Антимикробная активность нерибосомальных пептидов цианобактерий

Н. В. Немцева; Э. И. Мамедова; Е. К. Немцева

ЭЛЕКТРОННЫЙ ЖУРНАЛ

Оп-1 I пе версия жу рнала на сайте

http://www.elmag.uran.ru

ОРЕНБУРГСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН

Ьуеаепа ШегБатоп (ЕБрег, 1784) Червонец блестящий Шовкун Д.Ф.

»

ОРЕНБУРГСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УрО РАН

Н.В. Немцева1,2, Э.И. Мамедова2, Е.К. Немцева2

АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕРИБОСОМАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

1 Оренбургский федеральный исследовательский центр УрО РАН (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН), Оренбург, Россия

2 Оренбургский государственный медицинский университет, Оренбург, Россия

Проведен анализ данных научной литературы по проблеме поиска альтернативных антибиотикам веществ. Адекватным решением проблемы является применение нерибосо-мальных пептидов, синтезируемых цианобактериями с помощью пептидсинтетаз. Способность цианобактерий синтезировать метаболиты с адресной доставкой обеспечивает успешность таргентной медицины. Нерибосомальные пептиды не вызывают привыкания, что может их сделать конкурентными на рынке антибиотиков.

Ключевые слова: цианобактерии, нерибосомальные пептиды, токсины, пептидосин-тетазы.

N.V. Nemtseva1,2, E.I. Mamedova2, E.K. Nemtseva2

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF NERIBOSOMAL PEPTIDES OF CIANOBACTERIA

1 Orenburg Federal Research Center, UB RAS (Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, UB RAS), Orenburg, Russia

2 Orenburg State Medical University, Orenburg, Russia

The analysis of scientific literature data on the problem of searching for antibiotics alternatives has been carried out. The solution of the problem is the use of non-ribosomal peptides synthesized by cyanobacteria using peptide synthetases. The ability of cyanobacteria to synthesize metabolites with targeted delivery ensures the success of targeted medicine. Non-ribosomal peptides are not addictive, which makes them competitive in the antibiotic market.

Key words: cyanobacteria, non-ribosomal peptides, toxins, peptidosynthetases.

Цианобактерии или синезелёные водоросли - тип крупных грамот-рицательных бактерий, имеющих сложные фотосинтетические системы, способные направлять поглощенную солнечную энергию в другие виды энергии для производства питательных веществ и метаболитов [17]. Цианобактерии наиболее близки к древнейшим микроорганизмам, остатки которых (строматолиты, возраст более 3,5 млрд лет) обнаружены на Земле. По результатам молекулярного анализа, они составляют филогенетически единую и

связанную группу прокариот [22]. По сравнению с другими прокариотами эти микроорганизмы, способные к оксигенному фотосинтезу, имеют наиболее сложную организацию и морфологическую дифференцированность.

Они широко представлены на Земле. Некоторые из них процветают в пресноводных водоемах (реках, озерах и водохранилищах), тогда как другие - в солоноватых и гиперсоленых местообитаниях (рис. 1). Они встречаются в холодных или горячих источниках, а также в средах, где развитие эукариоти-ческих организмов затруднено. Разнообразие цианобактерий также отражается на множестве структурных и функциональных аспектов морфологии их клеток и вариации метаболических стратегий.

Рис. 1. Цианобактерии из минерализованных водоемов Предуралья.

Обозначения: а - Anabaena hassalii (Kütz.) Wittr.; б - Anabaenopsis arnoldii Aptek.; в - Nostoc linskia (Roth) Bornetet et Flahault.

Цианобактерии являются продуцентами различных биоактивных молекул, продукция которых обеспечила этим организмам эволюционные преимущества. Синтезируемые цианобактериями вещества аллелохимической природы, выполняющие функции сигнальных метаболитов, а также влияющие на рост и развитие других организмов, способны оказывать токсическое действие [1]. Помимо токисинов, метболиты цианобактерий богаты другими активными соединениями, обладающими антибактериальным, антиплазмо-диальным и противовирусным действием [18].

Производимые цианосоединения относятся к нескольким химическим классам: пептидам, алкалоидам, терпеноидам, макролидам, поликетидам, жирным кислотам, нуклеозидам и др., и представляют высокую фармацевтическую ценность, что обеспечило этим микроорганизмам новые перспективы применения в области медицины.

Одной из биотехнологически значимых субстанций являются нерибо-сомальные пептиды, то есть биологически активные пептиды, образуемые микроорганизмами без участия рибосом. Их антимикробная активность вызвала заинтересованность ряда специалистов. Антимикробные соединения являются агентом, который, влияя на физиологические процессы микроорганизмов, убивает или подавляет их рост. В связи с ростом доли штаммов патогенов с множественной лекарственной устойчивостью предпринимаются значительные усилия по поиску новых антимикробных соединений, продуцируемых различными организмами.

Нерибосомальные пептиды - небольшие пептидные молекулы, несущие большое количество гидрофобных/ароматических остатков, а также положительно заряженных остатков (общий заряд +1...+11). Известна их противовирусная и цитотоксическая активность [2].

Не все белки синтезируются на рибосомах. Небольшие полипептиды, содержащие менее 50 аминокислот, аналогично жирным кислотам, могут быть собраны путем нерибосомального синтеза за счет работы мультиэнзим-ных комплексов, известных под общим названием пептид-синтетазы. Эти и другие многофункциональные комплексы, такие как поликетидсинтазы, представляют интерес при использовании их в комбинаторном синтезе [14]. Известно, что модульная структура нерибосомальной пептид-синтетазы (НРПС), состоящая из 1000-1500 аминокислотных остатков и действующая как независимый фермент, обеспечивает последовательное и специфичное для аминокислот удлинение пептидных цепей [12]. В обобщенном виде НРПС представляет собой линейную конструкцию, состоящую из отдельных модулей, соединенных между собой короткими пептидами (пептиды коммуникационного взаимодействия). Каждый модуль отвечает за включение в синтезируемый продукт одной аминокислоты в той последовательности, в какой они запрограммированы в линейной конструкции, подчиняясь на генном уровне правилу колинеарности (рис. 2, 3). Достаточно подробно этот процесс обсуждался в ряде работ [2, 4, 21]. Конкретная комбинация модулей и различных функциональных областей определяет структуру, а также активность пептидного продукта.

Установлено, что основной мишенью действия антимикробных пептидов является клеточная мембрана. Специфичность действия определяется ее липидным составом [9]. Антимикробные пептиды в присутствии липидной

мембраны образуют амфифильную структуру, в которой заряженные (полярные) и гидрофобные группы пространственно разделены.

Инициация Элонгация Термин ания

Рис. 2. Модули, участвующие в биосинтезе нерибосомальных пептидов [4].

etc.

А

модули

В

домены

Рис. 3. Общая схема синтеза нерибосомных пептидов.

Пептид-синтетазы представляют собой набор модулей, каждый из которых включает в пептид одну аминокислоту. Аминокислоты субстрата активируются и связываются с кофактором P-pant каждого модуля, откуда происходит удлинение. Модули могут подразделяться на домены. Модуль инициации состоит из аденилирующего (черный круг) и тиолирующего (полосатый) доменов. Элонгирующий модуль построен из Nтерминальной конденсации (белого цвета), аденилирующего и тиолирующего доменов. Дополнительные домены для модификации субстрата, такие как эпимеризация (серая), являются необязательными (как показано для инициирующего модуля) [22].

Некоторые пептиды атакуют специфические мембранные или внутриклеточные мишени, что приводит к образованию пор и вздутий в мембране микробных клеток. В результате внутрь атакуемой клетки проникает большее количество пептидов, приводя к разрушению ее целостности (механизм self-promoting uptake). Отсутствие привыкания у микроорганизмов к данным соединениям создает преимущество при их использовании в антимикробной терапии [11].

Известно, что некоторые цианобактерии продуцируют внутриклеточные и внеклеточные биоактивные соединения с мощной антибактериальной и противогрибковой активностью [14]. Описана активность этих цианобакте-риальных соединений против Micrococcus flavus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Mycobacterium smegmatis, Streptococcus pyogenes и некоторых других грамположительных и грамотри-цательных бактерий [15]. Продемонстрирована противогрибковая активность цианобактериальных соединений против различных патогенных штаммов грибов [16].

Антибактериальная активность обнаружена у вторичных метаболитов цианобактерий Oscillatoria sp., Nostoc commune, Lyngbya sp. [20].

С появлением угрозы туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ) возникла необходимость разработки новых препаратов. Среди ан-тимикобактериальных агентов, исследованных в последние несколько десятилетий, выявлено, что противотуберкулезные пептиды обладают множеством преимуществ, таких как низкая иммуногенность, избирательное сродство к бактериальным отрицательно заряженным клеточным оболочкам и расходящимся механизмом действия [10].

Большой интерес к нерибосомальным пептидам связан с открытием новых лекарственных мишеней для антипротозойных агентов. Нерибосо-мальные пептиды могут представлять альтернативные пути в борьбе с лекарственно устойчивыми штаммами патогенных простейших [13]. Из цианобак-терий Symploca выделен линейный пептид симплостатин 4, также называемый галлинамидом А. [6]. Показано, что симплостатин 4 вызывает остановку клеточного цикла на стадии G2. Это связано с эффектом разрушения микротрубочек. Данное вещество продемонстрировало мощную активность в отношение устойчивых к лекарственным средствам штаммов Plasmodium falci-

parum [5]. Следует отметить, что сиплостатин 4 не вызывал лизиса эритроцитов даже при высокой микромолярной концентрации. После обработки P. falciparum симплостатином 4 паразиты на кольцевой стадии, окрашенные по Гимзе, демонстрировали накопление непереваренного гемоглобина, что исследователями предположительно объясняется ингибированием протеаз [19].

Имеются сведения о выделении из культур цианобактерии Nostoc ellipsosporum нового вирулицидного белка длиной 11 аминокислот (11 кДа), названного циановирин-N (CV-N). Установлено, что низкие наномолярные концентрации природного CV-N необратимо инактивируют разнообразные лабораторные штаммы и первичные изоляты вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1, штаммы ВИЧ типа 2, а также вируса иммунодефицита обезьян. Показано, что CV-N прерывает слияние клеток и передачу инфекции ВИЧ-1 [3]. В клетках культуры ткани CV-N нетоксичен в концентрациях, намного превышающих концентрации, необходимые для активности против ВИЧ. Предполагают, что противовирусная активность CV-N обусловлена, по крайней мере, частично, уникальными высокоаффинными взаимодействиями CV-N с гликопротеином gp120 оболочки вирусной поверхности. Биологическая активность CV-N обладает высокой устойчивостью к физико-химической денатурации, что еще больше повышает его потенциал в качестве микробицида против ВИЧ [7].

К сожалению, некоторые антимикробные соединения, выделенные из цианобактерий, обладают цитотоксичностью. Цианобактерии синтезируют микроцистины и нодулярины, гепато- и цитотоксины (цилиндроспермопси-ны), нейротоксины (анатоксин_a, анатоксин А (S), и сакситоксины) и др. Однако, в последнее время внимание исследователей привлекает способность цианотоксинов адресно связываться с клетками-мишенями тканей человека, что может быть использовано при разработке препаратов для таргентной медицины.

Таким образом, на основании анализа научных источников можно заключить, что решение проблемы антибактериальной устойчивости патогенов может быть решено путем применения нерибосомальных пептидов, синтезируемых цианобактериями. Достоинством нерибосомальных пептидов является отсутствие у микроорганизмов привыкания к ним, что повышает их конкурентоспособность на рынке антибиотиков.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кокшарова О.А. Применение методов молекулярной генетики и микробиологии в экологии и биотехнологии цианобактерий. Микробиология, 2010. 79(6): 734-747.

2. Орлова Т. И., Булгакова В.Г., Полин А. Н. Биологически активные нерибосомальные пептиды.III. Механизм биосинтеза нерибосомальных пептидов. Антибиотики и химиотерапия. 2012. 57(7-8): 7-8.

3. Boyd MR., Gustafson K.R., McMahon J B., Shoemaker RH., O'Keefe B.R., Mori T., Gulakowski R.J., Wu L., Rivera M.I., Laurencot C.M., Currens M.J., Cardellina J.H. Buckheit R.W., Nara P.L., Pannell L.K., Sowder R.C., Henderson L.E. Discovery of cya-novirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. An-timicrob Agents Chemother. 1997. 41(7): 1521-30.

4. Challis G. L., Naismith J. H. Structural aspects of non-ribosomal peptide biosynthesis. Curr Opin Struct Biol. 2004. 14(6): 748-756. doi:10.1016/j.sbi.2004.10.005.

5. Conroy T., Guo J.T., Hunt N.H., Payne R.J. Total Synthesis and Antimalarial Activity of Symplostatin 4. Org. Lett. 2010. 12: 5576-5579.

6. Conroy T., Guo J.T., Linington R.G., Hunt N.H, Payne R.J. Total synthesis, stereochemical assignment, and antimalarial activity of gallinamide. Chem. Eur. J. 2011. 17(48): 1354413552.

7. Dey B., Lerner D. L., Lusso P., Boyd M. R., Elder J. H., Berger E. A. Multiple Antiviral Activities of Cyanovirin-N: Blocking of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Interaction with CD4 and Coreceptor and Inhibition of Diverse Enveloped Viruses. J. of Virology, 2000. 74(10): 4562-4569.

8. Dittmann E., B.A. Neilan B.A., Borner T. Molecular biology of peptide and polyketide biosynthesis in cyanobacteria. Applied Microbiology Biotechnology. 2001. 57(4): 467-473.

9. Kehr J-C, Picchi D.G., Dittmann E. Natural product biosyntheses in cyanobacteria: A treasure trove of unique enzymes. Beilstein J. Org. Chem. 2011. (7): 1622-1635.

10. Khusro A., Aarti C., Agastian P. Anti-tubercular peptides: A quest of future therapeutic weapon to combat tuberculosis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2016. 9(11): 1023-1034.

11. Lee Y., Phat C., Hong S-C. Structural diversity of marine cyclic peptides and their molecular mechanisms for anticancer, antibacterial, antifungal, and other clinical applications. Pep-tides. 2017. 95: 94-105.

12. Marahiel M. A., Stachelhaus T., Mootz H. D. Modular peptide synthetases involved in non-ribosomal peptide synthesi. Mol. Gen. Genet., 1997. 97: 2651-2673.

13. Müller J, Hemphill A. New approaches for the identification of drug targets in protozoan parasites. Int. Rev. Cell Mol. Biol., 2013. 301: 359-401.

14. Neilan B. A., Dittmann E., Rouhiainen L., Bass R. A., Schaub V., Sivonen K., Börner T. Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of cyanobacteria. J. of bacteriology, 1999. (7): 4089-4097.

15. Ostensvik O., Skulberg O.M., Underdal B., Homazabal V. Antibacterial properties of extracts from selected planktonic freshwater cyanobacteria--a comparative study of bacterial bioassays. J Appl Microbiol. 1998. 84(6): 1117-24.

16. Pfaller M.A., Diekema D.J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 2007. (29): 133-163. doi: 10.1128/CMR.00029-06.

17. Pisciotta J.M., Zou Y., Baskakov I.V. Light-dependent electrogenic activity of cyanobacteria. PLoS ONE. 2010. 5: 10821. doi: 10.1371/journal.pone.0010821.

18. Singh R., Parihar P., Singh M., Bajguz A., Kumar J., Singh S., Singh V. P., Prasad S. M. Uncovering Potential Applications of Cyanobacteria and Algal Metabolites in Biology, Agriculture and Medicine: Current Status and Future Prospects. Front Microbiol. 2017. (8): 515. doi: 10.3389/fmicb.2017.00515.

19. Stolze S.C., Deu E., Kaschani F., Li N., Florea B.I., Richau K.H., Colby T., van der Hoorn

R.A., Overkleeft H.S., Bogyo M., Kaiser M. The antimalarial natural product symplostatin 4 is a nanomolar inhibitor of the food vacuole falcipains. Chem. Biol., 2012. 19: 1546-1555.

20. Swain S.S., Paidesetty, S.K., Padhy, R.N. Antibacterial, antifungal and antimycobacterial compounds from cyanobacteria. Biomed. Pharmacother. 2017. 90: 760-776.

21. Stachelhaus T., Mootz H. D., Bergendahl V., Marahiel M. A. Peptide bond formation in nonribosomal peptide biosynthesis .Catalytic role of the condensation domain. J. of Biological Chemistry, 1998. 273(35): 22773-22781.

22. Turner S. Molecular systematics of oxygenic photosynthetic bacteria. Plant Syst. Evol. 1998. 11: 13-52.

23. Vijayakumar S., Menakha M. Pharmaceutical applications of cyanobacteria. A review. Journal of Acute Medicine. 2015. 5(1): 15-23.

Поступила 10 сентября 2019 г.

(Контактная информация:

Немцева Наталия Вячеславовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией водной микробиологии Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11; профессор кафедры биологии ФГБОУ ВО "Оренбургский государственный медицинский университет" Минздрава России; тел. 8-903-398-78-11; е-mail: nvnemtseva@gmail.com;

Мамедова Эльмира Имановна - студентка 5 курса лечебного факультета, ФГБОУ ВО "Оренбургский государственный медицинский университет" Минздрава России; адрес: Россия, 460000, Россия, г. Оренбург, ул. Советская, 6; моб. тел. 8-905-882-8983; е-mail: elmira83mamedova@gmail.com;

Немцева Екатерина Константиновна - студентка 5 курса лечебного факультета, ФГБОУ ВО "Оренбургский государственный медицинский университет" Минздрава России; адрес: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6; моб. тел. 8-903-392-78-56; е-mail: k8nemtseva@ gmail. com)

LITERATURA

1. Koksharova O.A. Application of molecular genetics and microbiology methods in ecology and biotechnology of cyanobacteria. Microbiology. 2010. 79 (6): 734-747.

2. Orlova T. I., Bulgakova V. G., Polin A. N. Biologically active non-ribosomal peptides. III. The mechanism of biosynthesis of non-ribosomal peptides // Antibiotics and chemotherapy, 2012.57 (7-8): 7-8.

3. Boyd MR., Gustafson K.R., McMahon J.B., Shoemaker R.H., O'Keefe B.R., Mori T., Gulakowski R.J., Wu L., Rivera M.I., Laurencot C.M., Currens M.J., Cardellina J.H., Buckheit R.W., Nara P.L., Pannell L.K., Sowder R.C., Henderson L.E. Discovery of cya-novirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. An-timicrob Agents Chemother. 1997. 41(7): 1521-30.

4. Challis G. L., Naismith J. H. Structural aspects of non-ribosomal peptide biosynthesis. Curr Opin Struct Biol. 2004. 14(6): 748-756. doi:10.1016/j.sbi.2004.10.005.

5. Conroy T., Guo J.T., Hunt N.H., Payne R.J. Total Synthesis and Antimalarial Activity of Symplostatin 4. Org. Lett. 2010. 12: 5576-5579.

6. Conroy T., Guo J.T., Linington R.G., Hunt N.H, Payne R.J. Total synthesis, stereochemical assignment, and antimalarial activity of gallinamide. Chem. Eur. J. 2011. 17(48): 1354413552.

7. Dey B., Lerner D. L., Lusso P., Boyd M. R., Elder J. H., Berger E. A. Multiple Antiviral Activities of Cyanovirin-N: Blocking of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Interaction with CD4 and Coreceptor and Inhibition of Diverse Enveloped Viruses. J. of Virology, 2000. 74(10): 4562-4569.

8. Dittmann E., B.A. Neilan B.A., Borner T. Molecular biology of peptide and polyketide biosynthesis in cyanobacteria. Applied Microbiology Biotechnology. 2001. 57(4): 467-473.

9. Kehr J-C, Picchi D.G., Dittmann E. Natural product biosyntheses in cyanobacteria: A treasure trove of unique enzymes Beilstein J. Org. Chem. 2011. (7): 1622-1635.