CC BY
123
Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 121-126.
УДК 615.322:577.16:615.272:014.425
АНТИРАДИКАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ КОРНЕВИЩ BERGENIA CRASSIFOLIA В РЕАКЦИИ С 2,2'-ДИФЕНИЛ-1-ПИКРИЛГИДРАЗИЛОМ
© A.B. Белый', Н.И. Белая
Донецкий национальный университет, ул. Университетская, 24, Донецк,
83000 (Украина), e-mail: [email protected]
Отработана методика получения полимерных фенольных соединений (дубильных веществ) с высокой антиок-сидантной активностью из корневищ бадана толстолистного методом мацерации под действием постоянного электрического тока с последующим фракционированием полученного экстракта. Установлены оптимальные условия электроэкстракции: напряжение - 35 В, плотность тока - 25 мА/см2, время экстрагирования - 60 мин при температуре 343 К, Показано, что экстракт корневищ бадана проявил намного большую антирадикальную активность в реакции со свободным стабильным радикалом 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ), чем экстракты, полученные традиционными методами горячей мацерации, Из представленного экстракта бадана выделена фракция дубильных веществ, которая при концентрации на порядок меньшей по сравнению с экстрактом, способна проявлять большую активность в реакции с радикалом ДФПГ,
Ключевые слова: дубильные вещества, антирадикальная активность, электроэкстракция, 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил,
Введение
Растительные полимерные фенольные соединения - дубильные вещества (ДВ) - являются перспективными ингибиторами процессов окисления органических веществ наравне со своими мономерными аналогами (фенолкарбоновыми, оксикоричными кислотами, флавоноидами), чья антиокислительная активность известна давно и широко исследуется [1-3]. Хотя антиокислительная способность ДВ мало изучена, что связано прежде всего с их сложной химической структурой, тем не менее данная группа веществ, имея ряд преимуществ перед простыми фенолами (хорошая растворимость в воде, высокое содержание в растительном дубильном сырье технического назначения, простота в получении), может быть во многих случаях разумной альтернативой мономерным фенольным антиоксидантам [4].
Основным способом выделения полимерных фенолов из растительного сырья является экстракция, однако количество традиционных методов экстракции ДВ ограничено и не предполагает получения веществ с антиоксидантными свойствами вследствие применения высоких температур в течение длительного времени.
Цель настоящей работы - отработка методики получения полимерных фенольных соединений (ФС) с высокой антиоксидантной активностью из дубильного сырья методом электроэкстракции с последующим фракционированием полученного экстракта.
БелыйАлександр Владимирович - доцент кафедры
физической химии, кандидат химических наук,
e-mail: [email protected]
Белая Наталья Ивановна - доцент кафедры физической
химии, кандидат химических наук,
e-mail: [email protected]
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования было выбрано дубильное сырье технического назначения -корневища бадана толстолистного Bergenia crassifolia семейства Saxifragaceae (производства ЗАО «Лектравы», г. Житомир), в состав которых
* Автор, с которым следует вести переписку,
входит до 25% дубильных веществ смешанного типа с преобладанием группы гидролизуемых соединений [5]. Экстрагентом служила дистиллированная вода как сильно полярный растворитель с высокой ионизирующей способностью. Размер частиц растительного сырья составлял до 2 мм в диаметре, соотношение сырье - экстрагент - 1 : 10. Экстракцию проводили методом мацерации под действием постоянного электрического тока. Для исследований был изготовлен электроэкстрактор в виде платинового стакана, представляющего собой анод, внутрь которого в качестве катода погружен цилиндрический сетчатый платиновый электрод, катод и анод подключались к стабилизированному источнику постоянного тока. Полученный жидкий водный экстракт фильтровали, высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 308±2 К в течение 3 чи использовали в сухом виде. Экстракты характеризовали по величине сухого остатка ^,о.), определенного методом гравиметрии. Фенольный состав извлечений исследовали качественно методом УФ-спектроскопии на СФ-2000 и количественно по содержанию дубильных веществ (ДВ) и суммарному количеству фенольных соединений (СФС) методом перманганатометрического титрования в реакции с раствором желатина и без него [6]. Антиокислительные свойства полученных водных экстрактов из корневищ бадана толстолистного изучали методом фотоколориметрии [7] на КФК-3 в реакции со свободным стабильным радикалом 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ) производства АШпсИ^^а. Реакция ДФПГ с экстрактами проводилась в растворе диметилсульфоксид - вода (1 : 2) при температуре 293±2 К. Оптимальная концентрация растительных экстрактов составляла 4-10-4 масс.% в пересчете на сухой остаток. Сухие экстракты растворяли в воде и добавляли к раствору диметилсульфоксида с концентрацией радикала ДФПГ 5,6-10-5 моль-л-1. Для количественной оценки антирадикальной активности (АРА) полученных извлечений использовали величину скорости реакции радикала ДФПГ с экстрактом корневищ бадана толстолистного в начальный момент времени (и). Значение и рассчитывали как разность между скоростью реакции ДФПГ с экстрактом в водной среде (и0) и скоростью реакции ДФПГ с водой ().
Величину скорости для исследуемых реакций определяли как тангенс угла наклона начального прямолинейного участка кинетической кривой (рис. 1).
Обсуждениерезультатов
Среди факторов, способных влиять на процесс электроэкстракции и качество полученного экстракта, были изучены напряжение электрического поля (и), плотность тока (), температура (Т) и продолжительность экстракции (/).
С целью выбора оптимального токового режима процесс экстракции проводили в постоянном электрическом поле при напряжении от 15 до 40 В и плотности тока на катоде от 10 до 30 мА/см2. Пропускание электрического тока через смесь вода - корневища бадана обеспечивает извлечение веществ из растительного сырья по принципу электродиализа. Перенос экстрагированных веществ в ионизированной форме идет под действием электрического тока через полупроницаемую мембрану, в качестве которой выступает стенка растительной клетки [8]. Для оценки эффективности экстракции под действием постоянного электрического тока ее результаты сравнивались с экстракцией дубильных веществ в тех же условиях без при -менения тока. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
Показано, что все исследуемые извлечения реагируют со свободным стабильным радикалом ДФПГ. Чем больше скорость реакции радикала ДФПГ с экстрактами (и), тем выше их АРА. Однако скорость реакции ДФПГ с экстрактами, полученными при разных токовых режимах, неодинакова и зависит от их фенольного состава. Обращает на себя внимание вид кинетических кривых расходования ДФПГ в реакции с представленными извлечениями (рис. 1): в начале реакции наблюдается резкое уменьшение количества ДФПГ, а потом в процессе реакции концентрация радикала снижается медленно. Это, вероятно, связано с тем, что в экстракте содержится смесь фенольных соединений (РЮИ) с разной антирадикальной активностью, поэтому в начале с ДФПГ реагируют фенолы с высокой активностью, а затем вещества с меньшей реакционной способностью [9]:
2,2-дифенил-1-пикрилгидразил
2,2-дифенил-1-пикрилгидразин
Таблица 1. Значения АРА и результаты количественного определения ^^.о., СФС и ДВ в водных экстрактах корневищ бадана, полученных методом электроэкстракции при разных токовых режимах 7=303 К, /=60 мин
Токовый режим АРА и-106, моль-л'1-с'1 Шс0., масс.% СФС, масс.% ДВ, масс.%
Напряжение и, В Плотность тока г, мА/см2
15 11 0,8 1,70 16,87 4,15
25 18 1,9 2,11 17,66 6,15
35 25 3,2 2,34 19,13 9,51
40 28 1,1 2,65 16,02 8,43
35 11 0,9 2,16 17,50 6,48
35 28 1,2 2,44 17,38 8,37
30 25 1,8 1,96 16, 54 6,25
40 25 1,4 2,58 17,64 8,19
без электрического тока 0,2 0,96 5,38 1,61
[ДФПГ] 1 о5, моль/л
Рис. 1. Кинетические кривые расходования ДФПГ в реакции с водным экстрактом корневищ бадана (С=4-10-4 масс.%), полученного методом электроэкстракции при разных токовых режимах: 1 - и = 35 В, г = 25 мА/см2; 2 - и = 30 В, г = 25 мА/см2; 3 - без электрического тока.
Т=293±2К
С увеличением напряжения электрического поля, равно как и плотности тока, наблюдается увеличение количества сухого остатка, СФС, ДВ и АРА экстракта (табл. 1). Это обусловлено тем, что под влиянием разности потенциалов ионы экстрагированных веществ типа электролитов ускоряют свое движение в середине растительных клеток. В результате происходит резкое увеличение внутренней молекулярной диффузии, лимитирующей скорость процесса экстракции в целом; возрастает выход ионов вещества из растительного материала на его поверхность. Примечательно, что с ростом и и г общее количество извлеченных веществ ^с.0.) постоянно возрастает, в то время как количество ФС и ДВ увеличивается до определенного значения, а затем начинает уменьшаться (табл. 1). По-видимому, при высоких токовых режимах ФС начинают подвергаться электрохимическому анодному окислению, в результате чего их содержание в экстракте падает. Дальнейший выбор оптимального токового режима проводился путем варьирования значений напряжения при фиксированной оптимальной плотности тока и наоборот (табл. 1).
Установлено, что, как и в предыдущем случае, наиболее высокие АРА и содержание ДВ имеет водный экстракт корневищ бадана, полученный при напряжении 35 Ви плотности тока 25 мА/см2.
Поскольку извлечение из растительного сырья высокомолекулярных ДВ всегда подразумевает высокие температуры, была сделана попытка увеличить выход полимерных фенолов за счет некоторого повышения температуры электроэкстракции. Установлено (табл. 2), что АРА (и) водных экстрактов корневищ бадана растет с увеличением температуры экстрагирования до 333 К, затем практически не изменяется и, начиная с 353 К скорость реакции полимерных фенолов экстракта с ДФПГ падает, по-видимому, за счет их термодеструкции. При этом в извлечениях, полученных при 333 и 343 К, АРА практически одинакова, а содержание ДВ увеличивается с ростом температуры.
Это может быть связано с экстрагированием при повышении температуры конденсированных дубильных веществ, антиокислительные свойства которых значительно меньше, чем у гидролизуемых танинов, содержащих больше функциональных фенольных ОН-групп в пересчете на одну молекулу. В общем по всем исследуемым характеристикам наилучший результат показал водный экстракт ДВ корневищ бада-на, полученный при Т=343 К.
Изучая влияние продолжительности электроэкстракции на количество извлеченных полимерных фенолов и их АРА, мы установили (табл. 3), что оптимальное время экстракции составляет 60 мин. Дальнейшее его увеличение приводит к резкому снижению реакционной способности полученных экстрактов в реакции с радикалом ДФПГ (рис. 2) за счет снижения содержания ДВ, по-видимому, из-за их окисления вследствие длительного температурного воздействия.
Таблица 2. Значения АРА и результаты количественного определения ^^.о., СФС и ДВ в водных экстрактах корневищ бадана, полученных методом электроэкстракции при разных температурах. и=35 В, г =25 мА/см2, /=60 мин
Температурный режим Т, К АРА, и-106, моль-л'1-с'1 Шс0., масс.% СФС, масс.% ДВ, масс.%
303 3,2 2,34 19,13 9,51
333 9,1 2,61 17,55 10,19
343 9,4 2,65 22,66 12,03
353 4,3 2,78 16,91 9,86
343 (без электрического поля) 2,4 2,58 16,77 8,53
Таким образом, экстракт корневищ бадана толстолистного с наибольшим содержанием ДВ, проявляющих выраженные антиокислительные свойства, был получен методом электроэкстракции водой при и = 35 В и плотности тока 25 мА/см2 в течение 60 мин при Т=343 К.
Для оценки вклада температуры (Т=343 К) и электрического поля в антирадикальную активность ДВ представленный экстракт сравнивали с извлечениями, полученными под действием постоянного тока без нагревания (при Т=303 К) и наоборот. Видно (табл. 2), что электрическое поле оказывает более существенное влияние на антиокислительные свойства экстракта, чем повышенная температура. Совмещение же этих двух физических факторов приводит к синергическому эффекту и позволяет извлечь дубильный экстракт, который по величине АРА значительно превосходит извлечения, полученные традиционными методами горячей одно- и многократной мацерации (табл. 4).
Однако представленный дубильный экстракт является суммарным извлечением всех веществ, в том числе и неантиоксидантов, содержащихся в корневищах бадана. Вследствие этого эффективная антиоксидантная концентрация такого препарата будет явно высокой, что не всегда допустимо при стабилизации пищевых продуктов, косметических препаратов и т.д. В связи с этим полученный водный экстракт далее подвергали фракционированию с использованием растворителей с возрастающей полярностью: петролей-ный эфир - диэтиловый эфир - этилацетат - н-бутанол. В этом случае хлорофилл, смолы и большинство каротиноидов не переходят в экстракт, однако экстракция фенольных соединений из водного слоя осуществляется более длительно и менее полно. Поэтому извлечение фенольных соединений проводилось не менее 10 раз при соотношении экстракт - растворитель 1 : 1. Дальнейшее увеличение кратности экстракции не приводит к росту выхода экстрагируемых веществ.
Показано (табл. 5), что петролейная фракция имеет наименьший выход экстрагируемых веществ, которые могут быть представлены различными липофильными нефенольными соединениями, экстрагируемыми эфиром [6]. Как и ожидалось, данная фракция не проявила антирадикальных свойств в реакции с ДФПГ.
С большим выходом экстрагируемых веществ получена этилацетатная фракция, поскольку этилацетат способен извлекать гликозиды флавоноидов, в частности рутина, и частично полимерные фенолы [10].
Более представительна диэтиловая фракция, ее выход составил 10,4%. Это объясняется способностью ди-этилового эфира экстрагировать большое количество веществ, таких как галловая кислота, агликоны большинства флавоноидов (кемпферол, кверцетин, апигенин, лютеолин), а также фенолы простого строения, например, арбутин содержание которого в корневищах бадана толстолистного до 22% [10]. И, как следствие этого, выявлена более высокая активность диэтиловой фракции по сравнению с этилацетатной в реакции с ДФПГ (табл. 5).
Таблица 3. Значения АРА и результаты количественного определения ^^.о., СФС и ДВ в водных экстрактах корневищ бадана, полученных методом электроэкстракции при разной продолжительности экстрагирования. и=35 В, г =25 мА/см2, 7=343 К
Время экстракции, мин АРА, и-106, моль-л'1-с'1 Шс.0., масс.% СФС, масс.% ДВ, масс.%
60 9,4 2,65 22,66 12,03
90 2,8 2, 70 14,89 6,28
120 1,9 2, 73 13,10 5,24
Таблица 4. Значения АРА и результаты количественного определения ^^.о., СФС и ДВ в водных экстрактах корневищ бадана, полученных разными экстракционными методами
Метод экстракции АРА, -и-106, моль-л'1-с'1 Шс0., масс.% СФС, масс.% ДВ, масс.%
Электроэкстракция 9,4 2,65 22,66 12,03
Однократная мацерация (Т=373 К, 1=300 мин) 4,1 2,78 11,94 9,26
3-кратная мацерация (Т=373 К, 1=30 мин) 2,8 4,17 9,82 5,28
Таблица 5. Антирадикальная активность фракций водного экстракта корневищ бадана толстолистного в реакции с радикалом ДФПГ
Фракция Выход, масс.% С, масс.% АРА, и-106, моль-л'1-с'1
Петролейная 1,8 4-10-4 -
Диэтиловая 10,4 4-10-4 1,6
Этилацетатная 2,6 4-10-4 0,4
н-бутанольная 24,8 4-10-5 9,8
Экстракт - 4-10-4 9,4
Наконец, н-бутанольная фракция получена с самым большим выходом 24,8%. н-бутанол способен извлекать полигликозидные соединения и дубильные вещества различного строения [10]. УФ-спектр фракции (рис. 3) имеет один максимум при длине волны 280 нм, что характерно для ДВ смешанного типа [6]. Достаточно небольшая ширина полосы поглощения с выраженным максимумом является показателем индивидуальности соединений. Сравнивая УФ-спектры (рис. 3) экстракта и фракции ДВ корневищ бадана, можно видеть, что при Хтах=280 нм интенсивность поглощения фракции намного больше, а значит, и количество ДВ на единицу массы всех экстрактивных соединений также будет выше, чем в экстракте. Это явно подтверждается более высокой величиной АРА н-бутанольной фракции ДВ, которая при концентрации, на порядок меньшей по сравнению с экстрактом, проявляет большую активность в реакции с ДФПГ (табл. 5).
Полученная фракция ДВ корневищ бадана толстолистного с высокими антиокислительными свойствами может быть использована как в виде биологически активной добавки, так и в качестве пищевого антиоксиданта в сухих продуктах, жидких композициях, таких как сиропы, витаминные соки, напитки, пюре.
Рис. 2. Кинетические кривые расходования ДФПГ в реакции с водным экстрактом корневищ бадана (С=4-10-4 масс.%), полученного методом электроэкстракции в течение: 1 - 60 мин, 2 -90 мин, 3 - 120 мин. Т = 293±2 К
Рис. 3. УФ-спектры водного экстракта корневищ бадана (1) и н-бутанольной фракции дубильных веществ (2) в ДМСО при С=1,5-10-6 масс.%. 7=293±2 К
Выводы
1. Отработана методика получения экстракта с высокой антиокислительной активностью из корневищ бадана толстолистного путем электроэкстракции водой при напряжении 35 В, плотности тока 25 мА/см2 в течение 60 мин при температуре 343 К.
2. Установлено, что электрическое поле оказывает более существенное влияние на антиокислительные свойства экстракта, чем повышенная температура. Совмещение этих двух физических факторов приводит к синергическому эффекту.
3. Показано, что водный экстракт корневищ бадана проявил антирадикальную активность в реакции с ДФПГ намного большую, чем экстракты, полученные традиционными методами горячей мацерации.
4. Из представленного водного экстракта бадана выделена фракция ДВ, которая при концентрации, на порядок меньшей по сравнению с экстрактом, способна проявлять большую активность в реакции с ДФПГ.
Список литературы
1. Amensour М., Sendra E., Perez-Alvarez J.A., Skali-Senhaji N., Abrini J., Fernandez-Lopez J. Antioxidant Activity and Chemical Content of Methanol and Ethanol extracts from Leaves of Rockrose (Cistus ladaniferus) // J. Planet foods for human nutrition. 2010. Vol. 65, N2. Pp. 170-178.
2. Giovanelli G. Evaluation of the antioxidant activity of red wines in relationship to their phenolic content // Ital. J. Food Sci. 2005. Vol. 17, N4. Pp. 381-393.
3. Luo X.-D., Basile M.J., Kennelly E.J. Polyphenolic Antioxidants from the Fruits of Chrysophyllum cainito L. (Star Apple) // J. Agric. Food Chem. 2002.Vol. 50, N6. Pp. 1379-1382.
4. Hagerman A.E., Reidl K.M., Jones G.A., Sovik K.N., Ritchard N.T., Hartzfeld P.W., Riechel T.L. High molecular weight plant polyphenolics (tannins) as biological antioxidants // J. Agric. Food Chem. 1998. Vol. 46. Pp. 1887-1892.
5. Лавренов B.K., ЛавреноваГ.В. Полная энциклопедия лекарственных растений. СПб.; М., 1999. Т. 1. 734 с.
6. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М., 1977. 239 с.
7. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина Е.М. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М., 1975. 213 с.
8. Кондратьева Т.С., Иванова Л.А., Зеликсон Ю.И. и др. Технология лекарственных средств. М., 1991. Т. 2. 500 с.
9. Филиппенко T.A., Белая Н.И., Николаевский А.Н. Фенольные соединения растительных экстрактов и их активность в реакции с дифенилпикрилгидразилом // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38, №8. С. 34-36.
10. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 213 с.
Поступило в редакцию 23 августа 2011 г.
Belyi A. V. *, Belaia N.I. THE ANTIRADICAL ACTIVITY OF TANNINS OF BERGENIA CRASSIFOLIA RHIZOMES IN REACTION WITH 2,2-DIPHENYL-1-PICRYLHYDRAZYL
Donetsk National University, st. Universitetskaia, 24, Donetsk, 83000 (Ukraine), e-mail: [email protected]
Methods of preparation of polymeric phenolic compounds (tannins) with high antioxidant activity from the rhizomes Bergenia crassifolia by maceration under AC power, followed by fractionation of this extract worked. Optimal conditions electroextraction installed - the voltage of 35 V, the current density is 25 mA/cm2, extraction time 60 min at 343 K. The extract Bergenia rhizomes showed much higher antiradical activity in the reaction with the free stable radical 2,2'-diphenyl-1-pikrilgidrazilom (DPPH) than the extracts obtained by the traditional methods of hot maceration was shown. Fraction of tannins isolated from Bergenia extract submitted that at concentrations an order of magnitude lower compared with the extract, can be more active in response to the radical DPPH.
Keywords: tanins, antiradical activity, electroextraction, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.
References
1. Amensour M., Sendra E., Perez-Alvarez J.A., Skali-Senhaji N., Abrini J., Fernandez-Lopez J. J. Planet foods for human nutrition, 2010, vol. 65, no. 2. pp. 170-178.
2. Giovanelli G. Ital. J. Food Sci., 2005, vol. 17, no. 4, pp. 381-393.
3. Luo X.-D., Basile M.J., Kennelly E.J. J. Agric. Food Chem., 2002, vol. 50, no. 6, pp. 1379-1382.
4. Hagerman A.E., Reidl K.M., Jones G.A., Sovik K.N., Ritchard N.T., Hartzfeld P.W., Riechel T.L. J. Agric. Food Chem., 1998, vol. 46, pp. 1887-1892.
5. Lavrenov V.K., Lavrenova G.V. Polnaia entsiklopediia lekarstvennykh rastenii. [Complete Encyclopedia of Medicinal Plants] St. Petersburg; Moscow, 1999, vol. 1, 734 p. (in Russ.)
6. Blazhei A., Shutyi L. Fenol’nye soedineniia rastitel’nogo proiskhozhdeniia. [Phenolic compounds of plant origin]. Moscow, 1977, 239 p. (in Russ.)
7. Burlakova E.B., Alesenko A.V., Molochkina E.M. Bioantiaksidanty v luchevom porazhenii i zlokachestvennom roste.
[Bioantiaksidanty in radiation damage and malignant growth]. Moscow, 1975. 213 p. (in Russ.)
8. Kondrat'eva T.S., Ivanova L.A., Zelikson Iu.I. Tekhnologiia lekarstvennykh sredstv. [Technology medicines]. Moscow,
1991, vol. 2, 500 p. (in Russ.)
9. Filippenko T.A., Belaia N.I., Nikolaevskii A.N. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal, 2004, vol. 38, no. 8, pp. 34-36. (in Russ.)
10. Zaprometov M.N. Osnovy biokhimii fenol’nykh soedinenii. [Fundamentals of Biochemistry of phenolic compounds]. Moscow, 1974, 213 p. (in Russ.)
Received August 23, 2011
* Corresponding autor.
