальная активность фракции проантоцианидинов пикногенола в первой модельной системе (ЛВТ8) составила 73 и 57% от активности Диприма и Калифена, соответственно.
Гидроксильный радикал является самым реакционным и токсичным из всех активных форм кислорода, образующихся в организме человека [11]. Благодаря своей экстремально высокой реакционной способности и малому размеру, гидроксильный радикал способен передвигаться в среде с достаточно высокой скоростью и атаковать практически любую молекулу в любой части ее углеродного скелета [10]. Атакуя молекулы липидов, гидроксильные радикалы инициируют ПОЛ, вызывая массированное повреждение биологических мембран [10] и окислительную модификацию ЛПНП, являющуюся одним из основных факторов развития склеротических процессов в сосудах [12]. В связи со сказанным, способность антиоксиданта инактивировать гидроксильные радикалы, является одним из важнейших показателей его активности.
Активность Диприма и Калифена инактивировать гидроксильные радикалы была практически эквивалентной, при этом с фракцией, обогащенной ОПЦ, связано 88 и 82% активности, соответственно. При этом удельная антирадикальная активность фракции выделенной из калифена была выше на 51%.
Самая низкая активность была отмечена у Экли-кита. При этом в отличие от модели №1, где с фракцией проантоцианидинов было ассоциировано 25% активности, в модели №2 этот показатель равен 66%. Это дает возможность предположить, что антиради-кальная активность Экликита в системе №1 связана с электронофорной активностью схизандринов, гидроксильные группы которых являются менее
Таблица 2
Антирадикальная активность изученных препаратов в модельных системах в
цМ галловой кислоты (М±т)
Название фракции Препарат
Калифен Диприм Экликит Пикногенол
Система №1 (ABTS+)
Исходный экстракт (на 1 мл, экспериментальная величина) 10,7б±0,34 11,98±0,24 5,75±0,17 9,07±0,1З
Фракция, обогащенная проантоцианидинами (на 1 мл исходного экстракта, экспериментальная величина) 8,92±0,21 11,40±0,З2 1,42±0,11 8,1З±0,25
Фракция, обогащенная проантоцианидинами (на 1 мг, расчетная величина) 2,23 2,19 1,18 1,27
Система №2 (OH-)
Исходный экстракт (на 1 мл, экспериментальная величина) 4,28±0,17 4,З5±0,21 0,б5±0,12 З,11±0,15
Фракция, обогащенная проантоцианидинами (на 1 мл исходного экстракта, экспериментальная величина) З,54±0,09 З,85±0,14 0,4З±0,09 2,79±0,0б
Фракция, обогащенная проантоцианидинами (на 1 мг, расчетная величина) 0,88 0,58 0,39 0,43
Примечание: количество опытов - 3.
доступными для улавливания гидроксильного радикала, чем таковые в молекуле катехинов и их галлоильных производных. Удельная активность проанто-цианидиновго комплекса Экликита в модельной системе №2 по сравнению с Дипримом и Калифеном составила 67 и 44%, соответственно.
Как и в системе №1, удельная антирадикальная активность фракций проантоцианидинов Калифена и Диприма была выше, чем у пикногенола и составила соответственно 204 и 135%. С фракцией проантоциани-динов ассоциировано 89% антирадикальной активности.
Таким образом, продукты переработки Дальневосточных дикоросов пищевого назначения, такие как виноград, калина и лимонник могут служить источником сырья для получения растительных фитопрепаратов, содержащих комплексы ОПЦ с высокой антиоксидантной активностью.
Полученные препараты обладают как протонофорной, так и электронофорной активностью и способны инактивировать свободные радикалы, несущие положительный заряд и не спаренный электрон. При этом уровень антирадикальной активности Диприма и Калифена в обеих моделях пропорционален содержанию в препаратах полифенольной фракции, обогащенной ОПЦ, с которой ассоциировано от 80 до 90% антирадикальной активности.
Удельная антирадикальная активность фракции проантоцианидинов Диприма и Калифена в 1,5 - 2 раза превышает таковую у пикногенола - коммерчески реализуемого препарата, содержащего в качестве активного начала комплекс ОПЦ.
Представленные результаты позволяют обосновать возможность создания безотходной технологии утилизации растительного сырья, путем использования побочных продуктов переработки калины, винограда и лимонника для извлечения высокоактивных препаратов, обладающих высокой антиоксидантной активностью. Полученные фитопрепараты могут быть использованы качестве профилактических биологически активных добавок, способствующих снижению уровня свободно-радикальных процессов в организме.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барабой В. А. Растительные фенолы и здоровье человека.-М.: Наука, 1984.-160 с.
2. Брехман И.И. Что противопоставить вредному действию алкоголя.-Владивосток: Дальпресс,
1994.-70 с.
3. Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Гордейчук Т.Н. и др. Диприм - пищевая добавка с гепатопро-текторными свойствами//Новые научные технологии в Дальневосточном регионе: Материалы III Дальне-вост. регион. конф. с всерос. участием.-Благове-щенск, 1999.-С.44.
4. Спрыгин В.Г.,Кушнерова Н.Ф. Калифен и эк-ликит - новые полифенольные гепатопротекторы растительного происхождения//У Международный съезд "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения".-Санкт-Петербург-Петродворец, 5-7 июля 2001.-
СПб., 2001.-С.435-439.
5. Chemistry, physiology and pathology of free radicals/L.Bergendi, L.Benes, Z.Durackova, M.Feren-cik// Life Sci.-1999.-Vol.65, №18-19.-P.1865-1874.
6. Coudray C., Mangournet C., Bouhadjeb S. et al. Rapid high-performance liquid chromatographic assay for salicylic acid in plasma without solvent extraction//! Chromatogr. Sci.-1996.-Vol.34, №4.-P.166-173.
7. Croft K.D. The chemistry and biological effects of flavonoids and phenolic acids//Ann. N. Y. Acad. Sci.-1998.-Vol.854.-P.435-442.
8. Feher J., Lengyel G., Blazovics A. Oxidative stress in the liver and biliary tract diseases//Scand. J. Gastroenterol.-1998.-Vol.33.-P.38-46.
9. Fine A. Oligomeric proanthocyanidin complexes: history, structure, and phytopharmaceutical applications //Altern. Med. Rev.-2000.-Vol.5, №2.-P.144-151.
10. Halliwell B., Gutteridge J.M. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease//Biochem. J.-1984.-Vol.219, №1.-P.1-14.
11. Halliwell B. Antioxidants in human health and disease//Annu. Rev. Nutr.-1996.-Vol.16.-P.33-50.
12. Jessup W., Dean R.T., de Whalley C.V. et al. The role of oxidative modification and antioxidants in LDL metabolism and atherosclerosis//Adv. Exp. Med. Biol.-1990.-Vol.264.-P.139-142.
13. Juurlink B.H., Paterson P.G. Review of oxidative stress in brain and spinal cord injury: suggestions for pharmacological and nutritional management strategies// J. Spinal Cord. Med.-1998.-Vol.21, №4.-P.309-334.
14. Plumb G.W., De Pascual-Teresa S., Santos-Buelga C. et al. Antioxidant properties of catechins and proanthocyanidins: effect of polymerisation, galloylation and glycosylation//Free Radic. Res.-1998.-Vol.29, №4. P.351-358.
15. Re R., Pellegrini N., Proteggente A. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay//Free Radic.Biol. Med.-1999.-Vol.26, №9-10.-P.1231-1237.
16. Regoli F., Winston G.W. Quantification of total oxidant scavenging capacity of antioxidants for per-oxynitrite, peroxyl radicals, and hydroxyl radicals// Toxicol. Appl.Pharmacol.-1999.-Vol.156, №2.-P.96-105.
17. Shen Y., Sangiah S. Na+, R+-ATPase, guta-thione, and hydroxyl free radicals in cadmium chloride-induced testicular toxicity in mice//Arch. Environ. Con-tamin. Toxicol.-1995.-Vol.29, №2.-P.1774-1779.
18. Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu rea-gent//Methods Enzymol.-1999.-Vol.299.-P.152-178.
19. Spector A. Review: Oxidative stress and disease //J. Ocul. Pharmacol. Ther.-2000.-Vol.16, №2.-P.193-201.
20. Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization/ B.S.Sun,
C.Leandro, J.M.R da Silva, I.Spranger//J. Agric. Food Chem.-1998.-Vol.46, №4.-P.1390-1396.
21. Teissedre P.L., Landrault T. Wine phenolics: contribution to dietary intake and bioavailability//Food Res. Intern.-2000.-Vol.33, № 6.-P.461-467.
22. Young I.S., Woodside J.V. Antioxidants in health and disease//J. Clin. Pathol.-2001.-Vol.54, №3.-P.176-186.
