CC BY
16
© Король Л. В.
УДК 577.126:616.61-036.12 Король Л. В.
АНТИОКИСЛЮВАЛЬН1 ВЛАСТИВОСТ1 ТРАНСФЕРИНУ ПРИ МОДЕЛЮВАНН1 IN VITRO ПРОЦЕС1В ОКСИДАЦП ПРОТЁШ1В ТА Л1П1Д1В ПРИ ХРОН1ЧН1Й ХВОРОБ1 НИРОК
Державна установа «1нститут нефрологГГ НАМНУ» (м. КиГв)
lesyakorol@meta.ua
Дослiдження виконано згiдно плану НДР ДУ Институт нефрологи НАМН Укра!ни» «ЕСЗ-14 Фарма-ко-економнчне обгрунтування адекватного лкуван-ня анеми у пацieнтiв з хронiчною хворобою нирок ЧД стадiI» (№ державно! реестраци 0114У002013) та «Вивчити особливост етiо- та iмуногенезу реци-дивуючо! iнфекцií сечово! системи та створити новi способи II профiлактики» (№ державно! реестраци 0113U001201).
Вступ. На сьогодншнм день актуальним та прюритетним е напрямок щодо прогнозування in vitro ефективност лiкарського засобу з ураху-ванням особливостей iнтенсифiкацiI ОС в кровi при патологiI чи за шдивщуальним обстеженням самого патента. Активно також розробляються та впроваджуються в практику рiзнi модельнi системи, за допомогою яких можливо пiдтвердити або спрогнозувати клiнiчну ефективнють використання лiкарських препаратiв або хiмiчних сполук з анти-оксидантними властивостями для корекци окси-дантно-антиоксидантного (О/А) дисбалансу [5,6].
Останым часом доведено, що розвиток хроыч-но! хвороби нирок (ХХН) супроводжуеться зрос-танням концентраци продуктiв пероксидацiI та зниженням маркерiв антиоксидантного захисту (АОЗ), зокрема й вмюту трансферину (ТР). Цей металопроте!н е з одного боку гострофазним про-те!ном плазми кровi, що здебтьшого зростае при активному запальному процес [1,3], а з iншого -належить до позактнтинних антиоксидантiв i фiзi-ологiчна та антиоксидантна роль цього метало-проте!ду пов'язана з транспортом юыв Fe3+, а його недостатнють при ХХН сприяе зниженню АОЗ кровi та зменшенню активной системи обмiну залiза [4]. Показано також, що при розвитку активного запального процесу здебтьшого пщвищуеться вмют цього проте!ну, як внаслщок пiдвищеного синтезу печiнкою, так i як необхiдного проте!ну для тран-спортування залiза до депо еритропоезу, що особливо актуально, осктьки анемiя е одним з най-поширенiших синдромiв при ХХН [7,8]. В умовах пролонгованого ОС та в поеднанн з анемiею цей проте!н може знижуватися в кров^ а саме його функцiональна активнють щодо транспотування за-лiза до зон еритропоезу [4].
Метою дослщження було вивчення ефектив-ностi застосування антиоксидантного препарату (0,4% розчин трансферину) в умовах in vitro моде-
льованого окислення лтщв та проте!ыв на моделi зразкiв кровi пащен^в з ХХН.
Об'ект i методи дослщження. В якостi бю-логiчного матерiалу використовували зразки кровi умовно-здорових донорiв (група 1) та хворих з бак-терiальнозапальним процесом в нирках (група 2), iмунозапальним процесом в нирках (3 група) та хворих з хроычним запаленням, як лкувалися ге-модiалiзом (4 група, ХХНЧй). Кров для до^джен-ня забирали пюля 12-годинного голодування. По-передньо в зразках кровi цих хворих до^джували активнiсть процесiв перекисного окислення лтщв (ПОЛ), окисно! модифкаци протеIнiв, вмiст ТР, це-рулоплазмша. В результатi проведених дослiджень були сформован групи з урахуванням дiагнозу та особливостей О/А дисбалансу, що надалi використовували пiд час експерименту in vitro. У зразках кровi визначали iнтенсивнiсть спонтанного та Fe-iндукованого окиснення по накопиченню малонового дiальдегiду (МЦА) та карбонтьних груп проте-Тн1в (КГП) при моделюванн in vitro [1,2]. Для цього до дослщних та контрольно! проб вносили 0,1 мл кровi плазми, додавали 1,5 мл трис НС1-буфера з рН 7,4. Спонтанну оксидацт визначали пiсля ш-кубацiI (37пС) протягом 30 хв зразюв KpoBi з буфером (дослщна серiя К) та з додаванням 0,2 мл 0,4% розчину ТР (дослщна серiя КА). Для шщацм Fe-iндукованого ПОЛ i ОМП використовували серед-овище I - 25 ммоль/л трю-НС1-буфер рН7,4 та 20 мкмоль/л FeSO4 (дослщна серiя I) та з додаванням розчину ТР (дослщна серiя 1А). До складу друго! модельно! системи входило середовище II (- 0,85 мл 0,1 моль/л трю-HCl-буфера рН 7,4, по 0,05мл 1 ммоль/л ЕДТА i FeSO4 та 0,3 ммоль/л Н2О2) оц^ нювали бiльш сильну металiндуковану оксидацiю (дослщна серiя II) та з додаванням розчину ТР (дослщна серiя НА). Проби шкубували при 37°С годину, денатурували 20% розчином трихлороцтово! кис-лоти та центрифугували при 3000g 20 хв. В супер-натантi за реакцiею з тюбарб^уровою кислотою визначали вмiст МДА. До денатурованих проте!нових осадiв додавали 1,0 мл 0,1 моль/л розчину 2,4-дши трофентгщразину для визначення вмюту КГП. Пщ-бiр концентрацiй ТР був емтричним з урахуванням описаних в лiтературi концентрацiй.
В робот було використано реактиви: 2,4-д^ ытрофентгщразин, ЕДТА, фiрми «Sig ma- Ald rich» (США), сечовина, трю, трихлороцтова та тюбарб^
Таблиця.
Вплив застосування in vitro ТР при моделюваннях оксидативних реакцш пацieнтiв з
хронiчною хворобою нирок
Групи Режими стимуляцп ^^^ Вм1ст КГБс, ум. од /мл Вм1ст МДАс, мкмоль/л
Група 1 n = 20 Група 2 n = 16 Група 3 n = 10 Група 4 n = 22 Група 1 n = 20 Група 2 n = 16 Група 3 n = 10 Група 4 n = 22
1 2 3 4 1 2 3 4
Спонтанна (К) 1,09 ± 0,10 1,94 ± 0,21 2,49 ± 0,21 2,36 ± 0,19 119 ± 35 312 ± 11 331 ± 19 478 ± 31
Спонтанна +ТР (КА) 0,93 ± 0,15 1,66 ± 0,15 1,89 ± 0,27 1,79 ± 0,17* 94 ± 39 256 ± 27* 268 ± 27 352±27*
Металшдукована (1) 1,38 ± 0,18 1,98 ± 0,18 3,12 ± 0,24 3,11 ± 0,17 172 ± 27 372 ± 29 392 ± 24 567 ± 31
Металшдукована (1) + ТР 1,12 ± 0,15 2,04 ± 0,108 2,77 ± 0,13 2,73 ± 0,17 166 ± 39 304 ± 31* 362 ± 19 422 ± 28*
Металшдукована (II) 1,84 ± 0,14 3,66 ± 0,21 6,02 ± 0, 15 5,92 ± 0,17 279 ± 43 416 ± 25 548 ± 23 769 ± 29
Металшдукована (II)+ ТР 1,62 ± 0,14 2,99 ± 0,35 5,58 ± 0, 18 4,76 ± 0,17 * 222 ± 41 342±23* 494 ± 30 592 ± 34*
Примiтка: * - BiporwHa pi3HMU^ порiвняно з piBHeM стимуляцп
TypoBa kmc.otm 0ipMM «Merck» (HiMeHHMHa), TpaHc-0epuH «Fluka», iH±i peaKTMBU BiTHM3HHHoro Bupo6HM-^ma. BiporigHicTb pi3HM^ o^HioBanu 3a t-KpuTepieM CTbiogeHTa. CTaTucTMHHUM aHarii3 pe3y.bTaTiB npo-BoguriM 3a gonoMoroio nporpaM Microsoft Excel 5,0.
Pe3y^bTaTM Aoc.nÏAweHHfl Ta ïx o6roBopeHHA. Ha nepioMy eTani eKcnepuMeHTy npoBoguriocfl go-criiflxeHHH aKTUBHocTi пpoцeсiв cnoHTaHHoï Ta ctm-MyriboBaHoï oKcufla^ï npoTeïHiB Ta riinigiB. AHarii3 pe3y.bTaTiB npogeMoHcTpyBaB nigBMi^eHHH cnoH-TaHHoro yTBopeHH^ Krnc Ta MflAc y Bcix gocriiflHMx rpynax (Ta6.n.).
BHeceHHH go gocriiflHMx 3pa3KiB KpoBi 0,2 M. 0,4% po3HMHy TP (3 noga.bmora iHKy6a^eio) cnpuario HacTKoBoMy 3HMxeHHio cnoHTaHHoï npogy^iï MflAc Ha 18% (pgo/CT< 0,05) y 2-m rpyni Ta Krnc Ha 24% (pgo/cT < 0,05)7 MflAc Ha 26% (pgo/cT < 0,05) y 4-m rpyni (3xXHlVfl).
3acTocyBaHH^ TP npu MogeriioBaHHi in vitro Fe2+ cTUMy.boBaHoro HeeH3MMHoro oKucHeHHH cnpua-rio 3MeHi±ieHHio npogy^iï MflAc (pgo/cT < 0,05) y 2-m Ta 4-m rpynax (na^eHTiB 3 6aKTepia.bHo3ana.bHMM пpoцecoм Ta XXHVD). BuKopucTaHHH po3HMHy TP b Mo.ge.rmx 3 3acTocyBaHH^M 6i.b± noTyxHoro okcm-gaHTa cnpuRro 3HMxeHHio yTBopeHHH Krnc Ha 20% (pgo/cT < 0,05), MflAc Ha 23% (pgo/cT < 0,05 ) y 4-m rpyni (xBopux Ha XXHVD) Ta MflAc 'Hna' T 18% (pgo/cT < 0,05) y 2-m rpyni (xBopux 3 6aKTepiarbHo3anarbHMM npo-цecoм b HMpKax). HaM6irb± e^eKTMBHMM 6yro bmko-pucTaHH^ npenapTy TP y 4-m rpyni. Marioe^eKTMBHMM, 3a gaHMMM in vitro MogernoBaHHa пpoцeciв oKucHeHHH npoTeïHiB Ta rinigiB, 6yro 3acTocyBaHHH TP y 3-m rpyni (na^eHTM 3 iMyHo3anarbHMMM ypaxeH^MM HupoK), i^o, cKopii 3a Bce, Moxe 6yTM 3yMoB.eHo gocuTb HM3bKM-MM piBH^MM ^pynonna3MiHy b cupoBa^i KpoBi y TaKux xBopux, KoTpuM 6epe yHacTb b oKucreHHi Fe2+ b nra3Mi KpoBi, a yTBopeHe Fe3+ noTiM B6ygoByeTbca b MoreKyry ano-TP i TpaHcnopTye b KicTKoBMM mo3ok, ge Big6yBa-eTbca cuHTe3 reMy [4].
Осюльки ф1з1олог1чна та антиоксидантна роль ТР пов'язана саме з транспортуванням Fe3+, то недостатне його утворення, внаслщок низькоУ функцюнальноУ активност1 церулоплазм1ну, не дае можпивост1 насичуватися ТР зал1зом та проявляти антиоксидантну активн1сть даного протешу плаз-ми. У 2-й та 4-й дослщних групах (пац1ент1в з бак-тер1альнозапальним процесом в нирках та XXHVD) р1вн1 церулоплазмшу в сироватц1 кров1 знаходилися в межах ф1зюлопчно'| норми, що сприяло виявлен-ню необхщноУ активност1 системи окислення Fe2+ i потенц1ювало антиоксидантний ефект ТР при in vitro моделюванн процеЫв оксидацiï. Якщо екстра-полювати данi експерименту на можливу клiнiчну eфeктивнiсть застосування пpeпаpатiв ТР, то, ймо-вipнiшe за все, ефективними для застосуванням пpeпаpатiв, до складу яких входить ТР, е стани, що характеризуются його функцюнальною недостат-нiстю та супроводжуються нормальним або пщви-щеним piвнeм церулоплазмшу в кровг
До того ж, дана методика до^дження може бути використана з метою прогнозування ефектив-ност застосування таких пpeпаpатiв з шдивщуаль-ним пiдходом до патента, ще до використання Ух in vivo. Це дасть можливють спрогнозувати Ух май-бутню eфeктивнiсть. Особливо актуальним це е для па^ен^в з ХХН VD, яким необхщне призначення цього препарату з метою корекци залiзодeфiцит-них станiв та анемИ'.
Висновки. Встановлено, що використання ТР при моделювання in vitro процеЫв оксидаци сприяло частковому зниженню спонтанно! та металш-дукованоУ продукцИ' МДАс у пацiентiв з бактер^ ально-запальним процесом в нирках, атакож КГПс i МДАс - у па^ен^в з XXHVD. Використання ТР в моделях з застосуванням бтыш потужного окиданта сприяло зниженню продукцИ' КГПс та МДАс у груп хворих на XXHVD та МДАс - у груп хворих з бакте-piально-запальним процесом в нирках. Малоефек-
тивним було застосування in vitro ТР у 3-й груп (при iмунозапальному процес в нирках), що може бути зумовлено досить низькими рiвнями церулоплаз-мiну в сироватцi кровi у таких хворих. Ймовiрнiше за все, що ефективним для застосування препаратв, до складу яких входить ТР, будуть стани, що характеризуются його функцюнальною недостатнютю
та супроводжуються нормальним або пiдвищеним piBHeM церулоплазмшу в сироватцi кровi.
Перспективи подальших дослiджень пов'я-3aHi з вивченням та впровадженям в практику методик прогнозування ефективност лiкаpських за-собiв антиоксидантно! дИ на модeлi клiтин пацieнтiв до застосування in vivo.
Л1тература
1. Бiохiмiчнi методи оцшки оксидативного статусу у хворих на хрошчну хворобу нирок: Методичш рекомендацп / [Король Л. В.,
Мигаль Л. Я., Нкулша Г. Г., Колесник М. О.]. - Кшв, 2013. - 30 с.
2. Дубинина Е. Е. Окислительная модификация белков плазмы крови больных психическими расстройствами (депрессия, де-
персонализация) / Е. Е. Дубинина, М. Г. Морозова, Н. В. Леонова [и др.] // Вопросы медицинской химии. -2000. - № 4. -С. 6-9
3. Куценко Л. А. Место церулоплазмина среди белков острой фазы как маркера системного воспаления /Л. А. Куценко,
И.П. Кайдашев // Лабораторна дiагностика. - 2011. - № 3 (57). - С. 59-68.
4. Меньшикова Е. Б. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания / Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков,
В.З. Ланкин [и др.]. - Новосибирск: АР-ТА, 2008. - 284 с.
5. Ыженковська I. В. Дослщження антиокислювально! активной ^амшу та тридоксину на моделi окисно! модифкацп про-
теев / I. В. Ыженковська, О. В. Афанасенко, Л. Ф. Осшська // Ukr. Biochem. J. - 2014. - Vol. 86, № 5 (Suppl. 1). - P.70-71
6. Пат. № 2243559 RU, МПК (2004) G01N 33/48 (2008.01), А61Р 13/12 (2008.01) Способ определения уровня неспецифической
резистентности организма / Ободников А. А., Коханевич Е. В., Гончарова Я. А.; опуб. 27. 12. 2004. Бюл. №. — 4 с.
7. Intervention strategies to inhibit protein carbonylation by lipoxidation-derived reactive carbonyls / G. Aldini, I. Dalle-Donne,
R.M. Facino, [et al.] // Med Res Rev. - 2007. - Vol. 6 (27). - P. 817-868.
8. Pedzik. A. Oxidative stress in nephrology [Text] / Pedzik A., Paradowski M., Rysz J. // Pol. Merkur Lekarski. - 2010. - Vol. 28 (163). -
P. 56-60.
УДК 577.126:616.61-036.12
АНТИОКИСЛЮВАЛЬШ ВЛАСТИВОСТ1 ТРАНСФЕРИНУ ПРИ МОДЕЛЮВАНН1 IN VITRO ПРОЦЕС1В ОКСИДАЦП ПРОТЕШ1В ТА Л1П1Д1В ПРИ ХРОН1ЧН1Й ХВОРОБ1 НИРОК
Король Л. В.
Резюме. Прогнозування in vitro ефективност лкарського засобу з урахуванням особливостей окси-дантно/антиоксидантного дисбалансу в кровi при патологи е актуальними та прюритетним. Мета робо-ти - доотдження ефективност застосування антиоксидантного препарату (0,4% розчин трансферину) в умовах in vitro модельованого окислення лтщв та проте!ыв на моделi зразюв кровi па^ентв з хроычною хворобою нирок.
Об'ект i методи доотдження. Ытенсивнють спонтанного та металшдукованого окиснення визнача-ли в зразках кровi умовно-здорових донорiв (1-ша гр.) та хворих з бактерiально-запальним процесом (2-га гр.), iмунозапальним процесом в нирках (3-я гр.) та хворих з хроычним запаленням, яю лкувалися гемодiалiзом (4-та гр.).
Результати до^дження та !х обговорення. Аналiз результа^в продемонстрував пщвищення спонтанного утворення КГПс, МДАс та МДАе. Внесення до дослщних зразюв кровi 0,2 мл 0,4% розчину ТР спри-яло частковому зниженню спонтанно! продукци МДАс на 18% у 2-й груп та КГПс на 24% i МДАс на 26% у 4-й групг Застосування ТР при моделюванн in vitro металстимульованого неензимного окиснення спри-яло зменшенню продукцiТ МДАс у 2-й та 4-й групах. Використання розчину ТР в моделях з застосуванням потужншого оксиданта сприяло бтьш виразному антиоксидантному ефекту.
Ключов1 слова: хроычна хвороба нирок, оксидативнi процеси, трансферин.
УДК 577.126: 616.61-036.12
АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ТРАНСФЕРРИНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ IN VITRO ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ ПРОТЕИНОВ И ЛИПИДОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК
Король Л. В.
Резюме. Прогнозирование in vitro эффективности лекарственного средства с учетом особенностей оксидантно/антиоксидантного дисбаланса в крови при патологии актуальны и приоритетны. Цель работы - исследование эффективности применения антиоксидантного препарата (0,4% раствор трансферри-на) в условиях in vitro моделируемого окисления липидов и протеинов на модели образцов крови пациентов с хронической болезнью почек.
Объект и методы исследования. Использовали образцы крови условно-здоровых доноров (1-я гр.) и больных с бактериально-воспалительным процессом (2-я гр.), иммунно-воспалительным процессом в почках (3-я гр.) и больных с хроническим воспалением, которые лечились гемодиализом (4-я гр.). В крови определяли интенсивность спонтанного и металиндуцированного окисления по накоплению малонового диальдегида (МДА) и карбонильных групп протеинов (КГП) при моделировании in vitro.
Результаты исследования и их обсуждение. Анализ результатов продемонстрировал повышение спонтанного образования КГПс и МДАс. Внесение в опытные образцы крови 0,2 мл 0,4% раствора ТР способствовало частичному снижению спонтанной продукции МДАс на 18% во 2-й гр. и КГПс на 24% и МДАс на 26% в 4-й гр. Применение ТР при моделировании in vitro металстимулированного неэнзимного окисления способствовало уменьшению продукции МДАс во 2-й и 4-й группах. Использование раствора ТР в моделях с применением более мощного оксиданта способствовало более выразительному антиоксидантному эффекту.
Ключевые слова: оксидативные процессы, хроническая болезнь почек, трансферрин.
UDC 577.126:616.61-036.12
ANTIOXIDANT PROPERTIES OF TRANSFERRIN IN MODELING IN VITRO OXIDATION OF PROTEINS AND LIPIDS IN CHRONIC KIDNEY DISEASE
Korol L. V.
Abstract. Prediction of in vitro efficacy of the medicinal product allowing for the oxidant-antioxidant (O/A) imbalance in the blood are important in the pathology and priority. Actively developed and put into practice various model systems in which may confirm or predict the clinical efficacy of the future use of drugs or chemical compounds with antioxidant properties for correction O/A imbalance. The development of chronic kidney disease (CKD) is accompanied by increasing concentration of peroxidation products and decreased markers of antioxidant defense, in particular the content of transferrin (TR). Under conditions of prolonged oxidative stress and anemia in conjunction with this protein can decrease the blood. Purpose - to study the efficacy of antioxidant drug (0.4% solution TR) in a simulated in vitro oxidation of lipids and proteins in blood samples models of patients with CKD.
Material and methods. As biological material used blood samples healthy donors (1-st group) and patients with bacterial and inflammatory process in the kidneys (2-nd group), immunoinflammatory process in the kidneys (3-rd group) and patients with chronic inflammation treated with hemodialysis (4-th group). To study included patients with deficiency of transferrin in the blood. The blood was determined the intensity of spontaneous and induced oxidation of the metal by the accumulation of malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl groups (PSG) in simulation in vitro.
Results. Analysis of the results showed increasing spontaneous formation PSG and MDA in serum blood. Adding to test samples of blood TR 0.4% solution helped reduce spontaneous partial MDA production by 18% (p < 0.05) in 2-th group, and 24% PSG (p < 0.05), and MDAs 26% (p < 0.05) in the 4th group. The use of TR when simulating in vitro stimulated oxidation of metal products helped reduce MDA (p < 0.05) in 2nd and 4th groups (patients with bakterialnoinflammatory process and CKD VD). Use a solution of TR models using a powerful oxidant formation PSG helped reduce by 20% (p < 0.05) MDA at 23% (p < 0.05) in the 4th group (patients CKD VD) MDAs and 18% (p < 0.05) in group 2 (at bacterial and inflammatory process in the kidneys). Application of TR in the 3rd group (at immunoinflammatory affected kidneys) were ineffective. This may be caused by low levels of ceruloplasmin in serum of these patients, and as TR binds Fe3+, its formation is insufficient due to low functional activity of ceruloplasmin prevents iron saturated with TR and show antioxidant activity of plasma protein. The levels of ceruloplasmin in serum were within the physiological norm in the 2nd and 4th experimental groups. This helped identify the required activity of the oxidation of iron and potentiated antioxidant effect in vitro in TR modeling oxidation processes. This research method can be used to predict the efficacy of antioxidant preparations with an individual approach to the patient prior to their use in vivo. This will enable them to predict future performance, especially in patients with CKD VD, which required the appointment of the drug to correct anemia and iron deficiency, on the other - the use of protein drugs is limited by this disease.
Conclusion. Using TR during in vitro simulation processes facilitated partial oxidation and reduction of spontaneous induced oxidation of the metal metal-induced products in blood patients with bacterial and inflammatory process in the kidneys and PSC and MDA in patients with CKD VD. Using TR models with the use of more powerful oxidants helped reduce production PSG, for MDA in patients with CKD VD and MDA in patients with chronic renal failure.
Keywords: chronic kidney disease, oxidative stress, transferring.
Рецензент - проф. Дев'яткна Г. О.
Стаття надшшла 30.10.2015 року
