CC BY
25
УДК: 543.9 + 543.38
АНТИМИКОЗНАЯ АКТИВНОСТЬ АЗОТНОКИСЛОГО СВИНЦА НА ПРИМЕРЕ ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА ASPERGILLUS UNGUIS F-1754
Е.Д. Губина, Н.С. Ляховченко, В. Ю. Сенченков, Д. А. Прибылов, А.А.Чепурина, И.А. Никишин, А.А. Авакова, М.А. Гоянов, А.В. Зиновьева, А.А. Сиротин
Представлены результаты исследования антимикозной активности азотнокислого свинца на примере Aspergillus unguis F-1754, в ходе которого выявлено, что металл не подавляет рост плесневого гриба полностью, но замедляет его на 69,43 % при повышении концентрации нитрата свинца до 0,75 %. Тогда как внесение той же доли азотнокислого кальция в среду оказало стимулирующее действие на 28,42 % относительно контрольной группы. Таким образом, продемонстрировано, что свинец проявляет фунгистатические свойства по отношению к A. unguis F-1754.
Ключевые слова: антимикозная активность, фунгистатические свойства, плесневые грибы, тяжелые металлы, металлорезистентность.
Введение
Грибы рода Aspergillus - одни из самых распространенных гифомицетов. Описаны впервые в 1729 г. итальянским микологом П. Микели. В настоящее время род насчитывает 339 известных видов [1].
A. unguis характеризуется медленным формированием ограниченных, ровных колоний, с небольшими выпуклыми скоплениями рыхлых пушистых гиф до 2-3 мм высотой. В центре сизо-зеленые с более низкими светлыми, неровными, выступающими отдельными участками и полупоргруженным краем. Конидиеносцы короткие, 45-65x3-5 мкм, тускло-коричневые, с гладкой оболочкой. Апикальное расширение почти шаровидное, 9-12 мкм в диаметре. Конидии шаровидные, 2,5-3,5 мкм в диаметре, тускло-зеленые, слабо-морщинистые. Реверзум неокрашенный [2].
Грибы рода Aspergillus очень востребованы в биотехнологическом производстве, поскольку их легко культивировать и получать в больших количествах. Использование Aspergillus связано с производством различных гидролитических ферментов (амилазы, липазы) и органических кислот (лимонная кислота, глюконовая кислота), а также биологически активных метаболитов, таких как ловастатин [3].
К экологическим факторам, существенно воздействующих на рост грибов в естественной среде обитания, относятся тяжёлые металлы [4]. Одним из таких металлов является свинец.
Свинец обладает кумулятивным токсическим воздействием на различные системы организма человека, то есть способен накапливаться
до критических концентраций [5], что может вызывать проблемы со здоровьем на протяжении всей жизни. Избыток свинца в растениях, связанный с высокой его концентрацией в почве, ингибирует дыхание и подавляет процесс фотосинтеза, иногда приводит к увеличению содержания кадмия и снижению поступления цинка, кальция, фосфора, серы. Вследствие этого снижается урожайность растений и резко ухудшается качество производимой продукции [6]. Загрязнение почвы тяжелыми металлами может угнетать или стимулировать рост плесневых грибов, в том числе и металлорезистентных, к которым относятся некоторые представители рода Aspergillus [7].
Цель работы заключается в выявлении противогрибковой активности свинца. Задачи данного исследования: сравнить влияние разных концентраций солей свинца на скорость роста A. unguis F-1754 и изучить ингибирующую активность тяжелого металла.
Материалы и методы
Диско-диффузный метод. Исследование антимикозной активности нитрата свинца на примере плесневого гриба A. unguis F-1754 проводили диско-диффузным методом, который основан на способности исследуемых веществ диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в твердую питательную среду, угнетая рост микроорганизмов [8]. Для проведения опыта методом диффузии в агар, суспензию спор, равную 0,5 оптической плотности (ОП) при 600 нм, подготовленную с использованием Microscan Turbidity Meter (производство Siеmens, США) засевали «газоном» по 100 мкл в заранее подготовленные чашки Петри, содержащие по 10 мл среды Сабуро. Стерильные бумажные диски (диаметром 12 мм), пропитанные суспензией исследуемого раствора размещали в засеянные чашки (по 6 дисков на одну чашку). Повторность -2 чашки на каждый исследуемый образец. Посевы инкубировались при 27°С в течение 48 часов. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста.
Метод линейного роста колоний. Также изучали влияние нитрата свинца на рост A. unguis F-1754 методом линейного роста колоний. Чашки Петри с 10 мл питательной среды Сабуро, содержащей исследуемые образцы в различных концентрациях, засевали тест-культурой плесневого гриба отпечатком (в 4 повторностях). Нитрат кальция использовали для того, чтобы удостовериться в отсутствии ингибирующей активности тяжелого металла за счет активности нитрозной группы. Каждые 24 часа измеряли диаметр колонии в двух взаимоперпендикулярных направлениях.
Рассчитывали средний квадратический диаметр колоний по формуле
s =
п
где S - средняя квадратическая, V - дата, п - число измерений [9]. Скорость роста колоний (Кр) находили по формуле
Кр —
r-rn
t-tr
(1)
(2)
где Кр - скорость роста колонии, т0 - диаметр колонии при первом измерении, г - диаметр колонии при последнем измерении, t0 - время инкубации на момент первого измерения диаметра колонии, t - время инкубации на момент последнего измерения диаметра колонии [10].
Для расчёта достоверности различия антимикозной активности пользовались статистической обработкой усреднённых радиусов зон ингибирования. Для расчета различий радиального роста колоний использовали разностный метод [11].
Результаты и обсуждение
Скорость радиального роста колоний плесневого гриба A. unguis F-1754 составила 0,29 мм/ч (рис. 1) в условиях отсутствия солей металлов (рис. 2, 3).
Рис. 1. Скорость радиального роста колоний A. unguis F-1754 как показатель ингибирующей активности Pb(NO3)2
Рис. 2. Рост A. unguis F-1754 на питательной среде, не содержащей солей металлов (48 ч)
Рис. 3. Рост A. unguis F-1754 на питательной среде, не содержащей солей металлов (144 ч)
При внесении в питательную среду 0,25 % нитрата кальция наблюдалась статистически незначимая стимуляция радиальной скорости роста A. unguis F-1754 на 18 % (рис. 4, 5), а расчетный критерий достоверности Стьюдента оказался ниже табличного (таблица). Скорость радиального роста плесневого гриба при этом составила 0,35 мм/ч (рис. 1).
Рис. 4. Рост A. unguis F-1754
на питательной среде, содержащей 0,25 % Ca(NO3)2 (48 ч)
Рис. 5. Рост A. unguis F-1754
на питательной среде, содержащей 0,25 0% Ca(NO3)2 (144 ч)
Увеличение концентрации нитрата кальция в среде до 0,75 % оказало стимулирующее действие на рост A. unguis F-1754 (рис. 6, 7), расчетный критерий Стьюдента при этом оказался ниже табличного значения (табл.). Таким образом, скорость линейного роста плесневого гриба составила 0,38 мм/ч - на 28 % выше скорости роста на контрольных образцах (рис. 1).
Рис. 6. Рост A. unguis F-1754 на питательной среде, содержащей 0,75 % Ca(NO3)2 (48 ч)
Рис. 7. Рост A. unguis F-1754 на питательной среде, содержащей 0,75 0% Ca(NO3)2 (144 ч)
Диаметр колонии Aspergillus unguis F-1754 как показатель ингибирования нитратом свинца радиальной скорости роста
плесневого гриба
Исследуемые образцы Время инкубации Средний квадратический диаметр колонии (мм) Ошибка среднего, Sd Критерий достоверности, 1расч.
Контроль(1.1) 48 ч 10,124 Sd(1.1-1.2) = 1,56 1расч. (1.1-1.2) = 1,22
Ca(NO3)2 0,25 %(1.2) 8,215
Ca(NO3)2 0,75 %(1.3) 10,541 Sd (1.1-1.3) = 1,41 1расч. (1.1-1.3) = 0,29
Pb(NO3)2 0,25 %(1.4.) 11,045 Sd (1.1-1.4) = 1,32 1расч. (1.1-1.4) = 0,69
Pb(NO3)2 0,75 %(1.5) 5,22 Sd(1.1-1.5) = 1,84 1расч.(1.1-1.5) = 2,66
Продолжение таблицы
Исследуемые образцы Время инкубации Средний квадратический диаметр колонии (мм) Ошибка среднего, Sd Критерий достоверности, tрасч.
Контроль^) 72 ч 19,з81 Sd(2.1-2.2) = 2,з 1 tрасч. (2.1-2.2) = = 0,44
Ca(NOз)2 0,25 % (2.2) 18,зб7
Ca(NOз)2 0,75 %(2.2) 25,154 Sd(2.1-2.2) = 4,88 tрасч.(2.1-2.2) = = 1,18
РЬ(Шз)2 0,25 %(2.3) 20,161 Sd(2.1-2.3) = 1,88 tрасч. (2.1-2.з) = = 0,42
Pb(NOз)2 0,75 %(2.4) 6,991 Sd(2.l-2.4) = 1,78 tрасч.(2.1-2.4) = = 6,97**
Контроль(зл) 96 ч 24,264 Sd(з.l-з.2) = 2,з2 1расч.(з.1-з.2) = = 0,з1
Са(Шз)2 0,25 % (3..2) 24,989
Са(Шз)2 0,75 %(з.з) з 1,825 8ё(з.1-з.з) = 5,96 1расч.((з.1-з.з) = = 1,26
РЬ(ШзЬ 0,25 %(з.4) 26,зз9 Sd(.з.з-з.4) = 1,з0 1расч. (з.з-з.4) = = 1,58
РЬ(Шз)2 0,75 %(з.5) 9,199 Sd(з.l-з.5) = 1,18 1расч.(з.1-з.5) = = 12,69***
Контроль(4.1) 120 ч 27,з7з Sd(4.l-4.2) = 1,78 1расч..(4.1-4.2) = = 0,4з
Са(Шз)2 0,25 % (4.2) 28,1зз
Са(Шз)2 0,75 %(4.з) з4,179 Sd(4.l-4.з) = 2,06 1расч.(4.1-4.з) = = 28***
РЬ(ШзЬ 0,25 %(4.4) 26,210 Sd(4.1-4.4) = 2,1 з 1расч.(4.1-4.4) = = 0,55
РЬ(ШзЬ 0,75 %(4.5) 10,з07 Sd(4.l-4.5) = 1,22 1расч.(4.1-4.5) = = 1з 97***
Контроль(5.1) 144 ч з2,з55 Sd(5.1 -5.2) = 2,02 1расч. (5.1-5.2) = = 1,22
Са(Шз)2 0,25 % (5.2) з4,826
Продолжение таблицы
Исследуемые образцы Время инкубации Средний квадратический диаметр колонии (мм) Ошибка среднего, Sd Критерий достоверности, tрасч.
Ca(NOs)2 0,75 %(5.з) 144 ч 39,092 Sd(5.1-5.3) = 3,16 1расч(5.1-5.3) = = 2,13
Pb(NOs)2 0,25 %(5.4) 31,036 Sd(5.1-5.4) = 2,07 1расч..(5.1-5.4) = = 0,63
Pb(NO3)2 0,75 %(5.5) 12,015 Sd(5.1-.5.5) = 1,30 1расч.(5.1-5.5) = = 15,57***
Примечание:
** - различие статистически значимо на уровне р < 0,01; ** - различие статистически значимо на уровне р < 0,01; *** - различие статистически значимо на уровнер < 0,001.
Внесение в питательную среду 0,25 % раствора нитрата свинца не оказало сильного ингибирующего влияния на рост мицелия в условиях культивирования грибов на твердой питательной среде (рис. 8-9). Скорость роста A. unguis F-1754 в данных условиях составила 0,26 мм/ч, что на 10 % ниже скорости роста плесневого гриба на контрольных образцах (рис. 1).
Рис. 8. Рост A. unguis F-1754 Рис. 9. Рост A. unguis F-1754
на питательной среде, на питательной среде
содержащей 0,25 % Pb(NO3)2 (48 ч) содержащей, 0,25 % Pb(NO3)2
(144 ч)
Увеличение концентрации раствора нитрата свинца до 0,75 % показало статистически значимое подавление скорости радиального роста A. unguis F-1754 - на 69 % (рис. 10, 11) по сравнению с контрольными образцами. Скорость роста оказалась равной 0,09 мм/ч (рис. 1).
Рис. 10. Рост A. unguis F-1754 на питательной среде, содержащей 0,75 % Pb(NO3)i (48 ч)
Рис. 11. Рост A. unguis F -1754 на питательной среде, содержащей 0,75 % Pb(NO3)i (144 ч)
В ходе исследования антимикозной активности нитрата свинца диско-диффузным методом на примере A. unguis F-1754 выявлено, что соли металлов в концентрациях 0,25, 0,5, 0,75 и 1 % не проявили ингибирующих свойств (рис. 12).
Рис. 12. Зона подавления A. unguis F-1754 0,75 % раствором Pb(NO3)i
Таким образом, в ходе исследования была выявлена антимикозная активность азотнокислого свинца по отношению к плесневому грибу A.unguis F-1754. Концентрация раствора 0,25 % нитрата свинца оказывает статистически незначимое подавление роста мицелия тест-культуры. При воздействии на плесневый гриб данной концентрации азотнокислого
свинца, он проявляет металлорезистентность, что наблюдается при изучении воздействия соли металла как диско-диффузным, так и методом линейного роста колоний. Увеличение концентрации раствора нитрата свинца до 0,75 % показало статистически значимое подавление радиального роста A. unguis F-1754 на 69 % по сравнению с контрольными образцами, изученного методом линейного роста колонии, а в ходе исследования диско-диффузным методом антимикозная эффективность 0,75 %-ного нитрата свинца не проявилась. Мицелий плесневого гриба на питательной среде с 0,75 %-м содержанием соли свинца развивается довольно медленно и слабо. Исходя из этого, можно сделать вывод, что свинец обладает фунгистатическим действием в концентрации 0,75 %, а плесневый гриб A. unguis F-1754 - металлорезистентностью, так как он адаптируется к абиотическому фактору в низких дозах, что показано методом диффузии вещества в питательную среду.
Кроме того, в ходе исследования влияния на линейный рост мицелия плесневого гриба A. unguis F-1754 азотнокислого кальция (в качестве контроля (NO^-группы) выявлена его стимулирующая активность в концентрациях 0,25 % (средний квадратический диаметр колоний на 18 % превышает контрольный) и 0,75 % (средний квадратический диаметр колоний на 28 % превышает контрольный). Это может быть связано с активным участием кальция в процессе метаболизма плесневого гриба: в качестве вторичного мессенджера, с помощью которого осуществляется трансдукция различных внешних стимулов и гормональных сигналов в клетках [12]. Для дальнейшего и более подробного изучения адаптивных процессов металлорезистентности тест-культуры необходимо провести биохимический анализ воздействия солей кальция и свинца на метаболическую активность плесневого гриба A. unguis F-1754.
Работа выполнена в рамках гос.задания №FZWG-2020-0021.
Список литературы
1. Тахтаджян А. Л. Жизнь растений. В 6 т. Т.2. Грибы. М.: Просвещение, 1974. 508 с.
2. Билай В. И., Коваль Э. З. Аспергиллы: определитель. Киев: Наукова думка, 1988. 204 с.
3. Perrone G., Gallo A. Aspergillus species and their associated mycotoxins // Mycotoxigenic Fungi. Humana Press. 2017. P. 33-49.
4. Сазанова К.В. Органические кислоты грибов и их экологофизиологическое значение: дис. ... канд. биол. наук: 03.01.05 . СПБ, 2014. 159 с.
5. Носолевская В.В., Пухаева Е.Г., Туаева С.Р. Генетическая активность лекарственного препарата «немозол» в доминантно-летальном тесте на фоне ацетата свинца // Современные проблемы биологии, экологии, химии, 2013. С. 14-15.
6. Ильин В.Б. К вопросу о разработке ПДК тяжелых металлов // Агрохимия. 1985. № 10. С. 94-101.
7. Багаева Т.В., Ионова Н.Э., Надеева Г.В. Микробиологическая ремедиация природных систем от тяжелых металлов: учеб.-метод. пособие. Казань: Казанский университет, 2013. 56 с.
8. Диско-диффузионный метод // ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Отдел новых технологий URL: https://www.dntpasteur.ru/metodic2 4 3/ (дата обращения: 11 августа 2020).
9. Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие. Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2006. 56 с.
10. Методы экспериментальной микологи: справочник / Дудка И.А. [и др.]. Киев ,1982. 535 с.
11. Основы научных исследований в агрономии / Моисейченко В.Ф. [и др.]. М., 1996. 336 с.
12. Козлова О.В., Егоров С.Ю., Куприянова-Яшина Ф.Г. Влияние различных кальций-модулирующих воздействий на рост культуры Aspergillus awamori // Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. 2005. Т. 147. № 3. С. 95-119.
Губина Елизавета Дмитриевна, студент, [email protected], Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Ляховченко Никита Сергеевич, аспирант, 10 73225@bsu. edu. ru, Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Сенченков Владислав Юрьевич, аспирант, senchenkov@,bsu. edu. ru, Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Прибылов Даниил Анатольевич, студент, [email protected], Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Чепурина Анна Александровна, студент, [email protected], Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Никишин Илья Андреевич, студент, [email protected], Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Авакова Алина Артуровна, студент, [email protected], Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Гоянов Михаил Альбертович, студент, 1389098@bsu. edu.ru, Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Зиновьева Алина Владиславовна, студент, [email protected], Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет,
Сиротин Александр Андреевич, профессор, канд. биол. наук, sirotin@,bsu.edu.ru, Россия, Белгород, Белгородский государственный национальный исследовательский университет
ANTIMICOSE ACTIVITY OF LEAD NITRATE ON THE EXAMPLE OF MOLD FUNGI ASPERGILLUS UNGUIS F-1754
E.D. Gubina, N.S. Lyakhovchenko, V.Yu. Senchenkov, D.A. Pribylov, A.A. Chepurina, I.A. Nikishin, A.A. Avakova, G.A. Goyanov, A.V. Zinovyeva, A.A. Sirotin
The paper presents the results of a study of the antimycotic activity of lead nitrate using the example of Aspergillus unguis F-1754, during which it was revealed that the metal does not completely suppress the growth of mold, but slows it down by 69,43 % with an increase in the concentration of lead nitrate to 0,75 %. Calcium nitrate in the environment has a stimulating effect by 28,42 % relative to the control group. Thus, it was shown that lead exhibits fungistatic properties in relation to A. unguis F-1754.
Key words: antimicose activity, fungistatic properties, molds, heavy metals, metal resistance.
Gubina Elizaveta Dmitrievna, student, 13 78429@bsu. edu.ru, Russia, Belgorod, Belgorod National Research University,
Lyakhovchenko Nikita Sergeevich, postgraduate student, 10 73225@bsu. edu. ru, Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Senchenkov Vladislav Yurievich, postgraduate student senchenkov@bsu. edu. ru, Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Pribylov Daniil Anatolyevich, student, [email protected], Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Chepurina Anna Alexandrovna, student, 13 78399@bsu. edu.ru, Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Nikishin Ilya Andreevich, student, [email protected], Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Avakova Alina Arturovna, student, 13 78405@bsu. edu.ru, Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Goyanov Mikhail Albertovich, student, 1389098@bsu. edu. ru, Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Zinovieva Alina Vladislavovna, student, [email protected], Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University,
Sirotin Alexander Andreevich, professor, candidate of biological sciences, professor, sirotin@,bsu. edu. ru, Russia, Belgorod, Belgorod State National Research University
