CC BY
104
УДК 633.88
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ ИЗ BERGENIA CRASSIFOLIA (L.) FRITSCH. И VACCINIUM VITIS-IDAEAE L. IN VITRO
© П.Б. Лубсандоржиева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: bpunsic@mail.ru
Изучена антиоксидантная активность (АОА) извлечений из Bergenia crassifolia (L.) Fritsch, и Vaccinium vitis-idaeae L. Установлено, что наибольший вклад в суммарную АОА извлечений вносят дубильные вещества и флавоноиды. Присутствие арбутина в экстрактах в высоких концентрациях существенного влияния на суммарную АОА извлечений не оказывает.
Введение
Корни, черные (перезимовавшие) листья Bergenia crassifolia (L.) Fritsch., листья Vaccinium vitis-idaeae L. входят в состав разработанных нами 2 гепатопротекторных и 1 гиполипидемического сборов, показавших в экспериментах на животных выраженную антиоксидантную активность (АОА) [1-3]. Опыты in vitro дали следующий результат: отвары листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. и V. vitis-idaeae L. имеют наибольшие значения АОА по сравнению с другими компонентами сборов [4].
Цель данной работы - оценить антиоксидантную активность извлечений из корней и листьев B. crassifolia (L.) Fritsch., листьев V. vitis-idaeae L. in vitro.
Экспериментальная часть
Собранные в Прибайкальском районе Республики Бурятия (хребет Улан-Бургасы) в весенне-осенний период 2002-2003 гг. и высушенные листья (зеленые и черные) B. crassifolia (L.) Fritsch. и V. vitis-idaeae L. измельчали до размера частиц 2 мм, экстрагировали соответствующими растворителями в соотношении сырье : экстрагент - 1:10, растворитель удаляли, экстракт высушивали в вакуум-сушильном шкафу. Выход экстрактов от массы сырья составляет: из зеленых листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. при 3-кратной экстракции 60%-ным этанолом - 40,5% (экстракт №1); из черных, перезимовавших листьев при 3-кратной экстракции 60%-ным этанолом - 16,2% (экстракт №2); при 1-кратной экстракции водой - 36,0% (экстракт №3); из корней B. crassifolia (L.) Fritsch. при 1-кратной экстракции кипящей водой - 33,0% (экстракт №4); из листьев V. vitis-idaeae L. при 1-кратной экстракции кипящей водой - 38,0% (экстракт №5).
50 г сухого экстракта зеленых листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. растворили при нагревании в 500 мл дистиллированной воды, затем обработали хлороформом до осветления раствора, водный остаток обработали этилацетатом 5-кратно по 200 мл. Этилацетат отогнали в роторном испарителе, сухой остаток досушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход фракции - 16,0% от исходной массы экстракта (экстракт №6). Водный остаток после удаления липофильных веществ обработали 200 мл н-бутанола, обработку повторили четырежды. Бутанол отогнали на роторном испарителе в азеотропной смеси с водой, сухой остаток досушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход фракции - 28% от исходной массы экстракта (экстракт №7).
20 г экстракта №5 V. vitis idaeae L. растворили в 500 мл дистиллированной воды, добавили 40 мл 10%-ного раствора ацетата свинца, колбу с содержимым выдерживали на кипящей водяной бане до полной коагуляции осадка. Горячую жидкость отфильтровали, концентрировали, высушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход полученного экстракта - 42,6% от исходной массы экстракта (экстракт №8).
Количественное содержание дубильных веществ в пересчете на таннин, антоцианов в пересчете на циа-нидин-3,5-дишлюкозид, флавоноидов в пересчете на рутин определяли по методике ГФ [5].
Хроматоспектрофотометрическое определение арбутина. 0,1 г (точная навеска) экстракта растворяли в 100 мл 40%-ного этилового спирта. 2,0 г окиси алюминия, промытого дистиллированной водой до нейтральной реакции, помещали в стеклянную колонку диаметром 1,5 см и высотой 25 см, промывали 10 мл дистиллированной воды, затем 10 мл 40%-ного этилового спирта. 1 мл экстракта помещали в колонку с окисью алюминия и элюировали 25 мл 40%-ного этилового спирта. Элюат собрали в мерную колбу вместимостью 25 мл, довели объем раствора до метки 40%-ным этиловым спиртом (раствор А). Оптическую плотность раствора А измеряли на спектрофотометре при длине волны 285 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 40%-ный этиловый спирт, пропущенный через колонку с окисью алюминия. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора арбутина, предварительно полученного из зеленых листьев бадана.
Содержание арбутина в процентах вычисляли по формуле
X D х m0х100х25х100х100 D0 х m х 25 х100 х (100 - w) ’
где D - оптическая плотность испытуемого раствора А; Do - оптическая плотность образца арбутина; m -навеска экстракта, г; mo - навеска арбутина, г; w - потеря в массе при высушивании экстракта, %.
Приготовление раствора арбутина. 0,05 г (точная навеска) высушенного при 75 оС арбутина растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки 40%-ным этиловым спиртом. 1 мл раствора арбутина помещали на колонку с окисью алюминия и элюировали 25 мл 40%-ного этанола.
Получение образца арбутина. 50 г высушенных и измельченных зеленых листьев бадана с влажностью 6%, содержанием арбутина 18,7% поместили в колбу вместимостью 1 л, добавили 500 мл воды дистиллированной, экстрагировали на водяной бане с обратным холодильником при температуре 90 °С в течение 1 ч. Экстракцию повторили в тех же условиях. 830 мл извлечения (плотность 1,007 г/см3) сепарировали для очистки от балластных веществ. Очищенный экстракт упарили до объема 300 мл, добавили 25 мл 10%-ного раствора ацетата свинца, нагревали на водяной бане до полной коагуляции осадка, затем отфильтровали. Объем очищенного экстракта - 260 мл, упарили досуха, сухой остаток экстрагировали 50 мл 95%-ного этилового спирта на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Экстракцию повторили дважды в тех же условиях. Спиртовые извлечения объединили, растворитель отогнали на роторном испарителе, к оставшемуся маслянистому остатку прилили 50 мл смеси хлороформ-этанол (1,2 : 1), экстрагировали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Экстракцию повторили дважды в тех же условиях. 150 мл извлечения охладили, оставили на 24 ч. Получены тонкие игольчатые кристаллы арбутина белого цвета -2,029 г. Арбутин перекристаллизовали из смеси хлороформ-этанол (1,2:1), выход чистого арбутина - 84%, т. пл. 164-167 °С, УФ-спектр (С2Н5ОН), Xmax, нм: 285. ИК-спектр, vmax, см-1: 3346 (OH), 1634, 1513 (C=C), 1215, 1100, 831, 817.
Для изучения антиоксидантной активности in vitro использована модельная система, представляющая собой суспензию желточных липопротеидов. АОА извлечений определяли по способности тормозить накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в суспензии желточных липопротеидов со спектрофотометрическим детектированием при 532 нм [6]. Величину АОА выражали в С S, (г/л)-1 - концентрация экстракта, необходимая для ингибирования образования малонового диальдегида (МДА) на 50%.
Обсуждение результатов
Результаты количественного определения фенольных соединений в извлечениях из листьев и корней бадана, брусники и их суммарной АОА приведены в таблице. Данные опытов показывают, что наибольшей АОА из изученных фенольных комплексов листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. обладает этилацетатная фракция, очищенная от липофильных и водорастворимых веществ, в том числе арбутина. Экстракт №6 подавляет образование МДА более эффективно, чем исходный экстракт №1, причем различия более значимы в малых дозах экстрактов: в дозе 0,03-0,04 мг/мл - на 20-27%, 0,08-0,1 мг/мл - на 10%. В этидацетатной фракции содержатся среднеполярные фенольные вещества (флавоноиды, фенолокислоты, антоцианы и др.) [7], обладающие высокой АОА по литературным данным [8-10].
Содержание фенольных соединений и антиоксидантная активность извлечений из B. crassifolia (L.) Fritsch. и
V. vitis-idaeae L
Наименование, № АОА, С S, (г/л)-1 Содержание фенольных соединений*, %
дубильные вещества флавоноиды антоцианы арбутин
Экстракт 1 40 32,20 3,88 0,62 38,84
Экстракт 2 38 22,02 5,41 2,46 10,63
Экстракт 3 45 27,21 1,10 0,09 10,70
Экстракт 4 11 41,06 - 0,03 29,40
Экстракт 5 29 7,05 3,63 0,93 7,31
Экстракт 6 50 87,08 4,40 0,48 -
Экстракт 7 33 27,82 1,48 0,13 48,40
Экстракт 8 26 28,33 1,42 0,98 32,81
Примечание: прочерк означает, что вещества не обнаружены; * - среднее из трех определений.
Результаты опытов показывают, что присутствие арбутина незначительно влияет на АОА извлечений. Фракция фенологликозидов V. vitis idaeae L (экстракт №8) имеет сопоставимую АОА с водным экстрактом, при этом содержание арбутина в экстракте №8 в 4,5 раза больше, чем в экстракте ОБР №5. Известно, что в эксперименте in vivo арбутин оказывал меньшую антирадикальную активность на модели с супероксидным и гидроксильным радикалом по сравнению с суммарным экстрактом V. vitis idaeae L, содержащим такое же количество арбутина [11]. Снижение суммарной АОА экстрактов, содержащих арбутин, очевидно, обусловлено образованием посредством водородной связи неактивных в обрыве цепей окисления ассоциатов арбутина с пероксильными радикалами [12]. Таким образом, арбутин, несмотря на высокое содержание в изученных экстрактах, не вносит существенный вклад в их суммарную АОА, что согласуется с литературными данными.
Наиболее существенный вклад в суммарную АОА экстрактов вносят полифенолы и флавоноиды. Во флавоноидный состав листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. входят рутин, кверцетин, дигидрокверцетин [7], V. vitis-idaeae L. - кемпферол, кверцитрин, рутин, авикулярин, производные лютеолина [13]. Кверцетин, кемпферол, рутин, лютеолин обладают высокой АОА, в которую большой вклад вносит 3',4'-дигидрокси-фенильная группировка кольца В [10, 14]. АОА флавоноидов напрямую связана с количеством гидроксильных групп в их структуре, и с их способностью выступать в качестве восстановителя по отношению к свободным радикалам с образованием более стабильных флавоксильных радикалов, что приводит к ограничению инициации или обрыву цепной реакции свободнорадикального окисления [8, 14].
Данные опытов позволяют также сделать вывод, что наибольший вклад в суммарную АОА экстрактов вносят водорастворимые полифенольные вещества извлечений. Так, АОА экстракта №2, несмотря на более высокое содержание флавоноидов, сопоставимое количество полифенолов, меньше таковой водного экстракта №3 на 16%. Основным компонентом водорастворимых полифенолов черных листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. является галловая кислота [7], обладающая АОА на разных моделях окисления, сопоставимой с активностью признанного антиоксиданта - аскорбиновой кислоты [15]. АОА экстрактов V. vitis-idaeae L обеспечивают также водорастворимые таннины, спектр АОА которых довольно широк: циннамтаннин В-1 оказывал сильнейшую активность при перекисном окислении липидов; проантоцианидин А-1 - сильнейшую супероксид радикалперехватывающую активность; производное эпикатехина - сильное ингибирующее действие на процесс образования супероксида [16].
Выводы
Таким образом, основной вклад в суммарную АОА экстрактов бадана и брусники вносят фенольные соединения. Наибольшей АОА обладает этилацетатная фракция экстракта зеленых листьев B. crassifolia (L.) Fritsch, содержащая дубильные вещества и флавоноиды. Присутствие арбутина в экстрактах в высоких концентрациях существенного влияния на суммарную АОА извлечений не оказывает.
Список литературы
1. Лубсандоржиева П.Б., Дашинамжилов Ж.Б., Николаев С.М., Диль А.А. Разработка многокомпонентных сборов для лечения алкогольного гепатита на основе рецептуры традиционной медицины // Традиционная медицина. Восток-Запад. 2005. Т. 2. №4 (8). С. 43-49.
2. Патент 2171679 (Россия). Лекарственный сбор, обладающий гиполипидемическим и адаптогенным свойствами / Николаев С.М., Лубсандоржиева П.Б., Найданова Э.Б. и др. // Опубл. 10.08.2001. Бюл. №22.
3. Патент 2178706 (Россия). Лекарственный сбор для профилактики и лечения алкогольного абстинентного синдрома и алкогольного гепатита / Николаев С.М., Найданов С.А., Дашинамжилов Ж.Б., Лубсандоржиева П.Б. и др. // Опубл. 27.01.2002. Бюл. №3.
4. Лубсандоржиева П.Б., Дашинамжилов Ж.Б., Унагаева А.А. Сравнительная оценка антиоксидантной активности гепатопротекторных сборов и их компонентов in vitro: Мат. науч.-нракт. конф., носв. 75-летию Э.Г. Базарона. Улан-Удэ, 2006. С. 67-68.
5. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1987. Вып. 2. 340 с.
6. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкина Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. 1988. №5. С. 59-62.
7. Лубсандоржиева П.Б. Бадан толстолистный. Серия «Лекарственные растения тибетской медицины». Улан-Удэ, 2003. 90 с.
8. Foti M., Piatteli M., Baratta M.T., Rubetto G. Flavonoids, coumarins, and cinnamic acids as antioxidants in a micellar system. Structure - activity relationship // J. Agric. Food Chem. 1996. V. 44. P. 487-501.
9. Kong J.-M., Chia L.-S., Goh N.-K., Chia T.-F., Brouillard R. Analysis and biological activities of anthocyanins // Phytochemistry. 2003. V. 64. №5. P. 923-933.
10. Vinson J.A., Dabbagh Y.A., Serry M.M., Jang J. Plant flavonoids, especially tea flavonols, are powerful antioxidants using an in vitro oxidation model for heart disease // J. Agric. Food Chem. 1996. V. 43. P. 2800-2802.
11. Myagmar B.E., Shinno E., Ichiba T., Aniya Y. Antioxidant activity of medicinal herb Rhodococcum vitis-idaea on ga-lactosamine-induced liver injury in rats // Phytomedicine. 2004. V. 11. №3. P. 416-423.
12. Ковтун Г.А., Плужников В.А., Пилявский П.С. и др. Эффективность обрыва ценей окисления метилового эфира олеиновой кислоты природным фенологликозидом - арбутином // Дон. нац. АН Украины. 1995. №4. С. 88-89.
13. Васильев И.Б. Разработка технологии и норм качества жидкого и сухого экстракта листьев брусники: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Пятигорск, 1997. 21 с.
14. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Structure-activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radical Biology and Medicine. 1998. V. 24. №9. P. 1355-1363.
15. Aniya Y., Miyagi C., Nakandakari A., Kamiya S., Imaizumi N., Ichiba T. Free radical scavenging action of the medicinal herb Limonium wrightii from the Okinawa islands // Phytomedicine. 2002. V. 9. №2. P. 239-244.
16. Ho K.Y., Huang J.S., Tsai C.C., Lin T.S., Hsu Y.F., Lin C.C. Antioxidant activity of tannin components from Vaccinium vitis-idaea L. // J. Pharm. and Pharmacol. 1999. V. 51. №9. P. 1075-1078.
Поступило в редакцию 9 октября 2006 г.
