CC BY
124
УДК 547.568
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИГНАНОВ СЕМЯН ЛЬНА МАСЛИЧНОГО В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
Б.Н. Баженов, О.В. Шабалина
Иркутский государственный университет,
664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, [email protected], [email protected]
Одним из биологически активных соединений семян льна масличного (Linum usitatissimum) является лигнан диглюкозид секоизоларицирезинола (СДГ). В данной статье рассматривается возможность использования содержащихся в лекарственном препарате «Фестал» ферментов желудочно-кишечного тракта для гидролиза СДГ с целью получения секоизоларицирезинола, обладающего более выраженными антиоксидантными свойствами. Сравнивалась антиоксидантная активность препаратов, полученных в процессе последовательных гидролитических превращений предварительно обезжиренного порошка семян льна. Ил. 2. Библиогр. 7 назв.
Ключевые слова: семена льна; лигнаны; секоизоларицирезинол; антиоксидантная активность; катион-радикал АБТС; ферментативный гидролиз.
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF FLAX SEED LIGNANS IN EXPERIMENTS IN VITRO
B.N. Bazhenov, O.V. Shabalina
Irkutsk State University,
1, Karl Marx Str., Irkutsk, 664003 Russia, [email protected], [email protected]
Lignan (secoisolariciresinol diglucoside (SDG)) is one of the biologically active compounds from flax seeds (Linum usitatissimum). In present work we discuss the possibility of using gastrointestinal enzymes from drug «Festal» for hydrolysis SDG to obtain secoisolariciresinol. The later compound antioxidative activity is higher comparing to SDG. The antioxidant activity has been estimated for the samples obtained during successive hydrolytic transformations of the preliminary degreased flax seeds. 2 figures. 7 sources.
Key words: flax seed; lignans; secoisolariciresinol; antioxidant activity; ABTS+\- enzymatic hydrolysis.
ВВЕДЕНИЕ
В защите организма от влияния факторов окружающей среды одно из центральных мест занимает универсальная антиоксидантная система, существующая во всех типах клеток. При воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды на организм его внутренних ресурсов оказывается недостаточно, что сопровождается усилением процессов свободно-радикального окисления. Для поддержания системы антиоксидантной защиты на адекватном функциональном уровне используются обладающие антиоксидантной активностью лекарственные препараты, либо пищевые биологически активные добавки. Однако, если действие таких пищевых антиоксидантов, как токоферолы, аскорбиновая кислота, изучено достаточно детально, антиоксидантная эффективность многих других минорных компонентов пищи, к числу которых относят флавоноиды и лигнаны, требует специальных исследований [3]. Поскольку вещества природного происхождения родственны организму и могут участвовать в обмене веществ в качестве естественных агентов, то наиболее рациональным подходом является использование в качестве основы именно сырья растительного происхождения. Это обусловливает актуальность исследований по поиску биологически активных средств воздействия на наиболее уязвимые участки обмена веществ [2].
В последние годы в диетических и лечебно-профилактических целях все шире используются семена льна масличного, химический состав которых представлен различными классами биологически активных соединений. Об-
наружение в семенах льна таких компонентов как лигнаны делает их потенциальным сырьем для получения данных веществ в чистом виде, в виде обогащенных фракций, либо для создания комплексных препаратов на их основе [4].
Цель данного исследования - оценка эффективности биологически активных соединений семян льна масличного в экспериментах in vitro.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объекта исследования были использованы семена льна масличного (Linum usitatissimum).
Предварительная подготовка объекта состояла в измельчении цельных семян льна до порошкообразного состояния. Полученный порошок промывали водой для удаления полисахаридов, сушили и обезжиривали гексаном в аппарате Сокслета. Обезжиренный и высушенный порошок разделили на три части: первую перенесли в 50%-ый водно-спиртовый раствор, вторую и третью части подвергли двухчасовому гидролизу 4M NaOH в 50%-ом водно-спиртовом растворе. После гидролиза третьей части pH довели 1M HCl до 3, добавили измельченную таблетку препарата «Фестал» (Производство Авентис Фарма Лтд., Индия), содержащего комплекс ферментов желудочно-кишечного тракта. Отдельно готовили 50%-ый водно-спиртовый раствор, доведенный до pH 3 и содержащий измельченную таблетку препарата «Фестал».
Для оценки антиоксидантной активности соединений семян льна масличного использовался метод гашения катион-радикала ABTS+
I } soX
rolSXXs>N чхх I
\ < I.
который предварительно генерировался окислением диаммонийной соли 2,2'-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) раствором персульфата калия.
Мониторинг реакций осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 на длине волны 730 нм, соответствующей максимуму поглощения ABTS+V Все измерения проводили при температуре 37,2°С. В кювету спектрофотометра (1 см) помещали 2 мл раствора ABTS+\ предварительно разбавленного до концентрации, соответствующей оптической плотности 0,7-0,8; затем в кювету с интервалом 8 мин. добавляли по 20 мкл раствора исследуемого препарата и измеряли оптическую плотность непосредственно после добавления и после 4-х минут инкубации раствора. Все результаты получены усреднением минимум трех параллельных экспериментов, для сопоставимости результаты нормировали к единичной начальной оптической плотности раствора ABTS+V
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Основным лигнаном [5] в семенах льна является (+)-^,2К]-бис-[(4-гидрокси-3-метокси) метил]-1,4-бутандиил-бисф-глюкопиранозид) (диглюкозид секоизоларицирезинола - СДГ, II, рис.1), который находится в семенах в виде эфира глутаровой кислоты (I, рис.1).
Известно [1], что за счет фермент-лабильной углеводной функции СДГ способен гидролизоваться под действием пищеварительных ферментов в кислой среде до (+)-^,2К]-бис-[(4-гидрокси-3-метокси)метил]-1,4-бутандиола (секоизоларицирезинол - СЕКО, III, рис. 1), обладающего ярко выраженной антиок-сидантной активностью (АОА) за счет наличия свободных гидроксильных групп. При попада-
61
нии (I) в желудочно-кишечный тракт организма должны происходить превращения согласно схеме, представленной на рис. 1.
Использование в качестве действующего компонента препаратов антиоксидантного назначения СЕКО, как заведомо более эффективного антиоксиданта, чем СДГ, ограничено его чрезвычайно малой растворимостью в воде, несмотря на хорошую растворимость в ацетоне, хлороформе, этилацетате. В то же время СДГ, имея в составе молекулы углеводные остатки, хорошо растворяется в водно-спиртовых смесях. Кроме того, в связи со сложностями выделения СДГ из многокомпонентной смеси семян льна [5], более рационально, с точки зрения фармацевтической индустрии, было бы не выделять его в индивидуальном виде и подвергать дальнейшему гидролизу для получения более эффективного агликона, а непосредственно использовать предварительно подготовленные семена.
Предварительная подготовка семян льна включает измельчение, промывку водой и обезжиривание гексаном, что должно, на наш взгляд, способствовать удалению мешающих компонентов и более легкой усвояемости организмом. Полученный таким образом препарат использовался в данной работе.
Для решения поставленной задачи были проведены измерения степени гашения ABTS+• под действием:
- водно-спиртового извлечения непосредственно из подготовленных семян льна (образец А);
- то же, что (А), с последующим гидролизом NaOH и удалением глутаровой кислоты (образец Б);
- то же, что (Б), затем - создание кислой
Рис. 1. Гидролиз лигнанов семян льна
0,9
л I-
о о
X I-
о
ЕЁ 0,7 к
(О ^
о ф
т s
с: 0,5 О
0,3
10
20
30
Время, мин.
40
50
60
Образец А -□-Образец Б -А-Образец В
Контроль
Рис. 2. Изменение оптической плотности растворов АВТЭ+' под действием исследуемых образцов
среды и добавление ферментов желудочно-кишечного тракта, содержащихся в препарате «Фестал» (образец В).
Полученные результаты представлены на рис. 2. В качестве контроля использовался раствор одинакового с образцом В содержания ферментного препарата.
Падение оптической плотности в контроле на 15% связано с разбавлением исходного раствора ABTS"1" внесением в процессе измерений нескольких порций раствора ферментного препарата, что свидетельствует об отсутствии его собственной антиоксидантной активности.
В случае образца А наблюдается падение концентрации ABTS"1" не только за счет разбавления раствора, но и вследствие проявления активности - незначительной, что, по-видимому, связано с отсутствием у основного компонента образца А - соединения (I) свободных фенольных гидроксильных групп. После «открытия» последних в результате щелочного гидролиза (образец Б) наблюдается более значительное падение концентрации ABTS+\ что подтверждает сказанное.
После проведения ферментативного гидролиза (образец В) наблюдается резкое повышение активности препарата - уже в первые несколько минут после внесения образца в раствор ABTS+^ происходит значительное снижение его концентрации.
Антиоксидантная активность (АОА) экстракта семян льна фирмы Biogin Biochemicals Co.Ltd. (КНР), измеренная нами методом ТЕАС (trolox equivalent antioxidant capacity) [7], равна 1,34. Учитывая, что содержание сДг в данном препарате, по данным производителя, составляет 40% и, исходя из полученных результатов, можно оценить содержание СДГ около 2% от массы сухих обезжиренных семян льна, что вполне согласуется с литературными данными [5.6].
ВЫВОДЫ
Достаточно сложный химический состав семян льна не позволяет сделать однозначное заключение о природе АОА препаратов на его основе. Тем не менее, полученные результаты не противоречат предположению об основном вкладе именно диглюкозида секоизоларицире-зинола в общую АОА исследованных образцов.
Сравнительные результаты исследования препаратов, полученных на основе семян льна, свидетельствуют о возможности ферментативных превращений, сопровождающихся возрастанием АОА, непосредственно в пищеварительной системе, что может представлять интерес при разработке новых лекарственных препаратов и биологически активных пищевых добавок.
0
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Алешкова О.В., Баженов Б.Н. Секоизо-ларицирезинол: альтернативные способы выделения из растительного сырья // Спецпроект: аналiз наукових дослщжень. 2012. № 5. С. 8890.
2. Бабичев А.В. Молекулярные механизмы взаимодействия в организме биогенных веществ животного и растительного происхождения: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Уфа, 2005. С. 30.
3. Морозов С.В. Оценка эффективности природных антиоксидантов в экспериментах in vitro и in vivo: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. М., 2003. С. 15.
4. Стасевич О.В., Климашевич В.Б., Миха-ленок С.Г. Эффективность получения лигнано-богащенной фракции с использованием неток-
сичных растворителей // Химия и химическая технология. 2008. № 3. С. 518-520.
5. Стасевич О.В., Михаленок С.Г., Курченко В.П. ВЭЖХ анализ лигнансодержащих экстрактов из семян льна масличного // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8, вып. 6. С. 903-909.
6. Muir A.D., Lafond J., McAndrew D.W., May W., Irvine B., Grant C., Shirtliffe S., Bruulsema T.W. Westcott N.D. Factors Affecting the Concentration of a Nutraceutical Lignan in Flaxseed // Proceedings of the Symposium on Fertilizing Crops for Functional Food (November 11, 2002). 2002. P. 4.1-4.3.
7. Re R., Pellegrini N., Proteggente A. Antiox-idant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assays // Free Rad Biol & Med. 1999. Vol. 26. No. 9/10. P. 1231-1237.
REFERENCES
1. Aleshkova O.V., Bazhenov B.N. Sekoizolaritsirezino l: al'ternativnye sposoby vydeleniya iz rastitel'nogo syr'ya [Secoisolariciresinol: alternative methods of isolation from plant material]. Special Project: Analysis scientific research, 2012, no. 5, pp. 88-90.
2. Babichev A.V. Molekulyarnye mekhanizmy vzaimodeistviya v o a izme biogennykh veshchestv zhivotnogo i rastitel'nogo proiskh ozhdeniya [Mole cular mechanisms of animal and vegetable nutrients interaction in an organism]. Author's abstract of PhD thesis, 2005, p. 30.
3. Morozov S.V. Otsenka effektivnosti prirodnykh antioksidantov v eksperimentakh in vitro i in vivo [The natural antioxidants effectiveness assessment in vitro and in vivo experiments]. Author's abstract of PhD thesis, 2004, p. 15.
4. Stasevich O .V., Klimashevich V.B., and Mikhalenok S.G. Effektivnost' polucheniya lignanobogashchennoi fraktsii s ispol'zovaniem netoksichnykh rastvoritelei [The effectiveness of a fraction enriched in lignans obtention using non-
toxic solvents]. Khimiya i khimicheskaya tekhnologiya - Chemistry and chemical technology, 2008, no.3, pp. 518-520.
5. Stasevic h O.V., Mikhalenok S.G., and Kurchenko V.P. VEZhKh analiz lignansoderzhashchikh ekstraktov iz semyan l'na maslichnogo [HPLC analysis of lignans containing extracts from flax seed]. Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy - Sorptive and chromatographic processes, 2008, vol. 8, pp. 903909.
6. Muir A.D., Lafond J., McAndrew D.W., May W., Irvine B., Grant C., Shirtliffe S., Bruulsema T.W., and Westcott N.D. Factors Affecting the Concentration of a Nutraceutical Lignan in Flaxseed. Proceedings of the Symposium on Fertilizing Crops for Functional Food (November 11, 2002), pp. 4.1-4.3.
7 . Re R., Pellegrini N., and Proteggente A. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assays. Free Rad. Biol. & Med., 1999, vol.26, no. 9/10, pp. 12311237.
