CC BY
1318
,,„ „„„,„,„,„„,„„. Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
УДК577.122.2:612.321.5:637.1
Будкевич Р. О., Чаликова А. В., Емельянов С. А., Слюсарев Г. В. Budkevich R. O., Chalikova A. V., Emelyanov S. A., Slusarev G. V.
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛИЗАТОВ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ МОЛОКА, ПОЛУЧЕННЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТА ПЕПСИНА
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF WHEY PROTEIN HYDROLYZATE OF MILK WITH USE OF THE ENZYME PEPSIN
Проведена оценка общей антиоксидантной активности (АОА) концентратов сывороточных белков молока до и после 30 минутного гидролиза пепсином при температуре 37 °С (соотношение фермент/субстрат 1:30 при рН = 1,8)амперометри-ческим методом по эквиваленту галловой кислоты с использованием прибора «ЦветЯуза 01-АА».Растворы исследуемых образцов в порядке увеличения АОА распределились следующим образом: КСБ 35 из подсырной деминерализованной сыворотки < КСБ 35 из подсырной сыворотки < КСБ 55 ЗАО «Сыродельный комбинат «Ленинградский» < КСБ 35 из творожной сыворотки < МПБ 55 Бтр1евве< КСБ 60 из подсырной сыворотки < КСБ 55 г. Береза (Республика Беларусь).
При гидролизе выделено две группы концентратов белков - с низкой и высокой АОА. У белковых концентратов с низкой АОА (КСБ 35 из подсырной деминерализованной сыворотки; КСБ 35 из подсырной сыворотки; КСБ 55 Ленинградка) в процессе гидролиза уровень АОА не изменился. Концентраты белков с повышенным уровнем АОА (КСБ 35 из творожной сыворотки, МПБ 55 (81тр1евве), КСБ 60 из подсырной сыворотки, КСБ 55 г. Береза) при гидролизе пепсином характеризовались ростом АОА после начала реакции. В ходе гидролиза уровень АОА снижался и к его окончанию (через 30 минут) уровень АОА был ниже исходных показателей.
Согласно полученным данным существует специфичность протеолитического действия пепсина, что не позволяет образовываться продуктам гидролиза с повышенной АОА в условиях, приближенных к пищеварению.
Ключевые слова: антиоксидантная активность, пепсин, гидролиз белков, концентраты сывороточных белков, ферментативный гидролиз.
In this work, the total antioxidant activity (TAA) of whey protein concentrates (WPC) was estimated before and after 30 min pepsin hydrolysisat 37 °C. Ratio enzyme:substrate was 1:30 at pH 1.8. Antioxidant activity of compounds was assessed by amperometric method using analyzer «TsvetYauza-01-AA» («Chimavtomatika Ltd.», Moscow). Solutions of WPC probes was distributed according to TAA increasing:WPC 35 of demineralized cheese whey < WPC 35 of cheese whey < WPC 55 ZAO «Cheese producing factory «Leningradsky» < WPC 35 of curd whey <microparticulated whey proteins 55 Simplesse< 60 WPC of cheese whey < WPC 55 Bereza (Belarus).
Two groups of whey protein concentrates with low and high AOAhave been found after hydrolysis. WPC with low TAA (WPC 35 of demineralized cheese whey, WPC 35 of cheese whey, WPC 55 ZAO «Cheese producing factory «Leningradsky») have been demonstrated no difference of TaA level after hydrolysis. At the same time, WPC with high TAA (WPC 35 of curd whey, microparticulated whey proteins 55 Simplesse, 60 WPC of cheese whey, WPC 55 Bereza)showed increase of TAA at start of pepsin hydrolysis, whereas at 30 min TAA was below initial level.
These findings suggest that there is the specificity of the proteolytic action of pepsin, which does not allow forming the hydrolysis products with high TAA in conditions close to digestion.
Key words: total antioxidant activity, pepsin, protein hydrolysis, whey protein concentrate, fermentative hydrolysis.
Будкевич Роман Олегович -
кандидат биологических наук, заведующий научно-исследовательской лабораторией «Нанобиотехнология и биофизика» Центра коллективного пользования Северо-Кавказский федеральный университет г. Ставрополь Тел.: +7-962-445-20-91 E-mail: budkev@mail.ru
Чаликова Анна Владимировна -
магистр кафедры прикладной биотехнологии Северо-Кавказский федеральный университет г. Ставрополь Тел.: +7-961-477-27-70 E-mail: anka92_10@mail.ru
Емельянов Сергей Александрович -
кандидат биологических наук, доктор технических наук, профессор кафедры экологии и ландшафтного строительства
Ставропольский государственный аграрный университет г. Ставрополь Тел.: 8(8652)71-72-50 E-mail: sergemelyan@mail.ru
Budkevich Roman Olegovich -
Ph.D in Biology, head of scientific research laboratory of nanobiotechnology and biophysics, Center for collective use, North-Caucasus Federal University Stavropol
Tel.: +7-962-445-20-91 E-mail: budkev@mail.ru
Chalikova Anna Vladimirovna -
the master of the Department of applied biotechnology, North-Caucasus Federal University Stavropol
Tel.: +79614772770 E-mail: anka92_10@mail.ru
Emelyanov Sergey Aleksandrovich -
Ph.D in Biology, doctor of technical sciences,
Professor of Department of ecology and landscape
construction of the
Stavropol state agrarian University
Stavropol
Tel.: 8(8652)71-72-50 E-mail: sergemelyan@mail.ru
в
естник АПК
Ставрополья
:№ 3(19), 2015
Слюсарев Геннадий Васильевич -
доктор технических наук, профессор кафедры информационной безопасности автоматизированных систем
Северо-Кавказский федеральный университет г. Ставрополь Тел: 8(8652) 95-65-46 E-mail: sgv@ncstu.ru
Агроинженерия
19
Slyusarev Gennady Vasilyevich -
doctor of technical sciences, Professor of the Department of applied biotechnology North-Caucasus Federal University Stavropol
Tel: 8(8652) 95-65-46 E-mail: sgv@ncstu.ru
В современных условиях актуальной является проблема получения пищевых продуктов с заданными биолого-химическими свойствами для людей с нарушениями здоровья. Окислительный стресс играет важную роль в этиологии различных болезней образа жизни, в том числе сердечно-сосудистыхзаболеваний, диабета, нейродегенеративных расстройств, некоторых видоврака и старения [1]. В условиях хронического действия факторов стрессах и развития оксидативно-го стресса большой интерес привлекают-продукты, проявляющие антиоксидантную активность [2]. Гидролизат сывороточных белков молока с антиоксидантной актив-ностьюпредставляет ценный компонент пищи,обеспечиваяметаболические процессы в организмеолигопептидами и аминокислотами, и поддерживая антиокси-дантный статус организма. Продукты с гидролизатами белков молока активно используются как антиоксиданты [3], а так же у людей с аллергией на белки молока [4, 5]. Сывороточные белки богаты метио-нином и цистеином, важность этих аминокислот заключается в поддержании уровня антиоксидантов в организме. При переработке сывороточных белков как биологически активной фракции молочных белков существуют технологические проблемы, требующие решений в разработке эффективных ферментативных процессов [6]. Преимуществом ферментативного гидролиза является стабильность условий, что практически не влияет на разрушение аминокислот ипри сохранении биологической ценности конечного продукта [7, 8].
Целью данной работы являлось исследование антиоксидантной активности(АОА) сывороточных белков молока в процессе ферментативного гидролиза ферментом пепсином в условиях приближенных к пищеварению.
Материалы и методы исследования
Объектами исследований являлись концентраты сывороточных белков молока (КСБ) и микропартикулятсывороточных белков (МПБ) разных производителей с различным содержанием белка.
1. КСБ 35 деминерализованная- из подсыр-ной деминерализованной сыворотки, экспериментальный образец;
2. КСБ 35 подсырной - из подсырной сыворотки, содержит в своем составе 35 % белка, экспериментальный образец;
3. КСБ 55 Ленинградка - содержит в своем составе 55 % белка, произведенный ЗАО «Сыродельный комбинат «Ленинградский» (Краснодарский край);
4. КСБ 35 - из творожной сыворотки, содержит в своем составе 35 % высококачественного белка, экспериментальный образец;
5. МПБ 55 - втр^вве (микропартикулят белка) - содержит в своем составе 55 % белка, произведен СР Ке1со (США), получен из концентрата сывороточного протеина;
6. КСБ 60 - из подсырной сыворотки, содержит в своем составе б0 % белка, экспериментальный образец;
7. КСБ 55 г. Береза - содержит в своем составе 55 % белка, произведен компанией ОАО «Березовский сыродельный комбинат» г. Береза (Республика Беларусь).
Все концентраты сывороточных белков молока и микропартикулят белка изначально находились в сухом виде и были восстановлены дистиллированной водой до содержания сухих веществ 15 %. Для гидролиза белков моделировали процесс пищеварения в желудкес параметрами приближенными к физиологическим условиям пищеварения на основании опубликованных данных [9]. Гидролиз белков проводили 30 минут при температуре 37 °С, соотношение фермент/субстрат 1:30 при рН = 1,8.
Антиоксидантную активность исследовали амперометрическим методом по эквиваленту галловой кислоты с использованием прибора «ЦветЯуза 01-АА» (ЗАО «АП Химавтоматика», Россия). Метод основан на измерении электрического тока в ячейке, возникающего при окислении (восстановлении) анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода и позволяет оценить общую антиоксидантную активность исследуемого раствора.Исследования проведены на базе нИл «Нанобиотехно-логия и биофизика» ЦКП СКФУ в соответствии с инструкцией к прибору и ГОСТ Р 54037-2010.
Результаты исследования
и их обсуждение
Перед проведением гидролиза все образцы были исследованы на уровень АОА ив соответствии с этими даннымиразделены на 4 группыпо степени увеличения АОА (рис. 1). В первой группе с наименьшей активностью был один образец. Выявлено, что КСБ 35 из подсырной деминерализованной сыворотки (образец № 1) проявляет АОА соответствующую 0,05±0,017 мг/л. Во второй группе выделяли два образца: КСБ 35 из подсырной сывороткии КСБ 55 Ленинградка. В пробе КСБ 35 из подсырной сыворотки без де-
20
,,„ „„„,„,„,„„,„„. Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
минерализации уровень АОА составил 0,21±0,03 мг/л. АОА КСБ 55 Ленинградка достоверно не отличалась и составляла 0,3±0,03 мг/л.
В третей группе образцы № 4 и № 5 проявляли близкие значения АОА: КСБ 35 из творожной сыворотки - 0,78±0,038 мг/л и МПБ 55 81тр!евве (микропартикулят белка) - 0,89±0,043 мг/л. К данной группе был отнесен образец № 6 (КСБ 60 из подсырной сыворотки), проявляющий АОА выше перечисленных образцов (1,21±0,152 мг/л), но не имеющий стабильных показателей АОА получаемых амперометрическим методом. В четвертой группе с наибольшей АОА был образец № 7 (КСБ 55 г. Береза) с эквивалентом галловой кислоты 1,61 ±0,118 мг/л. Следует от-
метить, что АОА данного образца достоверно не отличалось от образца № 6, но была в 2 раза выше показателя образца № 5.
Моделирование процесса пищеварения в желудке с использованием пепсина при рН = 1,8 в начальный момент при добавлении фермента и изменении рН привело к росту уровня АОА в сравнении показателямирастворов исследуемых образцов белка (рис. 1). Следует отметить отсутствием стабильных показателей АОА в образце КСБ 60 из подсырной сыворотки как в растворе, так и в начальный момент гидролиза. При анализе динамики изменения АОА по исследуемым концентратам белков выделено две группы.
Рисунок 1 - Антиоксидантная активность по эквиваленту галловой кислоты (порядковый номер в тексте)раствора сывороточных белков до гидролизаи при гидролизе при рН = 1,8.
В группус низкой АОА(НАОА) были отнесены: КСБ 35 из подсырной деминерализованной сыворотки, КСБ 35 из подсырной сыворотки, КСБ 55 Ленинградка (образцы № 1; № 2 и № 3). Все три образца проявляли сниженную АОА в растворах белков и при гидролизе. За период исследования гидролиза наблюдались тенденции в колебании АОА, но достоверного изменения исследуемого показателя не наблюдалось.
В группу с высокой АОА (ВАОА) выделили: КСБ 35 из творожной сыворотки, МПБ 55 (81тр!евве), КСБ 60 из подсырной сыворотки, КСБ 55 г. Береза (образцы № 4 - № 7). Данные образцы в растворе проявляли АОА достоверно выше, чем белки группы НАОА. В начале гидролиза белки группы ВАОА характеризовались высокой вариабельностью значений АОА. Затем фиксировалось снижение уровня АОА с постепенным понижением данного показателя до исходного уровня.
Анализ полученных результатов указывает на отсутствие зависимости между известными характеристиками исследуемых белков (доля белка в концентрате, сырье для производства концентрата,технологическая трансформация белков). Механизм, лежащий в основе определения АОА,может быть связан с белками как ин-
гибиторами перекисного окисления липидов, поглотителями свободных радикалов и хелати-рующими соединениями ионов переходных металлов [10]. Использованный метод ампероме-трической оценки АОА коррелирует с другими методами (ABTS-basedmethod, FRAP), что доказано при определении АОА молока [11] и может быть использовано в оценкеАОА белков молока. Отсутствие изменения АОА и снижение уровня АОА исследуемых белков может быть обусловлено применением пепсина, поскольку в аналогичных исследованиях сывороточных белков гидро-лизаты полученных с использованием пепсина проявляли низкую АОА в сравнении с трипсином и химотрипсином [12]. Данные результаты могут быть обусловлены спецификой действия пепсина на гидрофобные, главным образом ароматические остатки и увеличением числа пептидных связей при гидролизе пепсином.
Таким образом, оценка АОА амперометрическим методом концентратов сывороточных белков молокапозволил расположить белки в порядке изменения АОАне зависящий от характеристик исследуемых белков (доля белка в концентрате, сырье для производства концентрата, технологическая трансформация белков). Гидролиз пепсином белков с низким
в
естник АПК
Ставрополья
! № 3(19), 2015
Агроинженерия
21
уровнем АОА в процессе гидролиза обеспечил стабильный уровень АОА. У белковых концентратов с повышенным уровнем АОА гидролиз пепсином вызывает рост АОА с последующим снижением АОА ниже исходных значений. Со-
гласно полученным данным существует специфичность протеолитического действия пепсина. Это не позволяет получить гидролизаты пепсина с повышенной АОА в условиях приближенных к пищеварению.
Литература
1. Beckman K. B. .Ames B. N. The free radical theory of aging matures // Physiological reviews. 1998. Vol. 78., № 2. P. 547-581.
2. Gulgin I. Antioxidant activity of food constituents: an overview // Archives of toxicology. 2012. Vol. 86. № 3. P. 345-391.
3. Pihlanto A. Antioxidative peptides derived from milk proteins // International dairy journal. 2006. Vol. 16., № 11. P. 1306-1314.
4. Hydrolyzed formulas for allergy prevention / Y.Vandenplas,J.Bhatia, R.Shamir, C.Agostoni, D. Turck, A. Staiano, H. Szajewska // Journal of pediatric gastroenterology and nutrition. 2014. Vol. 58., № 5. P. 549-552.
5. The role of partially hydrolyzed whey formula for the prevention of allergic disease: evidence and gaps / A. J. Lowe, S. C. Dharmage, K. J. Allen, M. L. Tang, D. J. Hill // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol. 9., № 1. P. 31-41.
6. Мироненко И. М., Чорей Е. В. Особенности переработки сывороточных белков молока // Сыроделие и маслоделие. 2009. № 2. C. 40-41.
7. Максимюк Н. Н., Марьяновская Ю. В. О преимуществах ферментативного способа получения белковых гидролизатов // Фундаментальные исследования: материалы конференции. 2009. №1. C. 34-35.
8. Рытченкова. О. В., Красноштанова А. А. Оптимизация процесса получения ферментативных гидролизатов белков молочной сыворотки с применением протеоли-тических ферментов // Фундаментальные исследования. 2011. № 8-3. С. 663-666.
9. Коротько Г Ф. Желудочное пищеварение в технологическом ракурсе // Кубанский научный медицинский вестник. 2006. № 7-8. C. 17-22.
10. Production and characterization of whey protein hydrolysate having antioxidant activity from cheese whey / S. Athira, B. Mann, P. Saini, R. Sharma, R. Kumar, A. K. Singh // Journal of the science of food and agriculture. 2014. doi: 10.1002/jsfa.7032.
11. Antioxidant capacityof bovine milk asassayed by spectrophotometric and amperometric methods / J. Chena, H. Lindmark-Manssona, L. Gortonc, B. Akessona // International dairy journal. 2003. Vol. 13., № 12. P. 927-935.
12. Screening of whey protein isolate hydrolysates for their dual functionality: influence of heat pre-treatment and enzyme specificity / R. Adjonu, G. Doran, P. Torley, S. Agboola // Food chemistry. 2013. Vol. 136, № 3-4. P. 1435-43.
References
1. Beckman K. B. Ames B. N. The free radical theory of aging matures // Physiological reviews.1998. Vol. 78. № 2. P. 547-581.
2. Gulgin I. Antioxidant activity of food constituents: an overview // Archives of toxicology. 2012. Vol. 86. № 3. P. 345-391.
3. Pihlanto A. Antioxidative peptides derived from milk proteins // International dairy journal. 2006. Vol. 16. № 11. P. 1306-1314.
4. Vandenplas Y., Bhatia J., Shamir R., Agostoni C.,TurckD., Staiano A., Szajewska H. Hydrolyzed formulas for allergy prevention // Journal of pediatric gastroenterology and nutrition. 2014. Vol. 58. № 5. P. 549-552.
5. Lowe A. J., Dharmage S. C., Allen K. J., Tang M. L., Hill D. J. The role of partially hydrolyzed whey formula for the prevention of allergic disease: evidence and gaps // Expert review of clinical immunology 2013. Vol. 9. № 1. P. 31-41.
6. Mironenko, I. M., Chorey E. V. Features of whey protein processing // Cheese making and butter-making. 2009. № 2. P. 40-41.
7. Maksimyuk N. N., Maryanovsky Y. V. About the advantages of the enzymatic method of obtaining protein hydrolysates // Fundamental research: proceedings of the conference. 2009. № 1. P. 34-35.
8. Rytchenkova. O. V., Krasnoshtanova A. A. Optimization of the process of production of enzymatic hydrolysates of whey proteins with the use of proteolytic enzymes // Fundamental research. 2011. № 8-3. P. 663-666.
9. Korotko G. F. Gastric digestion in the technological perspective // Kuban scientific medical journal. 2006. № 7-8. P. 17-22.
10. Athira S., Mann B., Saini P., Sharma R., Kumar R., Singh AK. Production and characterization of whey protein hydrolysate having antioxidant activity from cheese whey // Journal of the science of food and agriculture. 2014. doi: 10.1002/jsfa.7032.
11. Chena J., Lindmark-Manssona H., Gortonc L., Akessona B. Antioxidant capacity of bovine milk as assayed by spectrophotometric and amperometric methods // International dairy journal. 2003. Vol. 13. №12. P. 927-935.
12. Adjonu R., Doran G., Torley P., Agboola S. Screening of whey protein isolate hydrolysates for their dual functionality: influence of heat pre-treatment and enzyme specificity // Food chemistry. 2013. Vol. 136, № 3-4. P. 1435-43.
