CC BY
74
УДК 579.61: 616-078 ББК 52.64 Х 36
Н.С. Хиштова
Антилизоцимная активность гемолитических E.coli, выделенных от больных с заболеваниями ЖКТ
(Рецензирована)
Аннотация:
Изучен фактор персистенции (антилизоцимный) у больных с соматическими заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Г емолитические эшерихии достоверно чаще обладали общей АЛА, и в подгруппе эшерихии с выраженной ферментативной активностью признак выражен чаще, чем в других подгруппах. С повышением концентрации лизоцима отмечается снижение частоты встречаемости признака у типичных и гемолитических эшерихии, но частота всречаемости АЛА среди штаммов Е.соН Н1у+ все же выше, чем у типичных Е.соН и выявляется с достоверной разницей чаще у лактозонегативных штаммов.
Ключевые слова:
Антилизоцимная активность, ферментативная активность, гемолитические и типичные эшерихии.
Введение
Расшифровка механизмов бактериальной персистенции открывает перспективы для решения таких медико-биологических проблем, как понимание природы бактерионосительс-ва, выявление причинноследственных связей дисбиозов,
совершенствование диагностических
препаратов, создание основ
микроэкологического мониторинга объектов внешней среды [8]. В последние годы в ряде работ активно обсуждаются факторы бактериальной персистенции, обеспечивающие длительное выживание возбудителя в организме хозяина [5,7,2]. Они определяют их селективные преимущества в колонизации биотопов, что имеет важное значение в развитии заболеваний микробной этиологии в неинфекционной клинике [8,1], например, в патологии желчевыводящих путей [9]. Учитывая значительную роль кишечной микрофлоры в эндогенном инфицировании [10], интересным представляется изучение состояния микробиоценоза толстой кишки при различных заболеваниях. Отмеченная идентичность в 74% случаев возбудителей, выделенных из фекалий и желчи [6], и наличие факторов персистенции у изолируемых штаммов
бактерий при дисбиозе подтверждают ведущую роль кишечного микробиоценоза в возникновении воспалительных процессов в ЖКТ [4]. В данной работе представлены результаты определения одного из факторов персистенции (анти-лизоцимного) у больных с соматическими заболеваниями желудочнокишечного тракта.
Материалы и методы
Определение антилизоцимного признака (АЛА) Е.соН проводилось с применением чашечного метода [3]. В ряд чашек Петри с питательным агаром, содержащим лизоцим в различных концентрациях - 1,0; 3,0; 4,0; 6,0;
10,0 мкг/мл, бляшками засевали суточные культуры гемолитических Е.соН. После инкубации при 37°С в течение суток, выросшие культуры убивали парами хлороформа. Сверху наслаивали 3-4 мл полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл индикаторной культуры (ИК) Мюгососсш 1иеш АТСС 15307 (10 ед. оптичекого стандарта мутности; ГИСК им. Тарасевича). Учет результатов проводили после 24 часов инкубации при 37°С, по наличию роста Мсгососсш 1Шеш на поверхности и вокруг колоний исследуемых культур типичных и гемолитических Е.соН, инактивировавших известную концентрацию
лизоцима, внесенную в питательную среду. На поверхности и вокруг неактивных культур E.coli в отношении АЛА, рост микрококка отсутствовал, т.к. оставшийся лизоцим лизировал индикаторный штамм.
Всего в работу было взято 107 исследуемых культур: 23 штамма типичных и 84 штамма гемолитических эшерихии (E.coli Hly+), выделенных от больных с заболеваниями ЖКТ с разной степенью дисбактериоза.
Результаты
По степени инактивирования лизоцима, выраженной в мкг/мл, все исследуемые культуры были разбиты на группы:
1. Концентрация лизоцима 1,0-3,0 мкг/мл.
2. Концентрация лизоцима 4,0-6,0 мкг/мл.
3. Концентрация лизоцима 1,0-6,0 мкг/мл.
4. Концентрация лизоцима более 6,0 мкг/мл.
5. Концентрация лизоцима более 10,0 мкг/мл.
Для изучения взаимосвязи ферментативной и антилизоцимной активности гемолитические
эшерихии были разбиты на подгруппы:
I. E.coli Н1у+ с выраженной ферментативной активностью (ксмб) - 28 штаммов;
И. E.coli Hly+ со сниженной ферментативной активностью (бмб) - 38 штаммов;
Ш. E.coli Hly+ лактозонегативные (lac-) -18 штаммов.
Из изучаемых культур 15 штаммов типичной и 67 штаммов гемолитической кишечной палочки проявили антилизоцимную активность - 65,2±1,7 и 79,8±4,4% М±т соответственно. АЛА оказалась достоверно выше у гемолитической E.coli в 1,2 раза (t=3,l, n>30, р<0,01) (таб. 1)
АЛА с концентрацией лизоцима 1,0-
3,0 мкг/мл в среде было изучено у 15 штаммов типичной кишечной палочки, из них 13 штаммов проявили активность - 86,7±8,7%, гемолитические E.coli проявили активность в 23 случаях - 27,3±5,9%. АЛА у типичных эшерихии в низких концентрациях (1,0-3,0 мкг/ мл) составила 86,7±8,7, в средних (4,0-6,0 мкг/мл) - 13,3±8,7, т.е. с повышением
концентрации лизоцима, количество активных штаммов снизилось в 6,5 раз (р<0,001). Наоборот, гемолитические E.coli при
повышении концентрации лизоцима повысили свою активность в 1,3 раза: 35,8±5,9 против 27,3±5,9 М±т % и в 2,6 раз по сравнению с типичной Е.соїі (р<0,05).
Из подгрупп гемолитических эшерихии наибольшая частота встречаемости АЛА к концентрации 1,0-3,0 мкг/мл отмечается в I подгруппе - эшерихии с выраженной ферментативной активностью - 43,5±10,4%; наименьшая - в группе лактозонегативных Е.соїі Н1у+ - 13,3±8,7%. С концентрации лизоцима 4,0-6,0 мкг/мл из подгрупп гемолитических эшерихии наибольший процент встречаемости штаммов с данной АЛА также приходится на I подгруппу - эшерихии с выраженной ферментативной активностью -39,1±10,2%, наименьший - на лактозонегативные - 33,3±12,1%.
В 3 группе с АЛА к концентрации лизоцима 1,0-6,0 мкг/мл, активность проявили 47 штаммов Е.соїі Н1у+ - 70,1 ±5,6%. Не отмечается достоверной разницы
антилизоцимной активности между гемолитическими и типичными эшерихиями (65,2±1,7%). Также чаще инак-тивировали лизоцим в данной концентрации Е.соїі Н1у+ I подгруппы - 82,6±7,0; с наименьшей частотой
- эшерихии III подгруппы -лактозонегативные.
Со степенью АЛА более 6 мкг/мл было выявлено 20 штаммов Е.соїі Н1у+ (29,8±5,6%). Чаще АЛА определялась в III подгруппе гемолитических эшерихии - лактозонегативных - в 53,3±12,9% случаев, с наименьшей - в I подгруппе - 17,4±7,0% (р<0,02).
АЛА более 10 мкг/мл определялась у 9 штаммов гемолитических эшерихий -10,7±8,3%. Достоверной разницы частоты выявления признака среди подгрупп не обнаружено: I подгруппа - 8,7±6,0; II подгруппа -10,3+5,6; III - 21,7±11,5% (Г-Ш р>0,1; П-Ш р>0,2). Типичных эшерихии с АЛА более 6 мкг/мл выявлено не было.
Обсуждение
У типичных эшерихии отмечается высокая частота АЛА к низким концентрациям ли-зоцима (1,0-3,0). При сравнении АЛА 1,0-3,0 и 4,0-6,0 мкг/мл среди штаммов типичных эше-рихии, обнаружено с достоверной разницей снижение частоты признака с увеличением
концентрации лизоцима в среде (р<0,001) в 6,5 раз: 86,7±8,7 против 13,3±8,7% соответственно. При возрастании АЛА выше 6 мкг/мл штаммов E.coli с такой активностью не обнаружено.
Е.соН Н1у+ проявляют общую АЛА достоверно выше, чем типичные эшерихии в 1,2 раза (t=3,l n>30 р<0,01), но между группами гемолитических эшерихии достоверной разницы по частоте встречаемости активных штаммов по АЛА не выявлено.
Гемолитические эшерихии всех трех подгрупп проявляют общую АЛА выше, чем типичные: с выраженной ферментативной
активностью и лактозонегативные в 1,3 раза (р<0,05), слабоферментирующие формы - в 1,2 раза (р>0,1). При низких концентрациях лизоцима (1,0-3,0) частота встречаемости АЛА в ниже, чем у типичных E.coli в 3,2 раза (р<0,001), но с увеличением АЛА до 4,0-6,0 мкг/мл, отмечается увеличение числа штаммов
- 35,8±5,9% и достоверно превышает значения АЛА у типичных эшерихии в 2,6 раз (р<0,05). С последующим возрастанием концентрации лизоцима более 6,0 мкг/мл происходит уменьшение числа активных штаммов по сравнению с предыдущими концентрациями АЛА в 1,1-1,2 раза.
При низких концентрациях АЛА наиболее часто определяется у штаммов с выраженной ферментативной активностью - 43,5±10,4, с наименьшей частотой - у лактозонегатив-ных эшерихии - 13,3±8,7%, т. е. в 3,2 раза реже. При этом их активность ниже, чем у типичных E.coli: в 2-2,3 раза (р<0,01) у штаммов с выраженной и слабовыраженной ферментативной активностью, и в 6,5 раз у лактозонегативных (р<0,001). С наибольшей частотой АЛА также выражена в концентрациях 4,0-6,0 мкг/мл у E.coli Hly+ в подгруппе с выраженной ферментативной активностью - 39,1± 10,2%, но среди подгрупп гемолитических эшерихии достоверной разницы частоты встречаемости признака при концентрации лизоцима 1,0-3,0 и 4,0-6,0 мкг/мл не выявлено.
Отмечается повышение активности лактозонегативных гемолитических эшерихии при средних концентрациях лизоцима по сравнению с низкими концентрациями в 2,5 раз (р>0,1) - 33,3±12,1 и 13,3±8,7% соответственно.
При высоких концентрациях лизоцима АЛА, наоборот, достоверно выше у лактозонегативных E.coli Hly+ по сравнению с I (р<0,02) и II (р>0,05) подгруппами в 3,1 и 1,9 раз соответственно, и у слабоферментирующих E.coli Hly+ по сравнению с I подгруппой в 1,6 раз (р>0,2). С концентрацией лизоцима более 10 мкг/мл проявили активность только 9 штаммов гемолитической E.coli - 10,7±8,3%. Среди них также чаще определялись штаммы лактозонегативных E.coli Hly+, наименее часто (в 2,7 раз) - штаммы с выраженной ферментативной активностью.
При средних концентрациях лизоцима не отмечено существенной разницы по частоте встречаемости признака, но при значениях АЛА 1,0-6,0 мкг/мл обнаружено превышение показателя у E.coli Hly+ с выраженной ферментативной активностью в 1,8 раз, чем у лактозонегативных.
Выводы
Общей АЛА гемолитические эшерихии достоверно чаще обладали, чем типичные E.coli. При этом в подгруппе гемолитичексих эшерихии с выраженной ферментативной активностью признак выражен чаще, чем в других подгруппах. Способность
инактивировать лизоцим в небольших концентрациях (1,0-3,0 мкг/мл) выявлена как у типичных, так у эшерихии с Н1у+ активностью, но у типичной кишечной палочки эта активность выше. Со средней концентрацией лизоцима (4,0-6,0 мкг/мл) АЛА проявили штаммы гемолитичеких E.coli в 2,7 раз чаще, чем типичные, при этом, высокая активность была выявлена у штаммов всех подгрупп гемолитических эшерихии.
Достоверной разницы при изучении частоты АЛА с концентрацией лизоцима 1,0-
6,0 мкг/мл между гемолитическими и типичными эшерихиями не обнаружено. Из подгрупп E.coli Hly+ АЛА достоверно чаще отмечается среди эшерихии с выраженной ферментативной активностью, с наименьшей -среди лактозонегативных. АЛА более 6 мкг/мл выявлена только у гемолитических E.coli (p<0,001) и с наибольшей частотой в подгруппе лактозонегативных E.coli Hly+, с наименьшей
- в подгруппе с выраженной ферментативной активностью. С повышением концентрации лизоцима отмечается снижение частоты
встречаемости признака у типичных и все же выше, чем у типичных E.coli и
гемолитических эшерихии, но частота выявляется с достоверной разницей чаще у
всречаемости АЛА среди штаммов E.coli Hly+ лактозонегативных штаммов.
Таблица 1
Частота встречаемости АЛА разной концентрации среди гемолитических и типичных эшерихий
№ Группы Е.соИ Всего штамм ов Число штаммов с АЛА Способность расщеплять лизоцим в среде (мкг/мл)
1,0-3,0 4,0-6,0 1,0-6,0 более 6,0 более 10,0 достовер ность
1. Типичная Е.соИ 23 15 13 2 15 0 0 1-3,0 -4-6,0: р<0,001
65,2±1,7 86,7±8,7 13,3±8,7 65,2±1,7
2. Г емолитические Е.соИ 84 67 23 24 47 20 9
79,8±4,4 27,3±5,9 35,8±5,9 70,1±5,6 29,8±5,6 10,7±8,3
достоверность 1=3,1 п>30 р<0,01 1=4,8 п>30 р<0,001 1=2,14 п>30 р<0,05 1=0,8 п>30 Р<0,5 1=5,3 п>30 р<0,001
подгруппы Е.соН Н1у+
I с выраженной ферментативной активностью 28 23 10 9 19 4 2 АЛА общая 1-1: 1=2,25 п>30 р<0,05 АЛА> 6 мкг/мл 1-П: 1=0,94 п>30 р>0,2 АЛА> 6 мкг/мл 1-Ш: 1=2,44 п>30 р<0,02 АЛА> 6 мкг/мл П-Ш: р>0,05
82,1±7,3 43,5±10,4 1-1: 1=3,18 п>30 р<0,01 39,1±10,2 1-3,0 - 4-6,0: Р>0,5 82,6±7,0 17,4±7,0 8,7±6,0 1-П: р>0,1 П-Ш: р=0,2
II со слабовыраженной ферментативной активностью 38 29 11 10 21 8 3 АЛА общая 1-П: 1=1,56 п>30 р>0,1
76,3±6,9 37,9±9,0 1-1: р<0,01 34,5±8,8 1-3,0 - 4-6,0: Р>0,5 72,4±8,3 27,6±8,3 10,3±5,6
Ш лактозонегативные 18 15 2 5 7 8 4 АЛА общая 1-Ш: 1=2,0 п>30 р<0,05
83,3±8,8 13,3±8,7 1-1: р<0,01 33,3±12,1 1-3,0 -4-6,0: р>0,1 46,7±12,9 53,3±12,9 23,7±11,5
1. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург, 1996. С. 340.
2. Бухарин О.В. Проблемы персистенции патогенов в инфектологии // Микробиология. 2006. № 4. С. 4-8.
3. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М., 1999. С. 88-89; С. 341.
4. Микробиология. 1997. № 4. С. 87-88.
5. Валышев А.В., Зыкова Л.С, Коннова М.Е. // Микробиология. 1994. Приложение. С. 71-74.
6. Гильмутдинова Ф.Г., Третьяков А.А., Валышев А.В. // Актуальные вопросы хирургии: сб. науч. работ факультетской хирургической клиники. Челябинск, 1996. С. 36-40.
7. Зыкова Л.С. Челпаченко О.Е. // Там же. Челябинск, 1996. С. 74-76.
8. Прозоровский С.В., Бухарин О.В. // Микробиология. 1994. Приложение. С. 3-4.
9. Швецов С.А. Клиническое значение персистентных характеристик аэробной условнопатогенной микрофлоры у больных холециститом: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Пермь, 1994.
10. Ott M., Hacker J. Microb. Ecol. Health Dis. 1992. Vol 5.-Р. 7.
