CC BY
46
e
Антимикробная активность бактериоцина 8760, продуцируемого штаммом ЕМвгоеоеет/аветт LWP760
Э. А. СВЕТОЧ, Б. В. ЕРУСЛАНОВ, В. П. ЛЕВЧУК, Е. В. МИЦЕВИЧ, И. П. МИЦЕВИЧ, Ю. Н. КОВАЛЕВ,
Н. К. ФУРСОВА, М. Г. ТЕЙМУРАЗОВ, Ю. Г. СТЕПАНШИН, Л. И. ВОЛОДИНА, И. А. ДЯТЛОВ
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск
Antimicrobial Activity of Bacteriocin S760 Produced by Enterococcus faecium Strain LWP760
E. А. SVETOCH, В. V ERUSLANOV, V. P. LEVCHUK, Е. V. MITSEVICH, I. P. MITSEVICH, YU. N. KOVALEV, N. ^ FURSOVA, М. G. TEIMURAZOV, YU. G. STEPANSHIN, L. I. VOLODINA, I. А. DYATLOV
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Rospotrebnadzor, Obolensk
Изучена антимикробная активность бактериоцина энтероцина S760 — катионного, гидрофобного, термоустойчивого пептида с молекулярной массой 5,5 кДа и pI=9,8, продуцируемого штаммом Enterococcus faecium LWP760. Показано, что эн-тероцин S760 подавляет in vitro рост грамположигельных и грамотрицательных бактерий 25 видов как чувствительных, так и устойчивых к антибиотикам. МПК энтероцина S760 для Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes и Clostridium per-fringens — основных возбудителей пищевых инфекций — колебалась в пределах 0,05—1,6 мг/л; для Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae и Corynebacterium diphtheriae — в пределах 0,4—1,6 мг/л. Энтероцин S760 был активен против антибиотикоустойчивых штаммов Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii (МПК 0,05—3 мг/л), Klebsiella pneumoniae (МПК 6 мг/л), Pseudomonas aeruginosa (МПК 0,4—25 мг/л), а также против грибов Candida albicans, Candida krusei и Aspergillus niger (МПК 0,1—0,2 мг/л). Энтероцин S760 рассматривается как новое перспективное антимикробное средство для использования в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.
Ключевые слова: бактериоцин, антимикробная активность, альтернатива антибиотикам.
Antimicrobial activity of bacteriocin S760 (enterocin) produced by Enterococcus faecium strain LWP760 was studied. Bacteriocin S760 is a cationic, hydrophobic, and heat stable peptide with the molecular weight of 5.5 kDa and pI of 9.8. Enterocin S760 is shown to inhibit in vitro the growth both of sensitive and resistant to antibacterials gramnegative and grampositive bacteria of 25 species. MICs of the bacteriocin S760 vary between 0.05—1.6 mg/l for Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens, that are main food-borne pathogens, and from 0.4-1.6 mg/l for Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae and Corynebacterium diphteriae. It is also active against antibioticresistant strains of Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii (with MICs of 0.05—3 mg/l), Klebsiella pneumoniae (with MICs of 6 mg/l), Pseudomonas aeruginosa (with MICs of 0.4—25 mg/l), as well against fungi belonging to species of Candida albicans, Candida krusei and Aspergillus niger (with MICs of 0.1—0.2 mg/l). Enterocin S760 is a novel antimicrobial agents useful in medicine, veterinary and food industry.
Key words: bacteriocin, antimicrobial activity, alternative for antibiotics.
Лечение инфекционных заболеваний человека, вызванных антибиотикоустойчивыми бактериальными патогенами, всё в большей степени становится проблемным для клинической медицины. Особенно это относится к возбудителям нозокомиальных инфекций, таким как Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Clostridium difficile и др. Учитывая данные о скорости и гео-
© Коллектив авторов, 2011
Адрес для корреспонденции: 142279 Московская обл. Серпухов-ский р-он, г. Оболенск, ГНЦ ПМБ.
графии распространения антибиотикоустойчивых популяций патогенов среди населения [1, 2], трудно себе представить, что в ближайшие годы нарастание лекарственной устойчивости среди бактерий удастся преодолеть. Здесь же уместно заметить, что с каждым годом число появляющихся на рынке новых антибиотиков снижается, а крупные фармацевтические компании всё меньше вкладывают финансовых средств на разработку таких препаратов [3]. В сложившейся ситуации научное сообщество активно осуществляет поиск альтернативных антибиотикам антимикробных средств, способных обеспечить эффективную борьбу с лекарственно-устойчивыми патогенами.
В поисках решения этой задачи возрос интерес к использованию в терапии инфекционных болезней бактериофагов и их литических ферментов — эндолизинов; к разработке эффективных пробиотических препаратов на основе безопасных для человека бактерий-антагонистов; к изучению нового класса антимикробных пептидов, продуцируемых эукариотическими клетками, а также к исследованиям большого числа антимикробных субстанций бактериального происхождения. Среди последних особое место занимают бактериоци-ны — рибосомально синтезируемые клеткой низкомолекулярные (<10,0 кДа), термоустойчивые, чаще всего катионной природы гидрофобные пептиды [4, 5]. Внимание исследователей к данной группе макромолекул во многом объясняется их свойствами. По спектру и уровню антимикробной активности бактериоцины не уступают современным антибиотикам и даже превосходят их: они могут быть губительными как для одного или нескольких близкородственных видов микроорганизмов, так одновременно и для разных грампо-ложительных и грамотрицательных видов бактерий, а также грибов, вирусов, простейших и опухолевых клеток [6—11]; их минимальные подавляющие концентрации (МПК) для бактериальных патогенов измеряются в наномолярных концентрациях [12]. Бактериоцины, как показывают исследования последних лет, активны не только против чувствительных к антибиотикам микроорганизмов, но и против их антибиотикоустойчивых вариантов [13, 14]. В силу особенностей механизма антимикробного действия бакте-риоцинов (преимущественно это образование пор во внутренней мембране клетки) развитие устойчивости к ним у бактерий, по мнению исследователей [15], будет происходить, по всей вероятности, медленнее, чем это отмечается в отношении большинства функциональных классов антибиотиков, за исключением пептидных (полимикси-ны). У последних молекулярный механизм губительного действия на клетки близок к таковому у бактериоцинов, и резистентность к полимикси-нам у бактерий развивается существенно медленнее [16]. О сравнительно медленном развитии устойчивости к бактериоцинам у бактерий свидетельствует практика 50-летнего использования первого бактериоцина — низина в качестве консерванта и антимикробного средства в пищевой промышленности многих стран мира: до сих пор из консервированных продуктов не удалось выделить устойчивых к низину патогенов — лис-терий, клостридий или микроорганизмов, вызывающих порчу продуктов питания [17]. Касаясь вопроса безопасности бактериоцинов для человека, важно отметить, что антимикробные пептиды, в частности молочнокислых бактерий (наиболее изученной на сегодняшний день группы проду-
центов бактериоцинов), скорее всего, аналогично низину, не будут вызывать у пациентов нежелательных реакций, нередко отмечаемых при использовании антибиотиков, поскольку сами бактерии-продуценты бактериоцинов и продукты их жизнедеятельности употребляются человеком на протяжении всей жизни с молочной, мясной и растительной пищей. Более того, показано, что бактериоцины способны индуцировать иммунные реакции макроорганизма, повышающие неспецифическую устойчивость его к бактериальным и вирусным агентам [18]. Анализ свойств обнаруженных и описанных к настоящему времени бактериоцинов молочнокислых бактерий показывает, что большинство из них проявляет активность в отношении грамположительных патогенов. Крайне мало известно бактериоцинов, которые активны против широкого круга грамотрицательных бактерий, включая возбудителей нозокомиальных инфекций.
Цель настоящей работы — оценить антимикробную активность бактериоцина (энтероци-на) S760, продуцируемого штаммом E.faecium LWP760, против широкого круга чувствительных и устойчивых к антибиотикам штаммов различных видов бактериальных патогенов человека и животных, а также грибов Candida spp. и Aspergillus niger. Подробное описание свойств эн-тероцина S760 представлено в нашей работе [19]. Энтероцин S760 является катионным гидрофобным пептидом с молекулярной массой 5,5 кДа и изоэлектрической точкой (pi), равной 9,8; он термоустойчив, не инактивируется при кипячении и автоклавировании при температуре 121°С в течение 20 мин, но частично теряет активность под действием протеиназы К, трипсина и химо-трипсина; активен против листерий, т. е. по своим свойствам близок к бактериоцинам 2-го класса по классификации T. R. Klaenhammer [20]. Энтероцин S760 безопасен для белых мышей и цыплят, высокоэффективен при лечении кампилобактериозной и сальмонеллёзной инфекций у бройлерной птицы [21].
Maтepиaл и методы
Штаммы микроорганизмов и культивирование. В опытах по определению чувствительности культур микроорганизмов к антибиотикам и к энтероцину S760 использовали лабораторные, а также выделенные от человека и сельскохозяйственных животных штаммы бактерий и грибов следующих видов: Escherichia coli (n=11), в том числе E.coli O157:H7 (n=7); Salmonella enterica (n=14), в том числе S.typhimurium (n=2), S.enteritidis (n=5), S.gallinarum (n=1), S.typhi (n=5) и S.abony (n=1); Klebsiella pneumoniae (n=9); Enterobacter cloacae (n=9); Yersinia enterocolitica (n=5); Yersinia pseudotuberculosis (n=5); Pseudomonas aeruginosa (n=9); Enterococcus faecalis (n=1); Corynebacterium diphtheriae (n=8); Clostridium perfringens (n=14); Clostridium difficile (n=4); Mycobacterium smegmatis (n=1); Acinetobacter spp. (n=6); Staphylococcus spp. (n=17); Streptococcus spp. (n=2); Listeria spp. (n=10); Candida spp. (n=18) и Aspergillus niger (n=2). Перечисленные штаммы бактерий, а также штамм
e
E.faecium LWP760, продуцент бактериоцина S760, находятся на хранении в отделе коллекционных культур ФГУН ГНЦ ПМБ в лиофильно высушенном виде.
Энтеробактерии, псевдомонады, ацинетобактеры, стафилококки, энтерококки, микобактерии и грибы кандида культивировали на питательном агаре ГРМ (ГНЦ ПМБ, Обо-ленск), листерии — на агаре ГРМ с глюкозой (2%), возбудитель дифтерии — на коринебакагаре (ГНЦ ПМБ, Оболенск). Стрептококки, кампилобактерии, клостридии и аспергиллы — на средах Streptococcus Selection Agar (HiMedia, Индия), Campylobacter Agar Base (HiMedia, Индия) с 5% лизирован-ной крови, бисульфитом натрия (0,2 г/л) и сульфатом железа (0,25 г/л), Perfringens Agar Base (O.P.S.P.) (HiMedia, Индия), Clostridium Difficile Agar Base (HiMedia, Индия) с 5% дефиб-ринированной крови лошади и среде Сабуро (ГНЦ ПМБ, Оболенск) соответственно. Все культуры выращивали при оптимальных для данных микроорганизмов условиях. Для Campylobacter и Clostridium создавали соответственно микроа-эрофильные и анаэробные условия с помощью анаэростатов Gas Pak 150 (BD BBL™, США), газогенерирующих пакетов CampyGen™ (Oxoid, Англия), Gas Pak™EZ (BD BBL™, США) и катализатора Gas Pak™ Catalist (BD BBL™, США).
Определение чувствительности к антибиотикам и бактерио-цину. В работе использовали субстанции антибиотиков: азтре-онам, амикацин, ампициллин, гентамицин, цефотаксим, це-фокситин, цефтазидим, цефуроксим, оксациллин, пенициллин, ванкомицин, клавуланат натрия (Sigma, США), ципрофлоксацин (ICN, США), а также препараты антибиотиков: доксициклин (Ферейн, Россия), цефепим (Бристол-Майерс Сквибб, Италия), меропенем (АстраЗенека, Великобритания), хлорамфеникол (ОАО «Синтез», Россия), эритромицин (ОАО «Синтез», Россия), клиндамицин (Пфайзер, МФГ, Бельгия), рифампицин (ОАО Фармасинтез, Рос-
сия). МПК антибиотиков и бактериоцина S760 для всех использованных штаммов микроорганизмов (за исключением C.dfficile) определяли на среде Mueller Hinton Broth (HiMedia, Индия) методом микроразведений субстанций в 96-луночных планшетах в объёме 0,5 мл в соответствии с МУК 4.2.1890-04 [22] и рекомендациям Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [23]. МПК антибактериальных средств для C.dfficile определяли на среде Mueller Hinton Broth (HiMedia, Индия), обогащенной 5% перинатальной бычьей сыворотки (Life Technologies, Шотландия). МПК бактериоцина S760 для A.niger определяли спот-методом: ряд двукратных разведений бактериоцина по 10 мкл наносили на свежезасеянную грибом плотную питательную среду. Учёт результатов проводили через 3—4 сут инкубирования при температуре 37°С.
Препарат бактериоцина S760 (200 мг/л) получали из фильтрата культуральной жидкости штамма E.faecium LWP760, выращенного на среде Brucella Broth (HiMedia, Индия), как описано в предыдущей работе [19]. Концентрацию пептида в образце определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (AKTAdesighn, GE Healthcare).
Результаты исследований
Определение МПК энтероцина S760 для лабораторных и клинических штаммов патогенных бактерий различных видов показало, что данный бактериоцин подавляет рост как чувствительных, так и устойчивых к антибиотикам бактерий. На рисунке (а и б) представлены величины МПК энтероцина в отношении чувствительных к антибиотикам (кроме S.typhiи S.abony) бактерий. Для лабораторных культур E.coli (n=4) и клинических
О
МПК бактериоцина S760 для грамотрицательных бактерий (а); грамположительных бактерий (б) и грибов (в). Звездочкой обозначены штаммы, устойчивые к антибиотикам, остальные штаммы к антибиотикам чувствительны.
О
e
Таблица 1. МПК бактериоцина S760 для резистентных к антибиотикам штаммов S.aureus
Штаммы МПК антибиотиков, мг/л МПК бактериоцина S760, мг/л
OXA PEN GEN CIP DOC ERI CLI VAN CM RIP
S.aureus 46 128 64 >256 8,0 32 >256 >256 2,0 256 >256 3,1
S.aureus 52 16 64 128 8,0 4,0 >256 >256 1,0 256 <0,25 0,8
S.aureus 68 32 64 128 >256 4,0 1,0 64 1,0 256 <0,25 0,8
S.aureus 175 64 32 0,5 16 0,5 >256 0,5 1,0 32 <0,25 0,8
S.aureus 218 16 64 128 >256 <0,25 >256 >256 1,0 >256 <0,25 0,8
S.aureus 237 8,0 32 256 <0,25 0,5 1,0 0,5 1,0 256 <0,25 0,4
S.aureus 261 32 128 128 8,0 0,5 >256 >256 1,0 256 <0,25 0,8
S.aureus SA310 128 <0,25 128 8,0 16 1,0 >256 2,0 32 <0,25 0,4
S.aureus 403TE 64 64 128 16 16 >256 >256 1,0 >256 <0,25 <0,05
Примечание. ОХА - оксациллин, PEN - пенициллин G, GEN - гентамицин, CIP - ципрофлоксацин, DOC - докси-циклин, ERI - эритромицин, CLI - клиндамицин, VAN - ванкомицин, CM - хлорамфеникол, RIP - рифампицин.
изолятов геморрагического колита Е.еоН 0157:Н7 (п=6), выделенных во время вспышки в Туле в 1996—1997 гг., МПК составили 0,05—1,6 мг/л; для штаммов Б^рктипит (п=2), выделенных от человека, а также для штаммов Б.еШепН^з (п=5) и Б^аШпатт (п=1), выделенных от бройлеров на птицефабриках РФ, — 0,1—0,8 мг/л; для резистентных к антибиотикам штаммов БуЫ (п=5) и Б.аЬопу (п=1), выделенных от больных брюшным тифом и внутрибольничным сальмонеллёзом, — 0,1—1,6 мг/л. Высокую антибактериальную активность (МПК 0,05—0,1 мг/л) бактериоцин 8760 продемонстрировал против штаммов У.еШетсоШ-ка (п=5) и Т.р5гийоШЬггси1о515 (п=5), выделенных в 2007 г. в Красноярске от больных детей и из объектов внешней среды (овощехранилищ). Типовые культуры кампилобактерий С.]е]ит (п=1), С.1агу (п=1) и С.соН (п=1), а также выделенные от бройлеров птицефабрик Центрального региона РФ штаммы С.]е]ит (п=5) имели МПК энтероци-на 0,2—1,6 мг/л. Бактериоцин 8760 активно подавлял с МПК, равными 0,2—1,6 мг/л, рост типовых штаммов Е.топосу^епез (п=7), Ьлмапоми (п=2), Ь.шпосиа (п=1) и С.ре/пщет (п=7), а также культур С.ре/п^ет (п=7), изолированных от больной некротическим энтеритом бройлерной птицы. Чувствительными к бактериоцину 8760 (МПК 0,39—1,56 мг/л) оказались типовые и клинические штаммы Б.аигет (п=5), Б.ер1йетт1й18 (п=3), Б.руо^^епе5 (п=1), Б.рпеитотае (п=1), Е./ае-саИз (п=1); с МПК 0,05—0,2 мг/л — СМрМНепае (п=8), а также, с МПК 0,78 мг/л, — непатогенный для человека штамм микобактерий M.smegmаtis. Среди всех чувствительных к антибиотикам патогенов, устойчивыми к бактериоцину 8760 (МПК>50 мг/л) оказались штаммы возбудителя нозокомиальной диареи человека СМ/гсИе (п=4) (рисунок).
Анализ чувствительности к энтероцину 8760 резистентных к антибиотикам возбудителей нозокомиальных инфекций, выделенных в клиниках Москвы и других крупных городов России в период 2003—2007 гг., показал, что независимо от спектра устойчивости отдельных штаммов
Б.ажеш (п=9), все они были чувствительны к бактериоцину 8760 (МПК от <0,05 до 3,2 мг/л) (табл. 1), также как чувствительные к антибиотикам культуры Б.ажеш (рисунок).
Культуры энтеробактерий Е.с1оасае и К.рпеитотае, имеющие различные уровни и спектры устойчивости к антибиотикам (табл. 2), были чувствительны к энтероцину 8760 (МПК 0,2—3,2 мг/л) для Е.с1оасае и МПК 6,25 мг/л для К.рпеитотае. Обращает на себя внимание факт более высокой устойчивости к бактериоцину 8760 клинических штаммов К.рпеитотае (МПК 6,25 мг/л), по сравнению с типовой, чувствительной к антибиотикам, культурой К.рпеитотае МСТС9639 (МПК 0,2 мг/л), а также клинических штаммов Е.с1оасае (МПК 6,25 мг/л) по сравнению с типовыми штаммами Е.с1оасае (МПК 0,2—3,0 мг/л).
Культуры грамотрицательных неферментирующих бактерий P.aeruginosa и Лсте^Ьа^ег 8рр., изученные в работе, имели широкий спектр и высокий уровень резистентности к антибиотикам (табл. 3). Важно заметить, что шесть из девяти штаммов P.aeruginosa и три штамма из шести штаммов ЛсшекЬа^ег 8рр. были устойчивы к ме-ропенему (МПК 32—256 мг/л). Независимо от спектра лекарственной устойчивости штаммов Р.аегщшоза и Лсше^Ьа^ег 8рр., все они были чувствительны к бактериоцину 8760. МПК бактериоцина для ацинетобактерий составляли 0,8—3 мг/л; для большинства культур P.aerugi-поза этот показатель составил 6—25 мг/л, в то время как МПК энтероцина для типового штамма Р.аегщшоза МСТС12903 была равна 0,4 мг/л (рисунок). Весьма примечательно, что бактериоцин 8760 был активен против резистентных к меропенему и азтреонаму штаммов P.aeruginosa и ЛcinetoЬacter 8рр. (МПК 0,8—12 мг/л).
Результаты определения чувствительности культур С.аШсат (п=15) и C.krusei (п=3), выделенных от больных в отделениях интенсивной терапии Челябинска и Москвы в 2008—2009 гг., показали, что энтероцин 8760 проявляет высокую активность (МПК 0,1—0,2 мг/л) против данных патогенов. Энтероцин 8760 также проявлял антиАНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2011, 56; 1-2
Є
Таблица 2. МПК бактериоцина Б760 для резистентных к антибиотикам штаммов К.рпвитоп1ав и Е.с1оасае
Штаммы ______________________МПК антибиотиков, мг/л____________________МПК бактериоцина
AMP AMS DOC CEF FOX CTX CAZ CAK CEP AZT MERGEN AMI CIP CM S760, мг/л
K.pneumoniae 16 >256 128 32 >256 32 >256 128 0,25 >256 128 <0,12 >256 32 >256 >256 6,2
K.pneumoniae 35 (33) >256 64 4 >256 4 128 128 0,5 16 32 <0,12 0,12 2 <0,12, 1 6,2
K.pneumoniae 37 (45) >256 32 2 >256 4 >256 128 0,25 64 64 <0,12 0,25 1 32 128 6,2
K.pneumoniae 114 >256 64 128 >256 8 >256 128 0,25 >256 >256 <0,12 64 16 0,25 8 6,2
K.pneumoniae 226 >256 64 256 >256 16 256 256 1,0 >256 >256 <0,12 64 128 >256 >256 6,2
K.pneumoniae 3G8 >256 64 64 >256 32 >256 256 2 >256 256 <0,12 64 16 256 8 6,2
K.pneumoniae 336 >256 64 64 >256 8 >256 128 <0,12 128 128 <0,12 128 8 2 >256 6,2
K.pneumoniae 533 >256 32 2 >256 8 128 32 <0,12 32 128 <0,12 16 2 128 >256 6,2
E.cloacae 124 >256 128 128 >256 >256 >256 128 8 >256 256 <0,12 >256 1 64 16 3,1
E.cloacae 134 >256 >256 128 >256 >256 32 256 16 16 256 0,25 256 0,5 4 >256 1,6
E.cloacae 165 >256 64 16 >256 128 >256 132 0,5 >256 128 <0,12 64 2 64 64 3,1
E.cloacae 190 >256 32 256 128 128 16 256 0,5 2 64 <0,12 >256 32 >256 8 0,8
E.cloacae 221 >256 128 32 >256 >256 >256 >256 4 >256 64 <0,12 >256 2 8 32 1,6
E.cloacae 279 >256 32 16 >256 128 >256 32 0,5 >256 128 <0,12 32 1 64 4 3,1
E.cloacae 281 >256 >256 128 >256 32 >256 256 8 >256 >256 <0,12 >256 >256 >256 16 1,6
E.cloacae 3G9 >256 256 16 >256 >256 >256 256 256 4 32 <0,12 0,5 1 <0,12 8 0,2
E.cloacae 317 >256 >256 64 >256 128 >256 128 16 32 >256 <0,12 >256 >256 256 256 3,1
Примечание. Здесь и в табл. 3: AMP - ампициллин; AMS - ампициллин/сульбактам; DOC - доксициклин; CEF - це-фуроксим; FOX - цефокситин; CTX - цефотаксим; CAZ - цефтазидим; CAK - цефтазидим/клавуланат; CEP - цефе-пим; AZT - азтреонам; MER - меропенем; GEN - гентамицин; AMI - амикацин; CIP - ципрофлоксацин; CM - хло-рамфеникол.
Таблица 3. МПК бактериоцина S760 для резистентных к антибиотикам штаммов Acinetobacter spp. и P.aeruginosa
Штаммы __________________________МПК антибиотиков, мг/л___________________________МПК бактериоцина
AMP AMS DOC CEF FOX CTX CAZ CAK CEP AZT MER GEN AMI CIP CM S760, мг/л
A.baumannii 173 >256 16 32 >256 >256 >256 64 64 128 128 2 64 1 256 256 1,6
A.baumannii 176 >256 32 8,0 >256 128 128 8 8 16 128 <0,12 64 64 128 128 3,1
A.baumannii 260 >256 >256 32 >256 >256 256 4 1 128 >256 64 2 4 1 16 1,6
A.baumannii 273 >256 64 2 >256 >256 256 64 32 128 >256 128 8 32 2 32 1,6
A.anitratus 129 128 8 <0,12 128 128 64 >256 <0,12 16 >256 <0,12<0,12 16 16 128 0,8
A.lvoffi 125 >256 >256 0,5 >256 256 256 128 128 64 >256 256 16 32 4 4 0,8
P.aeruginosa 107 >256 256 128 >256 >256 32 2 2 1 8 0,5 2 4 <0,12 64 0,4
P.aeruginosa 135 >256 >256 256 >256 >256 >256 32 32 16 16 2 256 128 64 >256 25
P.aeruginosa 184 >256 256 64 >256 >256 >256 256 32 64 256 <0,12 128 16 64 128 25
P.aeruginosa 214 >256 >256 256 >256 >256 >256 64 64 32 8 32 >256 128 16 >256 6,2
P.aeruginosa 216 >256 >256 256 >256 >256 >256 64 64 64 2 64 32 32 256 256 6,2
P.aeruginosa 235 >256 >256 256 >256 >256 >256 32 32 32 4 32 >256 128 32 >256 6,2
P.aeruginosa 382 >256 >256 128 >256 >256 >256 32 32 32 4 64 >256 128 64 >256 6,2
P.aeruginosa 468 >256 >256 128 >256 >256 256 32 32 32 4 l28 >256 128 32 >256 12,5
P.aeruginosa 469 >256 >256 >256 >256 >256 256 16 16 16 32 64 128 64 128 256 6,2
грибковую активность в отношении двух штаммов A.niger (МПК=0,2—12,5 мг/л) (рисунок, в).
Обсуждение результатов
Бактериоцины, продуцируемые эубактериями, рассматриваются в настоящее время как новая, альтернативная традиционным антибиотикам, перспективная генерация антимикробных средств для медицины, ветеринарии и пищевой промышленности [12, 24]. Одним из замечательных свойств бактериоцинов, и к сожалению, наименее изученным, является их способность оказывать бактерицидное действие на устойчивые к антибиотикам варианты патогенных микроорганизмов. На сегодняшний день антимикробное действие против устойчивых к антибиотикам патогенов продемонстрировано в опытах in vitro и in vivo для отдельных бактериоцинов — лактицина 3147, марсацидина, микоцина А и мутацина B-Ny226 [25—27].
В 2009 г. нами впєрвьіє были получєньі данные, свидєтєльствуюшиє о способности бактериоцинов класса 2а подавлять in vitro рост множественно-устойчивых к антибиотикам грамположительных и грамотрицательных патогенов, включая возбуди-тєлєй нозокомиальных инФєкций [14]. В настоя-шєй работе прeдcтaвлeны рeзyльтaты изучєния in vitro антимикробной и антигрибковой активности бактериоцина S760, продуцируемого штаммом E.faecium LWP760. Как показали провeдённыe ис-cлeдовaния, энтероцин 760 активно подaвляeт рост и рaзмножeниe чувствительных к антибиотикам типовых и клиничєскнх культур S.enteritidis, S.typhimurium, C.jejuni, E.coli О157Н:7, Y.enterocoliti-ca, Y.pseudotuberculosis, L.monocytogenes и C.perfrin-gens, основных воз6удитєлєй пишєвьіх инФєкций человека. Величина МПК энтероцина для указанных патогенов колебалась в пределах 0,05—1,5 мг/л. Высокочувствительными к энтероцину S760 были
О
Є
штаммы S.pyogenes, S.pneumoniae, а также культуры возбудителя дифтерии человека. Следует отметить факт чувствительности к энтероцину S760 кислотоустойчивого сапрофита M.smegmatis. Ранее нами было показано, что этот пептид является губительным также для возбудителя туберкулёза [28]. Устойчивыми к бактериоцину S760 оказались клинические штаммы C.difficile — возбудители тяжёлой нозокомиальной диареи у человека.
Изученные в работе множественно-устойчивые к антибиотикам клинические штаммы S.aureus, энтеробактерии K.pneumoniae и E.cloa-cae, а также неферментируюшие грамотрица-тельные культуры P.aeruginosa и Acinetobacter spp., ведушие возбудители госпитальных инфекций во многих странах мира, также были чувствительными к энтероцину S760 (см. табл. 2, 3), хотя уровень чувствительности к антимикробному пептиду колебался как у отдельных представленных видов микроорганизмов, так и среди штаммов внутри одного вида. Наиболее чувствительными к энтероцину были штаммы S.aureus, Acinetobacter spp. и E.cloacae (MnK 0,05—3 мг/л), наиболее устойчивыми — штаммы K.pneumoniae (MnK 6 мг/л) и P.aeruginosa (MnK 0,4—25 мг/л). Обрашает на себя внимание факт, что все устойчивые к меропенему штаммы P.aeruginosa и Acinetobacter spp. были чувствительны к бактериоцину: MnK пептида для меропенемоустойчивых псевдомонад составляла 6—12 мг/л, для ацинето-бактеров — 0,7—1,6 мг/л. Чувствительными к бактериоцину оказались резистентные к антибиотикам клинические штаммы возбудителей брюшного тифа и сальмонеллёза человека: MnK пептида для обеих групп сальмонелл составляла 1,6 мг/л.
Следовательно, независимо от того, к какой группе микроорганизмов относился изучаемый патоген — к грамотрицательным или грамполо-жительным, к аэробам или анаэробам — все они были чувствительны к энтероцину S760. Таким образом, представленные выше результаты свидетельствуют о широком спектре антимикробной активности бактериоцина S760, которая распространяется на типовые и клинические культуры многих видов грамотрицательных и грамположи-тельных патогенных бактерий, включая антибиотикоустойчивые возбудители госпитальных инфекций: S.aureus, Acinetobacter spp., K.pneumoniae E.cloacae и P.aeruginosa.
Грибы Candida spp., Aspergillus spp. в определенных условиях, например при интенсивном лечении больных антимикробными препаратами широкого спектра действия, при иммунодефицитах и частом проведении инвазивных медицинских процедур, могут стать причиной поражения как отдельных органов и тканей человека, так и тяжелой системной микозной инфекции. C.albi-cans (совместно с Gardnerella vaginalis) инкрими-
нируют роль этиологического агента при бактериальном вагинозе у женщин. Поиск натуральных, безопасных для человека веществ с антифунгаль-ным действием продолжает оставаться актуальной задачей, поскольку применяемые в практике противогрибковые препараты нередко вызывают у больных нежелательные реакции. В настоящее время в ряде работ показано, что действие органических кислот, в том числе уксусной, на C.albicans весьма ограничено, и противогрибковая активность молочнокислых бактерий в отношении Candida spp. обусловлена другими их метаболитами, в частности, бактериоцинами или бактерио-циноподобными субстанциями [9]. Тем не менее исследования противогрибковой активности бак-териоцинов, продуцируемых различными микроорганизмами, свидетельствуют о том, что далеко не все изученные антимикробные пептиды бактерий способны in vitro ингибировать рост патогенных грибов [9, 29].
Изученный в данной работе бактериоцин S760 проявлял высокую антигрибковую активность в отношении 13 клинических штаммов C.albicans и трех штаммов C.krusei, а также против двух типовых лабораторных культур A.niger. Таким образом, бактериоцин S760 помимо антибактериальной активности проявляет ещё и противогрибковое действие. Объяснить феномен такого широкого спектра активности бактериоцина S760 будет возможным только после изучения молекулярных механизмов его губительного действия на бактерии и грибы. Можно высказать лишь предположение, что этот феномен связан с наличием одного или нескольких одинаковых рецепторов (или мишеней) для бактериоцина S760 у грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, а также у грибов Candida spp. и A.niger.
Заключение
Бактериоцин S760, гидрофобный, термоустойчивый, с молекулярной массой, равной 5,5 кДа, пептид, продуцируемый штаммом E.faecium LWP760, проявляет антимикробную активность in vitro против широкого круга грамположительных и грамотрицательных патогенных бактерий, как чувствительных, так и резистентных к используемым в медицине и ветеринарии антибиотикам. Бактериоцин S760 обладает также антимикотичес-ким действием, подавляя рост грибов Candida и плесневого гриба A.niger.
Представленные в работе данные, а также высокая лечебная эффективность бактериоцина S760, продемонстрированная нами ранее в экспериментах по терапии кампилобактериозной и сальмонеллёзной инфекций у бройлерной птицы, свидетельствуют о значительном потенциале этого пептида как нового антимикробного средства для использования в медицине, ветеринарии или пи-
Є
шевой промышленности. Kромe того, результатні данной работы являются дополнительным доказательством потенциала эубактерий как неисчерпаемого источника лекарственных препаратов нового
ЛИТЕРАТУРА
1. Peterson D. L., Rossi F. et al. In vitro susceptibilities of aerobic and facultative Gram-negative bacilli isolated from patients with intra-abdominal infections worldwide: the 2003 Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART). J Antimicrob Chemother 2005; 55: 6: 965—973.
2. Страчунский Л. С. /3-лактамазы расширенного спектра — быстро растушая и плохо осознаваемая угроза. KnnH микробиол антимикроб химиотер 2005; 7: 1: 92—96.
3. Chopra I., Schofield C., Everett M. et al. Treatment of healthcare-associated infection caused by Gram-negative bacteria: a consensus statement. Lancet Infect Dis 2008; 8: 2: 133—139.
4. Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K. et al. Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure, and activity. FEMS Microbiol Rev 2000; 24: 1: 85—106.
5. Popaganni M. Ribosomally synthezed peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv 2003; 21: 6: 465—499.
6. Pascual L. M, Dariele M. B., Giordano W. et al. Purification and partial characterization of novel bacteriocin L23 produced by Lactobacillus fer-mentum L23. Curr Microbiol 2008; 56: 4: 97-402.
7. Svetoch E, Eruslanov B., Perelygin V. et al. Diverse antimicrobial killing by Enterococcus faecium E 50-52 bacteriocin. J Agric Food Chem 2008; 56: 6: 1942—1948.
8. Galves A., Abriouel H., Benomar N., Lucas R. Microbial antagonists to food-borne pathogens and biocontrol. Curr Opin Biotechnol 2010; 21: 2: 142—148.
9. Kaewsrichan J., Peeyananjarassri K., Kongprasertkit J. Selection and identification of anaerobic lactobacilli producing inhibitory compounds against vaginal pathogens. FEMS Immunol Med Microbiol 2006; 48: 1: 75—83.
10. Cornut G, Fortin C., Soulieres D. Antineoplastic properties of bactiocins: revisiting potential active agents. Am J Clin Oncol 2008; 31: 4: 399—404.
11. Todorov S. D., Dicks L. M. T. Partial characterization of bacteriocins produced by four lactic acid bacteria isolated from regional South African barley beer. Annals of Microbiol 2004; 54: 4: 403—413.
12. Sang Y., Blecha F. Antimicrobial peptides and bacteriocins: alternatives to traditional antibiotics. Anim Health Res Rev 2008; 9: 2: 227—235.
13. Piper C., Draper L. A., Cotter P. D. et al. A comparison of the activities of lacticin 3147 and nisin against drug-resistant Staphylococcus aureus and Enterococcus species. J Antimicrob Chemother 2009; 64: 3: 546—551,
14. Svetoch E. A., Eruslanov B. V., Kovalev Y. N. et al. Antimicrobial Activities of Bacteriocin E 50-52 and B 602 Against Antibiotic-Resistant Strains Involved in Nosocomial infections. Probiotic Antimicrob Prot 2009; 1: 2: 136—142.
поколения — антимикробных пептидов — для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе с их антибиотикоустойчивыми вариантами.
15. Lawton E. M., Ross R. P., Hill C. et al. Two-peptide lantibiotics: a medical perspective. Mini Rev Med Chem 2007; 7: 12: 1236—1247.
16. Щетинин E. В. Полимиксины — новый взгляд на известные антибиотики. Клин Микробиол Антимикроб Химиотер 2000; 7: 3: 68—73.
17. Riley M. Research and Applications in Bacteriocins / Ed. M. F. Riley. O. Gillor. Horizon Bioscience, 2007; 153—180.
18. Duc le H., Hong T. M., Barbosa J. A. et al. Characterization of Bacillus probiotics available for human use. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 4: 2161—2171.
19. Line J., Svetoch E. A., Eruslanov B.V. et al. Isolation and purification of enterocin E-760 with broad antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 3: 1094—1100.
20. Klaenhammer T. R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 1993; 12: 1—3: 39—85.
21. Светоч Э. А., Ерусланов Б. В., Левчук В. П. и др. Новый класс антимикробных препаратов — бактериоцины и их применение для борьбы с кампил о бактериозом и сальмонеллёзом бройлерной птицы. III Международный Ветеринарный Конгресс по Птицеводству. М.: 2007; 205—212.
22. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ Г. Г. Онищенко 04.03.2004 г.
23. NCCLS/CLSI. 2006. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Document M7-A5. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
24. Joerger R. D. Alternatives to antibiotics: Bacteriocins, Antimicrobial Peptides and Bacteriophages. Poultry Science 2003; 82: 4: 640—647.
25. Kruszewka D., Sahl H., Bierbaum G. et al. Mersacidin eradicates methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a mouse rhinitis model. J Antimicrob Chemother 2004; 54: 3: 648—653.
26. Mota-Meira M., Morency H., Lavoie M. C. In vivo activity of mutacin B-Ny266. J Antimicrob Chemother 2005; 56: 5: 869-871.
27. Sit C. S., Videras J. C. Aproaches to the discovery of new antibacterial agents based on bacteriocins. Biochem Cell Biol 2008; 86: 116—123.
28. Sosunov V., Mischenko V., Eruslanov B. et al. Antimycobacterial activity of bacteriocins and their complexes with liposomes. J Antimicrob Chemother 2007; 59: 5: 919—925.
29. Lertcanawanichakul M. Isolation and Selection of Anti-Candida albicans Producing Lactic Acid Bacteria. Walailak J Sci Tech 2005; 2: 2: 179—187.
