CC BY
195
УДК 579.864:577.121
Н. С. Карамова, Р. Э. Хабибуллин, С. А. Жакслыкова, Н. Б. Мирошник, О. А. Решетник
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОМЫШЛЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК
Ключевые слова: свободные радикалы, промышленные бактериальные закваски, лактобациллы, антиоксидантная активность (АОА).
Антиоксидантные свойства четырех промышленных бактериальных заквасок (Christian Hansen Safe Pro B-LL-20, Christian Hansen Bactoferm F-SC-111, Schaller Start Star, Danisco Texel DCM-1) и препарата «Лактобакте-рин» были исследованы с использованием метода ингибирования стабильного свободного радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ). Установлено, что исследованные образцы (культуральная жидкость, интактные клетки, внутриклеточный экстракт), приготовленные на разных стадиях роста микроорганизмов, проявляют различный уровень антиоксидантной активности. Показано, что интактные клетки (ИК) и внутриклеточный экстракт (ВКЭ) наиболее активно ингибируют свободные радикалы ДФПГ на 24-й час культивирования микроорганизмов (антирадикальная активность для ИК составила 32-38%, для ВКЭ - 1424%). Наивысшая антирадикальная активность обнаружена для культуральной жидкости (КЖ) промышленных бактериальных заквасок Chr.Hansen Bactoferm F-SC-111, Schaller Start Star, Danisco Texel DCM-1 (92%) на 6-й час культивирования микроорганизмов.
Key words: free radicals, bacterial starter cultures, lactobacilli, antioxidant activity (AOA).
Antioxidant activity of four bacterial starter cultures and preparation "Lactobacterin" was studied by the scavenging of 1,1-diphenyl- 2-picryl hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. The results obtained show that samples of intact cells, cells free supernatant and intracellular extract prepared at the different growth stages of bacterial starter cultures possess different AOA. Intact cells and intracellular extract exhibited the higher free radical scavenging activity at the 24th hour of the cultivation. The AOA ranged from 32 to 38% for intact cells and 14-24% for intracellular extract. The greatest AOA (92%) was found for the cell free supernatant of bacterial starter cultures Chr. Hansen Bactoferm F-SC-111, Schaller Start Star, Danisco Texel DCM at the 6th hour of growth.
Введение
Актуальность проблемы свободнорадикаль-ных процессов, протекающих в тканях человека, наряду с экологическими проблемами и общей низкой культурой питания, вызывает необходимость поиска новых форм пищи с антиоксидантной активностью.
В настоящее время наблюдается растущий интерес к исследованию роли активных форм кислорода (АФК) в ряде патологических процессов. Генерация АФК различных форм связана как с нормальными метаболическими процессами, так и с загрязнением окружающей среды. АФК, образующиеся in vivo, включают в себя супер-оксидный радикал (O2-), перекись водорода (Н2О2) и гидроксиль-ный радикал (•ОН). Кроме АФК, свой вклад в генерацию свободных радикалов вносят реакционноспо-собные формы азота, в том числе оксид азота (NO), пероксинитрит (NO3-) и S-нитрозотиолы [1].
При чрезмерном накоплении АФК, перокси-дов и их вторичных продуктов возникает окислительный стресс, сопровождающийся нарушением структуры и функций мембран клеток, модифицированием белков, ДНК и липидов. Окислительный стресс играет ключевую роль в развитии ряда хронических заболеваний, таких как диабет, нейродеге-неративные, сердечно-сосудистые и онкологические заболевания [2-4].
Микроорганизмы обладают системами анти-оксидантной защиты, которые позволяют регулировать уровень свободных радикалов и предотвращать их повреждающее воздействие на клетки [5]. Анти-оксидантная ферментная система микроорганизмов, состоящая из каталазы, пероксидазы, супероксид-
дисмутазы (СОД), а также различных субстратов, участвующих в нейтрализации свободных радикалов, позволяет рассматривать ее в качестве экзогенной антиоксидантной защиты макроорганизмов, в частности, организма человека.
В последнее время появились данные, свидетельствующие об антиоксидантных и антигеноток-сических свойствах молочнокислых микроорганизмов, в частности, рода Lactobacillus [6-12, 21.]
Молочнокислые бактерии обладают выраженной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [13-16], что обусловлено их способностью продуцировать биологически активные вещества, обладающие бактерицидным и бактериостатическое действием на нежелательную микрофлору. Они широко используются в производстве различных продуктов питания животного и растительного происхождения (мясные продукты, хлеб, сыр, кисломолочные продукты и др.).
Коллективом авторов ведутся исследования влияния молочнокислой экзогенной ферментации на различные свойства вторичного мясного сырья, в частности, говяжьих субпродуктов второй категории. Ранее были получены положительные результаты с точки зрения повышения их функционально-технологических и органолептических свойств, желательных микроструктурных изменений ферментированного сырья, показана высокая антагонистическая активность используемых штаммов и заквасок в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [17-20]. Кроме того, была изучена антирадикальная активность штамма Lactobacillus acidophilus n.v.Ep. 317/402 [21].
В связи с этим целью настоящего исследования явилась оценка антиоксидантной активности (АОА) микроорганизмов, входящих в состав лиофи-лизированных бактериальных заквасок, используемых в качестве стартовых культур для производства сыровяленых и сырокопченых колбас, а также штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3 из состава препарата «Лактобактерин».
Материалы и методы исследований
Бактериальные препараты
Объектом исследования служили лиофильно высушенные бактериальные препараты:
а) закваски, используемые в качестве стартовых культур в технологическом процессе производства сыровяленых и сырокопченых колбас:
1) Christian Hansen Safe Pro B-LL-20 (содержат в составе Pediococcus acidilactici);
2) Christian Hansen Bactoferm F-SC-111 (Staphylococcus carnosus; Lactobacillus sakei);
3) Schaller Start Star (Lactobacillus curvatus, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus carnosus);
4) Danisco Texel DCM-1 (Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus);
б) препарат «Лактобактерин» (Lactobacillus plantarum 8P-A3).
Все описанные препараты предварительно ресуспендировали и поддерживали на питательной среде Мана - Рогоза - Шарпа (МРС).
Определение фаз роста бактериальных культур
0,1 г лиофилизированных бактериальных заквасок вносили в 10 мл бульона МРС. 100 мкл бактериальной суспензии затем переносили в 10 мл бульона МРС и инкубировали в течение 18 ч при 37°C. Ночную культуру разбавляли бульоном МРС до конечной оптической плотности (OD) 0,05 ± 0,005 и выращивали при 37°C в течение 30 ч. Оптическую плотность клеточной суспензии OD (X = 600 нм) контролировали спектрофотометрически.
Количественную характеристику роста микроорганизмов осуществляли по удельной скорости роста д, значение которой в каждый момент времени рассчитывается по формуле: 1 d
н = -—, (1)
х dT
где ^ - удельная скорость роста, ч-1, x - концентрация биомассы в момент времени t, г • дм-3.
Интегрирование формулы (1) позволяет рассчитать удельную скорость роста за определенные промежутки времени:
I Х2
In—
Н
1
х2 Х.|
ср
_ _ (2) Г2 Т1 Хср Т2 Т1
где X! и х2 - концентрации биомассы в начальный и конечный момент времени; хср- средняя концентрация биомассы в интервале времени (т2-т-|).
Оценка АОА бактериальных препаратов
Подготовка образцов
Ночную культуру разбавляли бульоном МРС до конечной оптической плотности (OD) 0,05 ± 0,005 и выращивали при 37°C в течение 30 ч. с аэрацией. Отбирали пробы на 6-й ч и 24-й ч культивирования, что соответствовало экспоненциальной и стационарной фазам роста бактериальных культур.
Антиоксидантную активность определяли в следующих образцах:
1) интактные клетки (ИК) осаждались из пробы центрифугированием (15 мин при 5000 g), затем дважды отмывались и ресуспендировались в 0.2М фосфатном буфере с рН 7.0.
2) культуральная жидкость (КЖ) оставалась после осаждения биомассы клеток.
3) внутриклеточный экстракт (ВКЭ) получали путем ультразвуковой дезинтеграции части полученных ИК в фосфатном буфере (10 серий длительностью 30 с, перерывы между сериями 30 с) с последующим удалением фрагментов клеток путем центрифугирования (10 мин при 10000 g при температуре 4°С).
Антиоксидантную активность бактериальных культур оценивали согласно методу Главинда [22] по ингибированию свободного радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила. Раствор ДФПГ в этаноле имеет фиолетовый цвет с максимумом поглощения при 517 нм. В результате восстановления свободного радикала ДФПГ антиоксидантом интенсивность фиолетовой окраски ДФПГ снижается, что контролируется спектрофотометрически по изменению оптической плотности (OD) раствора при 517 нм.
0.1 мМ ДФПГ в этаноле смешивали с исследуемым образцом в соотношении 1:1, тщательно перемешивали и смесь оставляли на 30 мин в темноте, затем определяли OD раствора.
Антиоксидантный эффект оценивали по проценту ингибирования свободных радикалов ДФПГ, рассчитанному как отношение изменения OD спиртового раствора ДФПГ при добавлении исследуемых образцов.
АОА= [(Ac - Ai) / Ac] х 100%,
где АОА - антирадикальная активность, %; Ac - OD контрольных образцов; Ai - OD раствора ДПФГ после добавления исследуемого образца.
В качестве контролей использовали раствор ДФПГ со средой МРС для определения АОА куль-туральной жидкости и ДФПГ с фосфатным буфером - для супернатанта и интактных клеток.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов проводили, используя программу Microsoft Excel. Приведенные в работе данные представляют собой среднее значение трех повторностей эксперимента ± среднеквадратичное отклонение. Достоверность различий между группами данных считали, используя t-критерий Стьюдента [23]. Различия считались достоверными при Р < 0.05.
Результаты исследований и их обсуждение
Динамика роста бактериальных заквасок и штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3 представлены на рис. 1. По этим кривым по формуле (2) были рассчитаны значения удельных скоростей роста микроорганизмов ц, и их распределение по фазам представлено на рис.2 на примере бактериального штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3.
4 8 12 16 20 —Chr. Hansen Safe Pro B-LL-20
— Chr. Hansen Bactoferm F-SC-111 Schaller Start Star
— Danisco Texel DCM-1
— Lactobacillus plantarum 8P-A3
Рис. 1 - Кривые роста штаммов и заквасок
Рис. 2 - Удельная скорость роста Lactobacillus plantarum 8P-A3
Как видно из рис. 2, максимальная ц наблюдается на 4-8 ч роста, что справедливо и для всех остальных исследованных заквасок. Примерно к 14 часу культивирования микроорганизмы переходят в стационарную фазу роста (для всех исследованных бактериальных заквасок). В связи с этим АОА всех препаратов оценивали на 6-й и 24-й ч культивирования, что соответствует экспоненциальной и стационарной фазам роста.
Значения АОА бактериальных заквасок и штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3 в двух различных фазах роста представлены на рисунке 3.
Из представленных результатов видно, что внутриклеточный экстракт микроорганизмов, находящихся в экспоненциальной фазе роста, вызывает слабое ингибирование свободных радикалов ДФПГ (АОА менее 10%). АОА интактных клеток несколь-
ко выше - до 21%. Наивысшей антиоксидантной активностью (92%) обладала культуральная жидкость промышленных бактериальных заквасок Chr.Hansen Bactoferm F-SC-111, Schaller Start Star, Danisco Texel DCM-1.
cR <
О <
Экспоненциальная фаза
100% 80% 60%% 40% 20%% 0%
КЖ
□ ИК
□ ВКЭ
IbU
Бактериальные препараты
S <
О
С 100%%
80%% 60%% 40%% 20%% 0%%
Стационарная фаза
КЖ
□ ИК
□ ВКЭ
Бактериальные препараты
Рис. 3 - АОА исследованных препаратов в различных фазах роста (1- Chr. Hansen Safe Pro B-LL-20, 2- Chr. Hansen Bactoferm F-SC-111, 3-Schaller Start Star, 4- Danisco Texel DCM-1, 5-Lactobacillus plantarum 8P-A3, КЖ - культураль-ная жидкость, ИК - интактные клетки, ВКЭ -внутриклеточный экстракт)
В стационарной фазе роста происходит некоторое повышение АОА образцов интактных клеток (до 24%) и внутриклеточного экстракта (до 38%) бактериальных заквасок. Образцы культуральной жидкости также сохраняли достаточно высокую антирадикальную активность (78-86%).
Сравнительный анализ антиоксидантной активности бактериальных культур разного возраста показывает, что наиболее активное ингибирование свободного радикала ДФПГ интактными клетками и внутриклеточным экстрактом происходило в стационарной фазе культивирования микроорганизмов. Однако наивысшая антирадикальная активность (92%) обнаружена для культуральной жидкости микроорганизмов из промышленных бактериальных заквасок и Lactobacillus plantarum 8P-A3 уже на 6-й час инкубирования, т.е в экспоненциальную фазу роста.
Ранее исследованиями ряда авторов была показана антиоксидантная активность молочнокислых микроорганизмов in vitro [24-26, 28]. Известно, что защита молочнокислых бактерий от повреждающего действия АФК прежде всего происходит
1
time, h
путем образования фермента супероксиддисмутазы [29], которая нейтрализует супероксид-радикалы кислорода. Более того, некоторые молочнокислые бактерии могут также производить неферментативные антиоксиданты, такие как глутатион, тиоредок-син и глутарредоксин для снижения реактивных интермедиатов кислорода [30, 31]. Ранее уже сообщалось, что нейтрализация различных типов АФК считается одним из основных механизмов антиок-сидантной защиты молочнокислых бактерий [27].
Представленные в данной работе данные свидетельствуют о том, что микроорганизмы, входящие в состав промышленных бактериальных заквасок и штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3, также обладают антиоксидантным потенциалом, оказывая антирадикальное действие в отношении стабильного свободного радикала ДФПГ. Высокая АОА (92%) культуральной жидкости микроорганизмов, входящих в состав исследованных промышленных бактериальных заквасок, позволяет предположить, что в данном случае ключевым звеном в противоокислительной защите являются внеклеточные антиоксиданты.
Заключение
Молочнокислые микроорганизмы, входящие в состав всех исследованных бактериальных заквасок, обладают антиоксидантно активностью, что проявляется в ингибировании свободного радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила in vitro.
Антиоксидантная активность зависит от возраста бактериальных культур. Культуральная жидкость всех исследованных заквасок проявляет самую высокую антиоксидантную активность (до 92%) в экспоненциальной фазе роста, тогда как внутриклеточный экстракт - в стационарной фазе культивирования микроорганизмов (АОА до 38%).
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования исследованных бактериальных препаратов в пищевой промышленности, как источников антиоксидантных комплексов для защиты организма от негативных последствий воздействия свободных радикалов.
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров, за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект 14-83).
Литература
1. Kumar Hemant, Lim Hyung-Woo, More Sandeep Vasant, Kim Byung-Wook, Koppula Sushruta, Kim In Su, and Choi Dong-Kug (2012): The Role of Free Radicals in the Aging Brain and Parkinson's Disease: Convergence and Parallelism, Int J Mol Sci. 2012; 13(8): 10478-10504.
2. Ames, B. N.; Shigenaga, M. K.; Hagen, T. M. (1993): Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 7915-7922.
3. Martinez-Cayuela, M. (1995). Oxygen free radicals and human disease. Biochimie, 77, 147-161.
4. Battino, M., P. Bullon, M. Wilson and H. Newman. 1999. Oxidative injury and challenge of antioxidants to free radicals and reactive oxygen species. Critical Rev. Oral Biol. Med. 10:458-476.).
5. Farr, S. B. and T. Kogoma. 1991. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol. Rev. 55:561-585.
6. L.J. Fooks, R. Fuller, G.R. Gibson, Int. Dairy J.,9, 53-61 (1999).
7. A. Duda-Chodak, T. Tarko, M. Statek, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment., 7, 4,39-5 (2008).
8. V. I. Chalova, Journal of Environmental Science and Health, Part B, 43, 193 — 198 (2008).
9. A.N. Wang, X.W. Yi, H.F. Yu, B. Dong and S.Y. Qiao, Journal of Applied Microbiology, 107, 1140-1148 (2009).
10. A. Mandal, .T.Paul, S.Roy, S.Mandal, S. Pradhan, K.Ch. Mondal, D.K. Nandi, Indian J Exp Biol., 51,2, 174-80 (2013).
11. М. Ito, K.Ohishi, Y.Yoshida, W.Yokoi and H.Sawada. 2003. Antioxidative effects of lactic acid bacteria on the co-lonic mucosa of iron-overloaded mice. J. Agric. Food Chem. 51:4456-4460.
12. Lin, M.Y. and C.L. Yen. 1999. Antioxidative ability of lactic acid bacteria. J. Agric. Food Chem. 47:1460-1466.
13. S. Salminen, E. Isolauri, E. Salminen, Antonie van Leeu-wenhoek, 70, 347-358 (1996).
14. A.L. Servin, FEMS microbiology reviews, 28, 405-440 (2004)
15. В K. Nomoto, J. Biosci. Bioeng., 100, 583-592 (2005).
16. C.R.Soccol, L.P. de Souza Vandenberghe, M.R. Spier, A.B.P. Medeiros and C.T. Yamaguishi et al., Food Technol. Biotechnol., 48, 413-434 (2010).
17. С.А. Жакслыкова, Р.Э. Хабибуллин, Г.Ю. Яковлева, О.А. Решетник Вестник Казанского технологического университета, 17, 152-155 (2014).
18. Р.Э. Хабибуллин, Х.Р.Хусаинова, Э.И.Минивалеева, О.А. Решетник, Вестник Казанского технологического университета, 16, 187-194 (2011).
19. Р.Э. Хабибуллин, М.С.Ежкова, Э.И.Минивалеева, О.А. Решетник, Вестник Казанского технологического университета, 15, 189-194 (2011).
20. Р.Э. Хабибуллин, Х.Р.Хусаинова, Э.И.Минивалеева, О.А. Решетник, Вестник Казанского технологического университета, 16, 203-209 (2011).
21. Н.С. Карамова, Р.Э. Хабибуллин Вестник Казанского технологического университета, 16, 127-129 (2013).
22. J. Glavind, Antioxidants in animal tissue. Acta chemica scandinavica, vol. 17, pp. 1635-1640, 1963.
23. Г.Ф.Лакин Биометрия. М:Высшая школа, 1990 - 350 с.
24. H.S. Kim, H.S. Chae, S.G. Jeong, J.S. Ham, S.K. Im, C.N. Ahn and J.M. Lee, Asian-Aust. J. Anim. Sci., 19, 2, 262-265 (2006).
25. Klayraung Srikanjana, Okonogi Siriporn. Antibacterial and antioxidant activities of acid and bile resistant starins of Lactobacillus fermentum isolated from Miang. Brazilian Journal of Microbiology (2009) 40: 757-766.
26. Li S., Zhao Y., Zhang L., Zhang X., Huang L., Li D., Niu C., Yang Z., Wang Q. Antioxidant activity of Lactobacillus plantarum strains isolated from traditional Chinese fermented foods. Food Chem. 2012. 135(3):1914-9.
27. Namiki, M. 1990. Antioxidants/antimutagens in foods. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 29:273-300.
28. Kullisaar, T., Zilmer, M., Mikelsaar, M., Vihalemm, T., Annuk, H., Kairane, C. and Kilk, A. (2002) Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics. Int J Food Microbiol 72, 215-224.
29. Stecchini, M.L., del Torre, M. and Munari, M. (2001) Determination of peroxyl radical-scavenging of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 64, 183-188.
30. de Vos, W.M. (1996) Metabolic engineering of sugar ca-tabolism in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 70, 223-242.
31. Knauf, H.J., Vogel, R.F. and Hammes, W.P. (1992) Cloning, sequencing and phenotypic expression of katA, which encodes the catalase of Lactobacillus sakei LTH677. Appl Environ Microbiol 58, 832-839.
© Н. С .Карамова - канд. биол. наук, доц. каф. микробиологии К(П)ФУ, nskaramova@mail.ru; Р. Э. Хабибуллин - канд. техн. наук, доц. кафедры ТММП КНИТУ, hrustik@yandex.ru; С. А. Жакслыкова - аспирантка каф. ТПП КНИТУ, saniyushka@inbox.ru; Н. Б. Мирошник - студентка каф. микробиологии К(П)ФУ, tashaa777@mail.ru; О. А. Решетник - д-р техн. наук, проф., заведующая каф. ТПП КНИТУ, reshetnik@kstu.ru.
© N. S. Karamova - Associate professor, Ph.D, Department of microbiology, Kazan (Volga region) Federal University, nskaramova@mail.ru; R. E. Khabibullin - Associate professor, Ph.D, Department of Meat and Milk Products technology, Kazan National Research Technological University, hrustik@yandex.ru; S. A. Zhackslykova -post graduate student, Department of Food Processing technology, Kazan National Research Technological University, saniyushka@inbox.ru; N. Miroshnik - student, Department of microbiology, Kazan (Volga region) Federal University, tashaa777@mail.ru; O. A. Reshetnik - Professor, Dr. of Tech. Sciences, Head of Department of Food Processing technology, Kazan National Research Technological University, reshetnik@kstu.ru.
