CC BY
111
МИКРОНУТРИЕНТЫ В ПИТАНИИ
Для корреспонденции
Черноусова Инна Владимировна - кандидат технических наук, старший научный сотрудник отдела аналитических исследований и инновационных технологий ГБУ Республики Крым «Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина "Магарач"»
Адрес: 298600, Республика Крым, г. Ялта, ул. Кирова, д. 31 Телефон: (978) 706-80-85 E-mail: chernblack@mail.ru
А.М. Авидзба1, А.В. Кубышкин2, Т.И. Гугучкина3, В.А. Маркосов3, А.М. Кацев2, Н.В. Наумова2, Ю.И. Шрамко2, Г.П. Зайцев1, И.В. Черноусова1, Ю.А. Огай1, И.И. Фомочкина2
Антиоксидантная активность продуктов переработки красных сортов винограда «Каберне-Совиньон», «Мерло», «Саперави»
The antioxidant activity of the products of processing of red grape of Cabernet Sauvignon, Merlot, Saperavi
A.M. Avidzbai, A.V. Kubyshkin2, T.I. Guguchkinas, V.A. Markosovs, A.M. Katsev2, N.V. Naumova2, Yu.I. Shramko2, G.P. Zaytsev2, I.V. Chernousova1, Yu.A. Ogay1, I.I. Fomochkina2
1 ГБУ Республики Крым «Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина "Магарач"», Ялта
2 Медицинская академия им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», Симферополь
3 ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства», Краснодар
1 National Research Institute for Grape and Wine «Magarach», Yalta
2 Medical Academy of V.I. Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol
3 North Caucasian Regional Research Institute of Horticulture and Viticulture, Krasnodar
В статье представлены экспериментальные данные по антиоксидан-тной активности сока, вина и концентратов из винограда «Каберне-Совиньон», «Мерло» и «Саперави» Крыма и Краснодарского края. Флавоноиды представлены антоцианами в форме гликозидов дельфи-нидина, мальвидина, цианидина, петунидина, пеонидина, а также кверцетином и его гликозидом, (+)-Б-катехином, (-)-эпикатехином. В значительном количестве присутствуют олигомерные процианидины, представляющие собой конденсированные катехиновые единицы (2-6), растворимые в воде, а также полимерные процианидины с количеством катехиновых единиц более 7, не растворимые в воде, которые составляют основную часть полифенолов вина и концентратов из красных сортов винограда (в соке отсутствуют). Среди нефлавоноидных полифенолов идентифицированы оксибензойные (галловая, сиреневая) и оксикоричные (кафтаровая, каутаровая) кислоты, относительное содержание которых в сумме полифенолов максимально в соке, минимально в концентратах. Установлено, что независимо от вида продукта показатель антиокси-дантной активности в стандартных единицах тролокса (Тго1ох) можно
Вопросы питания. Том 85, № 1, 2016 99
оценить по уравнению: Y=0,53627+0,1395X+0,080439X2-0,00064708X3 с коэффициентом корреляции r=0,9952; где: Y - антиоксидантная активность, г/дм3 в пересчете на тролокс; X - массовая концентрация фенольных веществ по Фолину-Чокальтеу, г/дм3. Уравнение справедливо при Y=0,76-196,22; Х=1,0-82,67. Результаты биотестирования виноматериалов «Каберне-Совиньон», «Мерло», «Саперави» и полифе-нольных концентратов «Эноант», «Эноант Премиум», «Фэнокор» на биологической модели биолюминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi Sh1 показали достоверность биотеста для оценки антиокси-дантной активности, которая хорошо коррелирует как с величинами концентраций полифенолов, так и с показателем антиоксидантной активности в единицах тролокса.
Ключевые слова: полифенолы винограда, антиоксидантная активность, биотестирование, биолюминесцентные бактерии, вино, концентраты винограда
Experimental data on the antioxidant activity of grape juice, grape concentrates and wine from grapes of Cabernet Sauvignon, Merlot and Saperavi from Crimea and Krasnodar regions was presented. Flavonoids are presented in the form of glycosides of such anthocyanins as delphinidin, malvidin, cyanidin, petunidin, peonidin and also by quercetin and its glycoside, (+)-D-catechin and (-)-epicatechin. Oligomeric procyanidins, which are condensed catechol units (2-6) soluble in water, are presented in significant amounts, and polymeric procyanidins with the amount catechin units greater than 7, insoluble in water, constituted the bulk of polyphenols od wine and concentrates from red grapes (no juice). Among non-flavonoid polyphenols hydroxybenzoic (gallic, syringic) and hydroxycinnamic (caftaric, сautaric) acids are identified, the relative content of which in the amount of polyphenols in the juice is maximum, and minimum is in concentrates. It was found that antioxidant activity for all products in standard Trolox method can be estimated by the equation: Y=0.53627+0.1395X+0.080439X2-0.00064708X3, with a correlation coefficient r=0.9952; where: Y - antioxidant activity, g/dm3 by Trolox method; X - mass concentration of phenolic substances on the Folin- Ciocalteu, g/dm3. The equation is valid for Y=0.76-196.22; X= 1.0-82.67. The results of biological testing of wines Cabernet Sauvignon, Merlot, Saperavi and polyphenol concentrates from grape on the biological model of bioluminescent bacteria Photobacterium leiognathi Sh1 demonstrated the applicability of bioassay to assess the antioxidant activity, which correlates well with the polyphenols content and antioxidant activity by trolox method.
Keywords: grape polyphenols, antioxidant activity, bioluminescent bacteria, biotesting, wine, grape concentrates
Полифенолы винограда культурного, содержащиеся в кожице, мякоти и семечке виноградной ягоды, определяют антиоксидантную активность продуктов его переработки, которые, поступая в организм человека с питанием, препятствуют процессам перекисного окисления в биомембранах, повышают антиоксидантный статус и снижают риск возникновения заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной систем (атеросклероз, ишемическая болезнь, бронхит, бронхиальная астма, эмфизема, ревматизм), стресса, аллергии, лучевой болезни, отравления, старения организма, сахарного диабета и других нарушений обмена веществ [1, 2]. Условно поли-
100
фенолы продуктов переработки красных сортов винограда можно распределить на две группы: флавоноидные и нефлавоноидные полифенолы. Флавоноиды включают такие соединения, как ан-тоцианы, флавоны, мономерные и олигомерные (процианидины) и полимерные (танины) флаван-3-олы. Нефлавоноидные полифенолы представлены в основном оксикоричными и оксибензойными кислотами [3]. Среди групп полифенолов, присутствующих в продуктах переработки винограда в значительных объемах, можно выделить флаван-3-олы и галловую кислоту, являющиеся наиболее мощными антиоксидантами среди полифенолов винограда [4, 5].
Систематизированные данные о качественном и количественном составе полифенолов продукции из массовых красных сортов винограда для промышленной переработки, таких как «Каберне-Совиньон», «Саперави», «Мерло», а также сведения, характеризующие антиоксидантную активность этой продукции, отсутствуют, что затрудняет оценку перспектив ее применения для здорового питания.
Цель исследования - установить экспериментально антиоксидантную активность, а также качественный и количественный состав полифенолов в продукции из красных сортов винограда «Каберне-Совиньон», «Саперави», «Мерло».
Материал и методы
При проведении исследований использовали сок, вино, пищевые концентраты полифенолов из винограда сортов «Каберне-Совиньон», «Саперави», «Мерло», произведенные в Крыму и на Кубани, полученные от производителей, урожая 2014 г. Хранили вина при температуре, не превышающей +16 оС, и относительной влажности 65-80%, пищевые концентраты полифенолов винограда - при температуре +5...+20 оС и относительной влажности воздуха 65-80%.
Качественный и количественный состав полифенолов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографической системы «Agilent Technologies 1100» («Agilent», США) с ди-одно-матричным детектором. Для разделения веществ использовали хроматографическую колонку Zorbax SB-C18 размером 2,1x150 мм, заполненную силикагелем с привитой октадецил-силильной фазой с размером частиц сорбента 3,5 мкм. Анализ проводили в градиентом режиме. Состав элюента: раствор А - метанол, раствор В -0,6% водный раствор трифторуксусной кислоты. Состав элюента в ходе анализа изменялся по следующей схеме (по содержанию компонента В): 0 мин - 8%; 0-8 мин - 8-38%; 8-24 мин -38-100%; 24-30 мин - 100%; скорость протока элюента - 0,25 мл/мин. Объем вводимой пробы -1 мкл. Хроматограммы регистрировали при следующих длинах волн: 280 нм для галловой кислоты, (+)-й-катехина, (-)-эпикатехина и процианидинов, 313 нм для производных оксикоричных кислот, 371 нм для кверцетина и 525 нм для антоциа-нов. Идентификацию веществ производили путем сравнения их спектральных характеристик времени удерживания с аналогичными характеристиками стандартов. Спектральные характеристики отдельных веществ получали с использованием данных литературы [6-8].
Количественное содержание индивидуальных компонентов рассчитывали с использованием калибровочных графиков зависимости площади пика от концентрации вещества, построенных по растворам индивидуальных веществ. Содержание антоцианов определяли в пересчете на хлорид мальвидин-3-О-глюкозида, содержание каф-таровой кислоты - в пересчете на кофейную кислоту, содержание полимерных и олигомерных процианидинов производили в пересчете на (+)-D-катехин. Все определения проводили в трех повторностях.
В качестве стандартов использовали галловую кислоту, кофейную кислоту, ^-D-катехин, хлорид мальвидин-3-О-глюкозида, кверцетин дигидрат, изокверцитрин («Fluka Chemie AG», Швейцария) и (-)-эпикатехин, сиреневую кислоту («Sigma-Aldrich», Швейцария).
Результаты исследований обрабатывали стандартными методами математической статистики [9].
Массовую концентрацию фенольных веществ определяли колориметрическим методом, основанным на том, что реактив Фолина-Чокальтеу при добавлении в исследуемый продукт окисляет фенольные группы, восстанавливаясь при этом в соединение голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации фенольных веществ.
Исследуемый концентрат полифенолов винограда разбавляли в 100 раз. В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещали 1 см3 исследуемого раствора, добавляли 1 см3 реактива Фолина-Чокальтеу, 10 см3 раствора карбоната натрия. Доводили дистиллированной водой до метки при температуре 20±0,5 °С и перемешивали. Через 30-40 мин измеряли оптическую плотность растворов в кювете 10 мм при длине волны 670 нм против контрольного раствора на колориметре фотоэлектрическом «КФК-2» (ЗОМЗ, РФ). Значение массовой концентрации фенольных веществ в мг/дм3 по галловой кислоте определяли по градуировочной кривой [10].
За окончательный результат принимали среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не превышало (для диапазона измерений 3000-20 000 мг/дм3) 33 мг/дм3. Предел погрешности при доверительной вероятности р=0,95 для диапазона измерения 3000-20 000 мг/дм3 составлял ±39 мг/дм3.
Определения проводили в 3 повторностях.
Для оценки антиоксидантной активности образцов продукции (сока, вина, концентратов) использовали амперометрический метод измерения массовой концентрации антиоксидантов по стандартному антиоксиданту тролоксу (Trolox) на приборе «Цвет-Яуза 01-АА» (НПО «Химавтоматика», РФ) по ГОСТ Р 54037 [11].
101
О
#
о
А. Острое действие
Антиоксидант
->■
10-30 мин
Б. Хроническое действие
Антиоксидант, питательная среда
1%
I.--
18 ч
Рис. 1. Методики биотестирования острого (а) и хронического (б) действий с использованием светящихся бактерий
Для проведения биолюминесцентного анализа антиоксидантной активности использовали светящиеся бактерии Photobacterium leiognathi Sh1 из коллекции Медицинской академии, Крымского федерального университета [12]. Биотестирование проводили по методикам оценки острого и хронического действий образцов на биолюминесценцию тест-бактерий (рис. 1А, Б).
Подготовку бактериальных культур для биотестирования антиоксидантной активности проводили, как описано ранее [12]. Для определения острого действия образцов (см. рис. 1А) в кюветах люминометра смешивали 0,8-0,9 мл тестируемого виноматериала в 3% NaCl, 100 мкл фосфатного буферного раствора, рН 7,0 и 50-200 мкл бактериальной суспензии до конечной концентрации 5х105 кл/мл. Изменение интенсивности биолюминесценции регистрировали в течение 30 мин с использованием биолюминометра «БЛМ 8801» (СКТБ «Наука», РФ) с самописцем. Интенсивность действия выражали в виде значений биолюминесценции при определенной концентрации образцов (мг/мл, для растворов индивидуальных веществ) или их разведения (V/V, для растворов неизвестного состава).
Хроническое действие определяли как влияние тестируемого объекта на рост и биолюминесценцию P. leiognathi Sh1. Для этого после измерения острого воздействия в пробы дополнительно вносили 20-50 мкл стерильной питательной среды для светящихся бактерий («Himedia», Индия, с добавлением NaCl до конечной концентрации 3%) и помещали их в термостат при температуре 30 °С. После инкубации в течение 18 ч измеряли интенсивность биолюминесценции, как описано выше (см. рис. 1Б).
Результаты и обсуждение
Экспериментальные данные по качественному и количественному составу полифенолов винограда, антиоксидантной активности соков, вин и концентратов полифенолов из винограда «Ка-берне-Совиньон», «Саперави», «Мерло» приведены в табл. 1 и 2.
Как видно из данных табл. 1 и 2, сведения литературы о флавоноидной и нефлавоноидной природе полифенолов красных сортов винограда находят подтверждение в наших опытах.
Флавоноиды представлены антоцианами в форме гликозидов дельфинидина, мальвиди-на, цианидина, петунидина, пеонидина, а также кверцетином и его гликозидом, (+)-0-катехи-ном, (-)-эпикатехином. В значительном количестве присутствуют олигомерные процианидины, представляющие собой конденсированные ка-техиновые единицы (2-6), растворимые в воде, а также полимерные процианидины с количеством катехиновых единиц более 7, не растворимые в воде. Полимерные процианидины составляют основную часть полифенолов вина и концентратов из красных сортов винограда, находятся в продукции в лабильном состоянии; в соке наблюдается полное отсутствие олигомерных и полимерных процианидинов, как известно, обладающих многообразной биологической активностью [13]. Среди нефлавоноидных полифенолов идентифицированы оксибензойные (галловая, сиреневая) и оксикоричные (кафтаровая, каутаровая) кислоты, относительное содержание которых в сумме полифенолов максимально в соке, минимально в концентратах.
Сумма фенольных веществ в образцах продукции, найденная по данным ВЭЖХ и колориметрически (по реактиву Фолина-Чокальтеу), в пересчете на галловую кислоту систематически различается, что, по-видимому, связано с большей чувствительностью методики ВЭЖХ.
Оценка антиоксидантной активности in vitro ам-перометрическим методом по ГОСТ Р 54037 [11] показала, что величина антиоксидантной активности в единицах тролокса возрастает по мере увеличения концентрации полифенолов в продукции (см. табл. 1, 2). При этом данные табл. 1 и 2 по величинам антиоксидантной активности и массовой концентрации фенольных веществ аппроксимируются уравнением с коэффициентом корреляции R=0,9952:
Y=0,53627+0,1395X+0,080439X2-0,00064708X3,
где: Y - антиоксидантная активность, г/дм3 в пересчете на тролокс; X - массовая концентрация фенольных веществ по Фолину-Чокальтеу, г/дм3.
102
С
С
Таблица 1. Фенольный состав и антиоксидантная активность продуктов переработки винограда
#
Показатель, мг/дм3 Опытные образцы сока, Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина «Магарач» Вина ГК НПАО «Массандра» Пищевые концентраты из «Каберне-Совиньон» ООО «РЕССФУД»
«Каберне-Совиньон» «Мерло» «Каберне» «Мерло» «Саперави» «Эноант» «Эноант Премиум» «Фэнокор»
Антоцианы
Сумма антоцианов 1,7±0,1 26,3±0,6 20,3±0,4 23,8±0,5 23,4±0,6 18,9±0,4 22,9±0,6 -
Флавоны
Кверцетин-3-О-глюкозид 0,9 ±0,02 3,7 ±0,1 8,5 ±0,2 15,9 ±0,3 11,5 ±0,3 3,1 ±0,1 3,5 ±0,1 15,4 ±0,3
Кверцетин - - 2,8±0,1 1,6±0,03 1,2±0,03 49,6±1,1 81,2±2,0 10,2±0,2
Флаван-3-олы
(+)-й-Катехин - 2,1 ±0,1 34,7 ±0,7 44,8 ±0,9 26,8 ±0,6 177,6 ±4,0 208,5 ±5,1 1752.6 ±35,1
(-)-Эпикатехин - - 34,5 ±0,7 47,4 ±0,9 29,7 ±0,7 118,4 ±2,7 127,3 ±3,1 1374,2 ±27,5
Оксикоричные кислоты
Кафтаровая кислота 49,8 ±1,1 104,4 ±2,5 45,6 ±0,9 58,0 ±1,1 44,3 ±1,1 11,7 ±0,3 16,9 ±0,4 -
Каутаровая кислота - - 7,5 ±0,2 10,0 ±0,2 7,4 ±0,2 1,8 ±0,04 2,4 ±0,1 -
Оксибензойные кислоты
Галловая кислота - 0,23 ±0,01 39,3 ±0,8 42,6 ±0,8 33,8 ±0,8 341,1 ±7,7 465,2 ±11,3 1119,2 ±22,4
Сиреневая кислота 1,7 ±0,04 7,7 ±0,2 7,0 ±0,1 5,3 ±0,1 9,0 ±0,2 22,6 ±0,5 26,2 ±0,6 -
Проантоцианидины
Олигомерные проантоцианидины - - 187 ±4 222 ±4 200 ±5 603 ±14 1614 ±39 4598 ±92
Полимерные проантоцианидины - - 3045 ±61 3723 ±73 3525 ±84 28155 ±634 38436 ±932 172662 ±3455
Интегральные показатели
Сумма фенольных веществ (ВЭЖХ), г/дм3 0,062 ±0,001 0,163 ±0,004 3,43 ±0,1 4,20 ±0,1 3,91 ±0,1 29,50 ±0,7 41,01 ±1,0 181,53 ±3,6
Массовая концентрация фенольных веществ, в пересчете на галловую кислоту, г/дм3 0,29 ±0,01 0,46 ±0,01 4,35 ±0,11 4,56 ±0,11 4,25 ±0,1 18,51 ±0,49 21,81 ±0,59 82,69 ±2,29
Антиоксидантная активность, г/дм3, в пересчете на тролокс 0,08 ±0,002 0,20 ±0,01 2,36 ±0,06 2,75 ±0,07 2,38 ±0,07 24,72 ±0,73 36,48 ±0,92 196,22 ±4,92
Ф
Уравнение справедливо в пределах варьирования 1,0-82,67 г/дм3 по фенольным веществам и 0,76-196,22 г/дм3 антиоксидантной активности. Уравнение, обобщающее величины антиоксидантной активности в широком диапазоне изменения концентрации полифенолов
для сока, вина и концентратов из красных сортов винограда «Каберне-Совиньон», «Саперави», «Мерло» позволяет косвенно оценить биологическую активность продукции при наличии банка данных, полученных для этой продукции in vivo.
103
Антиоксидантную активность образцов исследовали также на биологической модели люминесцентных бактерий, которые представляют собой разнородную группу микроорганизмов, объединенных по способности излучать видимый свет. Большинство представителей этой группы являются морскими бактериями, которые обитают практически во всех акваториях мирового океана. Бактериальная биолюминесценция представляет собой ферментативный процесс, сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света. В общем виде химизм реакции генерации свечения может быть представлен как окисле-
ние восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН Н2) до ФМН с одновременным окислением длинноцепочечного алифатического альдегида ^СНО) до соответствующей жирной кислоты ^СООН) [14]:
ФМН Н2+О^СНО ^ ФМН+H2O+RCOOH+ фотон (495 нм).
Традиционно светящиеся морские бактерии широко используются для биотестирования, в частности для оценки биотоксичности. Принцип биолюминесцентных тестов заключается в
Таблица 2. Фенольный состав и антиоксидантная активность столовых сухих красных вин производства винодельческих предприятий Краснодарского края
Показатель, мг/дм3 ООО «Фанагория» ООО «Кубань вино» ООО «Кубанские вина»
«Саперави» «Мерло» «Каберне» «Саперави» «Мерло» «Каберне» «Саперави» «Мерло»
Антоцианы
Сумма антоцианов 341,9 ±8,3 286,7 ±5,6 292,3 ±6,2 556,2 ±12,4 167,5 ±3,8 133,3 ±2,7 111,7 ±2,2 66,6 ±1,4
Флавоны
Кверцетин-3-О-глюкозид 18,5 ±0,5 15,2 ±0,3 8,9 ±0,2 9,8 ±0,2 36,9 ±0,8 15,7 ±0,3 6,6 ±0,1 4,6 ±0,1
Кверцетин 2,8 ±0,07 1,1 ±0,02 0,9 ±0,02 0,7 ±0,02 4,1 ±0,1 0,3 ±0,01 0,5 ±0,01 0,4 ±0,01
Флаван-3-олы
(+)-Э-Катехин 31,1 ±0,8 63,6 ±1,2 58,1 ±1,2 58,6 ±1,3 83,5 ±1,9 60,8 ±1,2 38,2 ±0,7 45,2 ±1,0
(-)-Эпикатехин 43,8 ±1,1 58,2 ±1,1 49,9 ±1,1 71,2 ±1,6 78,8 ±1,8 52,9 ±1,1 31,4 ±0,6 45,1 ±1,0
Оксикоричные кислоты
Кафтаровая кислота 24,1 ±0,6 59,8 ±1,2 49,2 ±1,0 69,6 ±1,6 52,7 ±1,2 29,9 ±0,6 36,9 ±0,7 34,4 ±0,7
Каутаровая кислота 2,4 ±0,1 5,7 ±0,1 6,8 ±0,1 11,8 ±0,3 5,4 ±0,1 3,5 ±0,1 3,4 ±0,1 2,5 ±0,1
Оксибензойные кислоты
Галловая кислота 58,2 ±1,4 41,8 ±0,8 45,0 ±1,0 63,0 ±1,4 67,8 ±1,5 78,1 ±1,6 64,7 ±1,3 71,5 ±1,5
Сиреневая кислота 6,6 ±0,2 1,9 ±0,04 4,5 ±0,1 4,3 ±0,1 4,0 ±0,1 8,4 ±0,2 5,2 ±0,1 4,7 ±0,1
Проантоцианидины
Олигомерные проантоцианидины 227 ±6 215 ±4 188 ±4 212 ±5 222 ±5 221 ±5 166 ±3 164 ±4
Полимерные проантоцианидины 2476 ±60 1650 ±32 1749 ±37 2380 ±53 2072 ±47 2068 ±42 2411 ±47 1805 ±39
Интегральные показатели
Сумма фенольных веществ (ВЭЖХ), г/дм3 3,23 ±0,08 2,40 ±0,05 2,45 ±0,05 3,44 ±0,08 2,79 ±0,06 2,67 ±0,05 2,88 ±0,06 2,24 ±0,05
Массовая концентрация фенольных веществ, в пересчете на галловую кислоту, г/дм3 3,86 ±0,10 3,75 ±0,11 3,84 ±0,09 4,13 ±0,08 3,85 ±0,08 3,89 ±0,10 3,94 ±0,10 3,86 ±0,09
Антиоксидантная активность, г/дм3, в пересчете на тролокс 2,14 ±0,05 2,23 ±0,06 2,25 ±0,05 2,69 ±0,06 2,49 ±0,06 2,37 ±0,07 2,59 ±0,08 2,50 ±0,06
104
120,0
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0
п-г
0,1 0,2 С, мг/мл
-♦— Галловая кислота
0
Н-г
0,1 0,2 С, мг/мл
-♦— Галловая кислота
А ▼ ...........— - —г................Б
Рис. 2. Действие галловой кислоты и корвитина на биолюминесценцию Р. Leiognathi ЭИ1: А - 10-минутный тест; Б - 18-часовой тест
инкубировании люминесцирующих бактерий в анализируемых средах, содержащих вещество или смеси веществ, способных оказать влияние на физиологическое состояние бактериальных клеток. Соответственно, возможными реакциями являются отсутствие изменения уровня свечения, его повышение или снижение, в последнем случае обычно интерпретируемое как развитие токсического эффекта. При этом в случае исследования образцов неизвестного состава, регистрируемый отклик неспецифичен, так как отражает реакцию на всю совокупность присутствующих в пробе химических веществ [14-16].
В данной работе люминесцентные бактерии были использованы для биотестирования анти-оксидантных свойств виноматериалов. При этом биолюминесцентная реакция бактерий с участием фермента люциферазы рассматривалась как модельная окислительная система и ее ингибирова-ние как результат антиокислительного действия [17, 18]. Учитывая, что бактерии реагируют изменением свечения на самые различные факторы, в том числе биоцидные, одновременно с антиок-сидантной активностью тест показывал и наличие антибактериальных свойств виноматериалов, что можно считать дополнительным преимуществом такого подхода.
На первом этапе для испытания люминесцентных бактерий в качестве модели для изучения антиоксидантной активности изучали воздействие двух модельных антиоксидантов: галловой кислоты (нефлавоноидное фенольное соедине-
ние) и кверцетина (флавоноид) на интенсивность бактериальной люминесценции. В качестве водорастворимой формы кверцетина использовали фармацевтический препарат корвитин (ПАО НПЦ «Борщаговский ХФЗ», Украина), представляющий собой комплекс кверцетина с поливинил-пирролидоном.
Оба препарата оказывали сходное ингибиро-вание биолюминесценции бактерий, которое отмечалось через 10 мин (рис. 2А) и усиливалось при 18-часовом тесте на хроническое действие (рис. 2Б). В последнем случае наблюдалось также увеличение хронического эффекта корвитина по сравнению с галловой кислотой.
Далее было изучено действие образцов винома-териалов и виноградных концентратов на биолюминесценцию фотобактерий (рис. 3). Результаты оценки острого действия (10 и 30 мин) показали более сильное воздействие концентратов («Эно-ант», «Эноант Премиум», «Фэнокор») по сравнению с образцами вин.
При использовании 18-часового биотеста на хроническое действие наблюдалось изменение в активности полифенольных концентратов (рис. 4). Если при 10- и 30-минутных тестах ин-гибирование биолюминесценции «Эноантами» и «Фэнокором» было практически одинаково, то при в 18-часовом тесте отмечалось усиление действия в ряду «Эноант» (6) - «Эноант Премиум» (4) -«Фэнокор» (5), что совпадает с увеличением содержания в них полифенольных антиоксидантов, а также с увеличением общей антиоксидантной активности.
105
Рис. 3. Действие исследованных образцов виноматериалов на биолюминесценцию Р. Leiognathi БМ: А - 10-минутный тест; Б - 30-минутный тест.
Здесь и на рис. 4: 1 - «Мерло»; 2 - «Саперави»; 3 - «Каберне»; 4 - «Эноант Премиум»; 5 - «Фэнокор»; 6 - «Эноант».
Разведение ♦ 1 А 3 --Д--5
Рис. 4. Хроническое действие исследуемых образцов виноматериалов на биолюминесценцию P. Leiognathi БИ1, 18-часовой тест
Представлялось интересным установить корреляционные зависимости между показателями антиоксидантной активности в биологическом тесте по ингибированию бактериальной биолю-
106
минесценции и данными по содержанию фенолов согласно ВЭЖХ, фотоколориметрическому методу и общей антиоксидантной активности по тролоксу. Как видно из табл. 3, между результатами биотестирования на светящихся бактериях и значениями антиоксидантной активности, полученными другими методами, наблюдается достаточно строгая обратная корреляция. Более высокое содержание антиоксидантов в образцах приводило к более сильному ин-гибированию бактериальной биолюминесценции и более низким показателям интенсивности свечения тест-бактерий. Наиболее высокие коэффициенты корреляций 0,75-0,81 наблюдались при использовании значений биолюминесценции при 18-часовом тесте на хроническое действие и при разведении образца в 1000 раз (0,001).
Таким образом, в работе проведен качественный и количественный физико-химический анализ антиоксидантной активности продуктов переработки красных сортов винограда «Каберне-Совиньон», «Мерло», «Саперави», получено экспериментальное уравнение для расчетов анти-оксидантной активности образцов в единицах тролокса.
А.М. Авидзба, А.В. Кубышкин, Т.И. Гугучкина и др.
Таблица 3. Корреляция показателей антиоксидантной активности образцов и результатов биотестирования на светящихся бактериях
Образец Биолюминесценция, отн. ед.
10 мин, разведение 0,01 30 мин, разведение 0,01 18 ч, разведение 0,001
«Каберне» 77,52 79,83 50,25
«Мерло» 93,02 90,34 62,81
«Саперави» 77,52 84,03 50,25
«Эноант» 48,45 37,82 25,13
«Эноант Премиум» 38,76 25,21 7,54
«Фэнокор» 38,76 29,41 0
Корреляция с содержанием фенольных веществ (ВЭЖХ), г/дм3 -0,672 -0,651 -0,781
Корреляция с содержанием фенольных веществ по Фолину-Чокальтеу, г/дм3 -0,709 -0,690 -0,809
Корреляция с антиоксидантной активностью по тролоксу, г/дм3 -0,635 -0,611 -0,750
Показана достоверность биотеста на люминес- 18 ч), с данными ВЭЖХ, результатами определения по
центных тест-бактериях Photobacterium leiognath Фолину-Чокальтеу и тролоксу составляли 0,75-0,81.
Sh1 для оценки антиоксидантной активности вино- Статья выполнена при финансовой поддержке
материалов и виноградных концентратов. Минобрнауки России.
Коэффициенты корреляции значений антиоксидан- Уникальный идентификатор ПНИ
тной активности, полученных с использованием био- RFMEFI60414X0077 при подписании
теста на светящихся бактериях (хроническое действие, Соглашения № 14.604.21.0077.
Сведения об авторах
Авидзба Анатолий Мканович - доктор сельскохозяйственных наук, академик, директор ГБУ Республики Крым «Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина "Магарач"» (Ялта) E-mail: magarach@rambler.ru
Кубышкин Анатолий Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по науке Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (Симферополь) E-mail: kubyshkin_av@mail.ru
Гугучкина Татьяна Ивановна - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующая научным центром виноделия ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» (Краснодар) E-mail: guguchkina@mail.ru
Маркосов Владимир Арамович - доктор технических наук, заведующий лабораторией специальных рас дрожжей ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» (Краснодар) E-mail: kubansad@kubannet.ru
Кацев Андрей Моисеевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой медицинской и фармацевтической химии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (Симферополь) E-mail: katsev@mail.ru
Наумова Наталья Валентиновна - ассистент кафедры медицинской и фармацевтической химии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (Симферополь) E-mail: naumova-csmu@mail.ru
Шрамко Юлиана Ивановна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и клинической патофизиологии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (Симферополь) E-mail: julianashramko@rambler.ru
Зайцев Георгий Павлович - младший научный сотрудник ГБУ Республики Крым «Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина "Магарач"» (Ялта) E-mail: gorg-83@mail.ru
Черноусова Инна Владимировна - кандидат технических наук, старший научный сотрудник отдела аналитических исследований и инновационных технологий ГБУ Республики Крым «Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина "Магарач"» (Ялта) E-mail: chernblack@mail.ru
Огай Юрий Алексеевич - кандидат технических наук, старший научный сотрудник, начальник отдела аналитических исследований и инновационных технологий ГБУ Республики Крым «Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина "Магарач"» (Ялта) E-mail: enoant@yandex.ru
Фомочкина Ирина Ивановна - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ЦНИЛ Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (Симферополь) E-mail: fomochkina_i@mail.ru
Литература
#
Яшин Я.И., Рыжнев В.Ю., Яшин А.Я., Черноусова Н.И.. Природные 10. антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека. М.: ТрансЛит, 2009. 192 с. 11. Биологические активные вещества винограда и здоровье : монография / под общ. ред. А.Л. Загайко. Харьков : Форт, 2012. 404 с.
Огай Ю.А., Алексеева Л.М., Сиказан О.М., Катрич Л.И. Поли- 12. фенольные биологически активные компоненты пищевого концентрата «Эноант» // Материалы конференции «Биологически активные природные соединения винограда - III: 13. Гигиенические и медицинские эффекты применения продуктов с высоким содержанием полифенолов винограда». Ялта, 17-18 декабря 2004 г. URL: http://enoant.info/_pdf/_sb2/3_enoant_ 14. info_Ogay.pdf.
Bombardelli E., Morazzoni P. Vitis vinifera L. // Fitoterapia. 1995. 15. Vol. LXVI, N 4. P. 291-317.
Teissedre P.L., Walzem R.L., Waterhouse A.L., Cterman J.B. et al. Composes phenoliques durasin, duvinetsante // Revue des Oenologues. 1996. Vol. 79. P. 7-14. 16.
Bagchi D., Bagchi M., Stohs S.J., Das D.K. et al. Free radicals and grape seed proanthocyanidn extract: importance in human health and disease prevention // Toxicology. 2000. Vol. 148. P. 187-197. Bagchi D., Sen C.K., Ray S.D., Dipak K. et al. Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyanidin extract // 17. Mutat. Res. 2003. Vol. 523. P. 87-97.
Woodring P. J., Edwards P.A., Chisholm M.G. HPLC determination of nonflavonoid phenols in vidal blanc wine using electrochemical 18. detection // J. Agric. Food Chem. 1990. Vol. 38. P. 729-732. Лакин Г.Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М. : Высш. шк., 1990. 352 с.
Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672. ГОСТ З 54037-2010 Продукты пищевые. Определение содержания водорастворимых антиоксидантов амперометрическим методом в овощах, фруктах, продуктах их переработки, алкогольных и безалкогольных напитках.
Кацев А.М. Новые термофильные люминесцентные бактерии, выделенные из Азовского моря // Таврический медико-биологический вестн. 2014. Т. 17, № 2. С. 59-64. В.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнерова. Природные олигомерные проци-анидины - перспективные регуляторы метаболических нарушений // Вестн. ДВО РАН. 2006. № 2. С. 81-90. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М. : Наука, 2009. 248 с. Berest G.G.,Voskoboynik O.Y., Kovalenko S.I.,Nosulenko I.S. et al. Synthesis of New 6-{[ra-(Dialkylamino(heterocyclyl)alkyl]thio}-3-R-2H-[1,2,4]triazino[2,3-c]quinazoline-2-ones and evaluation of their anticancer and antimicrobial activities // Sci. Pharm. 2012. Vol. 80, N 1. P. 37-65. Antipenko L.N., Karpenko A.V., Kovalenko S.I., Katsev A.M. et al. Synthesis, cytotoxicity by bioluminescence inhibition, antibacterial and antifungal activity of ([1,2,4]triazolo[1,5-c]quinazolin-2-ylthio)carboxylic acid amides // Arch. Pharm. (Weinheim). 2009. Vol. 342, N 11. P. 651-620.
Kudryasheva N., Vetrova E., Kuznetsov A. et al. Bioluminescence assays: effects of quinones and phenols // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2002. Vol. 53, N 3. P. 198-203.
Исмаилов А.Д. Биолюминесценция как излучательная форма защиты от окислительного стресса у морских фотобактерий // Материалы VII Съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 14-20 сентября 2014 г. Пущино, 2014. С. 104.
2.
3
6
7.
8
9
References
Yashin Ya.I., Ryzhnev V.Yu., Chernousova N.I. Natural antioxidants. Their content in food products and influence on human's health and ageing process. Moscow: TransLit, 2009: 192 p. (in Russian) Biologically active substances in grapes and health. Monograph / Ch. ed. A.L. Zagaiko. Kharkov: Fort, 2012: 404 p. (in Russian) Ogai Yu.A., Alekseeva L.M., Sikazan O.M., Katritch L.I. Polyphenols biologically active components in «Enoant» food concentrate. In: Conference materials «Biologically active natural compounds in grapes - III. Hygienic and Medical effects in products usage with high content of grape polyphenols». Yalta, 17-18 December 2004. URL: http://enoant.info/_pdf/_sb2/3_enoant_info_Ogay.pdf. (in Russian)
Bombardelli E., Morazzoni P. Vitis vinifera L. Fitoterapia. 1995; Vol. LXVI (4): 291-317.
Teissedre P.L., Walzem R.L., Waterhouse A.L., Cterman J.B. et al. Composes phenoliques durasin, duvinetsante. Revue des Oenologues. 1996: Vol. 79: 7-14.
Bagchi D., Bagchi M., Stohs S.J., Das D.K. et al. Free radicals and grape seed proanthocyanidn extract: importance in human health and disease prevention. Toxicology. 2000: Vol. 148: 187197.
Bagchi D., Sen C.K., Ray S.D., Dipak K., et al. Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyanidin extract. Mutat Res. 2003; Vol. 523: 87-97.
108
5
2.
3
6
7
А.М. ABMfl36a, A.B. Ky6biWKMH, T.M. fyryHKMHa u flp.
8. Woodring P. J., Edwards P.A., Chisholm M.G. HPLC determination 14. of nonflavonoid phenols in vidal blanc wine using electrochemical detection. J Agric Food Chem. 1990; Vol. 38: 729-32. 15.
9. Lakin G.F. Biometrics: tutorial for institutes specializing in biological sciences. 4th ed. improved and amended. Moscow: Vyschaya Sch-kola, 1990: 352 p. (in Russian)
10. Guidebook: quality control methods and safety for biologically active 16. food supplements. Guidebook P 4.1.1672. (in Russian)
11. State Standard GOST 3 54037-2010 Food products. Definition of water-soluble antioxidant content in vegetables, fruit and processed products, alcohol and alcohol-free beverages by amperomet-
ric method. (in Russian) 17.
12. Katsev A.M. New thermophilic luminescent bacteria evolved from the Azov Sea. [Tavrida Medical and Biological Bulletin]. 2014; Vol. 17
(2): 59-64. (in Russian) 18.
13. Sprygin V.G., Kushnerova N.F. Natural oligomeric proanthocyani-dins - perspective metabolic disorders' regulators. [FEB RAS Bulletin]. 2006; Vol. 2: 81-90. (in Russian)
Deryabin D.G. Bacterial bioluminescence: fundamental and applied aspects. Moscow: Nauka, 2009: 248 p. (in Russian) Berest G.G.,Voskoboynik O.Y., Kovalenko S.I.,Nosulenko I.S. et al. Synthesis of New 6-{[ro-(Dialkylamino(heterocyclyl)alkyl]thio}-3-R-2H-[1,2,4]triazino[2,3-c]quinazoline-2-ones and evaluation of their anticancer and antimicrobial activities. Sci Pharm. 2012; Vol. 80 (1): 37-65. Antipenko L.N., Karpenko A.V., Kovalenko S.I., Katsev A.M., et al. Synthesis, cytotoxicity by bioluminescence inhibition, antibacterial and antifungal activity of ([1,2,4]triazolo[1,5-c]quinazolin-2-ylthio)carboxylic acid amides. Arch Pharm (Weinheim). 2009; Vol. 342 (11): 651-20.
Kudryasheva N., Vetrova E., Kuznetsov A. et al. Bioluminescence assays: effects of quinones and phenols. Ecotoxicol Environ Saf. 2002; Vol. 53 (3): 198-203.
Ismailov A.D. Bioluminiscence as a radioctive way of protection for sea photobacteria from oxidizing stress. Materials of VII Congress of Russian PhotoBiological Society, Schepsi settlement, 14-20 September 2014]. Pushino, 2014: 104. (in Russian)
109
