CC BY
318
СО
Антигены и антитела к тромбоцитам (обзор литературы)
Н.В. Минеева, И.И. Кробинец, М.Н. Блинов, С.И. Капустин
ФГБУ«Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» ФМБА России, Санкт-Петербург
Контакты: Ирина Ивановна Кробинец [email protected]
В статье представлен обзор литературы о строении антигенов тромбоцитов, показана роль тромбоцитарных антител в патогенезе различных клинических состояний, дана характеристика современных методов выявления антител.
Ключевые слова: тромбоциты, антигены, аллоантитела, аутоантитела, тромбоцитопения новорожденного, аллоиммунизация, HLA, трансфузии тромбоцитов, рефрактерность
Platelet antigens and antibodies. Literature review N.V. Mineeva, I.I. Krobinets, M.N. Blinov, S.I. Kapustin
Russian Research Institution of Hematology and Transfusiology, Federal Medical and Biological Agency, Saint Petersburg
Platelet antigens structure, role of platelet antibodies in the pathogenesis of various clinical conditions, characteristic of modern antibodies detection methods are presented in this article.
Key words: platelets, antigens, alloantibodies, autoantibodies, neonatal thrombocytopenia, alloimmunization, HLA, platelet transfusion, refractory
Трансфузии тромбоцитов являются эффективным методом лечения многих заболеваний. Однако в некоторых случаях они не только не приводят к ожидаемому клиническому эффекту, но и сопровождаются осложнениями негемолитического типа. Все это послужило стимулом к изучению антигенов тромбоцитов и причин возможной аллоиммунизации.
Тромбоциты являются носителями антигенов различных аллогенных систем. Наиболее значимыми являются антигены собственно тромбоцитарные, главного комплекса гистосовместимости, а также эритроцитов. На мембране тромбоцитов присутствуют антигены системы АВ0, Левис, I, i, P, но отсутствуют антигены систем Резус, Даффи, Келл, Кидд и Лютеран [1—6].
Антигены главного комплекса гистосовместимо-сти — HLA (Human Leukocyte Antigens) — экспресси-рованы уже на мегакариоцитах и крепко связаны с мембраной тромбоцитов [7]. Существует другая точка зрения, согласно которой присутствие антигенов HLA является результатом их сорбции из плазмы. При этом количество HLA-антигенов, присутствующих в плазме, не коррелирует с количеством таковых на тромбоцитах, так как адсорбируется лишь их малая часть [8]. Тромбоциты несут на своей поверхности только антигены HLA класса I. Среди них преобладают HLA А и HLA В. HLA С на тромбоцитах присутствуют в небольшом количестве. Вариации HLA-экспрессии могут иметь клиническое значение при трансфузиях донорских тромбоцитов с низким содержанием антигенных детерминант способных нормально выживать у больного с HLA-антителами [2, 9]. Количество антигенных детерминант зависит от генотипа: в гомози-
готном состоянии на одном тромбоците содержится от 34 000 до 43 000 молекул НРА-1а, в гетерозиготном — от 19 000 до 24 000 молекул. Если сравнить количество HLA-детерминант (например, Н^-А2 присутствует в количестве от 4000 до 10 000 детерминант на тромбоцит), расположенных на том же гликопротеине, можно заметить, что их экспрессировано значительно меньше, чем НРА-детерминант. Эти данные позволяют предположить, что в некоторых случаях антитела к тромбоцитам могут играть более существенную роль в разрушении тромбоцитов, чем анти-Н^-антитела [2, 8].
Номенклатура и молекулярная генетика аллоантигенов тромбоцитов
Тромбоцитам свойственно наличие своих собственных антигенов. Более 20 антигенов были описаны как тромбоцит-специфичные. До 1990 г. не существовало единых подходов к обозначению различных вариантов антигенов тромбоцитов и многие исследователи использовали для обозначения одних и тех же антигенов различные названия, что приводило к путанице и затрудняло сопоставление результатов типирования в различных лабораториях. Современные иммуногене-тические методы позволили изучить молекулярную структуру как самой белковой молекулы, так и гена, кодирующего ее синтез. Гены системы НРА локализованы на длинном плече 5, 17 и 22-й хромосом. Наличие аллельных вариантов обусловлено единичным нуклео-тидным полиморфизмом (заменой одного нуклеотида в аллель-специфичных участках). В 1990 г. была создана международная номенклатура тромбоцит-специфич-
Таблица 1. Международная номенклатура HPA
Антиген Другие названия Частота фенотипа*,% Локализация на гликопро-теине (GP) мембраны Нуклеотидная замена в гене Аминокислотная замена в белке
HPA-1a HPA-1b Zwa,PIA1 Zwb,PIA2 97,9 28,8 GPIIIa J196 C196 Лейцин33 Пролин33
HPA-2a HPA-2b Kob Koa,Siba > 99,9 13,2 GPIba C524 T524 Треонин145 Метионин145
HPA-3a HPA-3b Baka,Leka Bakb 80,95 69,8 GPIIb T2622 G2622 Изолейцин843 Серин843
HPA-4a HPA-4b Yukb,Pena Yuka,Penb > 99,9 < 0,1 GPIIIa G526 A526 Аргинин143 Глутамин143
HPA-5a HPA-5b Brb,Zavb Bra,Zava 99,0 19,7 GPIa G1648 A1648 Глутаминовая кислота505 Лизин505
HPA-6bw Caa,Tua 0,7 GPIIIa G1564 A1564 Аргинин489 Глутамин489
HPA-7bw Moa 0,2 GPIIIa C1267 G1267 Пролин407 Аланин407
HPA-8bw Sra < 0,01 GPIIIa J2004 C2004 Аргинин636 Цистеин636
HPA-9bw Maxa 0,6 GPIIb G2603 A2603 Валин837 Метионин837
HPA-10bw Laa < 1,6 GPIIIa G281 A281 Аргинин62 Глутамин62
HPA-11bw Groa < 0,25 GPIIIa G1996 A1996 Аргинин633 Гистидин633
HPA-12bw Iya 0,4 GPIbß G141 A141 Глицин15 Глутаминовая кислота15
HPA-13bw Sita 0,25 GPIa C2531 T2531 Треонин799 Метионин799
HPA-14bw Oea < 0,17 GPIIIa A AAG1929-1931 А Лизин611
HPA-15a HPA-15b Govb Gova 74 81 CD109 C2108 A2108 Серин703 Тирозин703
HPA-16bw Duva < 1 GPIIIa C517 T517 Треонин140 Изолейцин140
HPA-17bw Vaa < 0,4 GPIIIa C622 T622 Треонин195 Метионин195
HPA-18bw Caba < 1 GPIa G2235 T2235 Глутамин716 Гистидин716
HPA-19bw Sta < 1 GPIIIa A487 C487 Лизин137 Глутамин137
HPA-20bw Kno < 1 GPIIb C1949 T1949 Треонин619 Метионин619
HPA-21bw Nos < 1 GPIIa G1960 A1960 Глутаминовая кислота628 Лизин628
со
о
ej
СО
* Частота встречаемости среди белых европейцев.
ных аллоантигенов — HPA (Human Platelet Antigens). Согласно этой номенклатуре каждый локус нумеруется последовательно с буквенным обозначением аллеля, один из которых («а») встречается значительно чаще второго («b»). В номенклатуру были включены только те антигены, к которым были выявлены антитела. Если антитела были выявлены только к одному аллелю, то к названию антигена добавляется «w» (HPA-10bw). К настоящему времени хорошо изучены гены 6 основ-
ных локусов (НРА1—5, 15) и несколько редко встречающихся генов, кодирующих продукцию антигенов (табл. 1) [2-5].
Антигены системы НРА локализованы на глико-протеиновых ^Р) комплексах как представлено на рисунке [3, 4]. GP-мембраны относятся к семейству ин-тегринов - рецепторов, имеющих сходную структуру и ответственных за взаимодействие между клетками, а также между клетками и белками [1-6].
вр!а вр!!а вРУ! вр!!Ь врШа СЭ109 вР!Ьа вРУ
Локализация антигенов системы HPA на GP мембраны тромбоцита [3, 4]
GP-комплексы являются ключевыми для гемостаза и отвечают за пошаговый процесс прикрепления тромбоцита к поврежденной сосудистой стенке. Комплекс GPIb/IX/V — главный рецептор для фактора Виллебранда, обеспечивающий прикрепление тромбоцитов к поврежденному субэндотелию. Комплекс GPIa/IIa, являясь коллагеновым рецептором, поддерживает связь тромбоцита с коллагеном, тогда как рецептор GPVI проводит сигнал через мембрану внутрь клетки для последующей активации тромбоцита, в результате этого тромбоциты связываются между собой с помощью фибриногена посредством активированных рецепторов GP ПЬ/Ша. Функция CD109 изучена недостаточно [10].
Применение молекулярно-генетических методов позволило изучить частоту аллелей среди различных расовых и этнических групп населения. В популяции белых европейцев частота аллелей большинства НРА-систем отклоняется в сторону «а» аллеля, а гомозиготы по «Ь» составляют около 0—15 %. Исследования частоты встречаемости аллоантигенов тромбоцитов в разных зарубежных популяциях указывают на значительные различия в распространенности этих антигенов среди жителей разных стран. Например, НРА-1 полиморфизм почти отсутствует в популяциях Дальнего Востока, в то время как НРА-4 полиморфизм практически отсутствует у белых европейцев, но присутствует в дальневосточной популяции. Данные о частоте встречаемости НРА в российской популяции ограничены единичными исследованиями. Нами было генотипировано 402 донора г. Санкт-Петербурга. Полученные данные представлены в табл. 2 в сравнении с данными европейской популяции [11].
По нашим данным, у доноров крови г. Санкт-Петербурга гены локусов НРА-1, 2, 3, 5 являются полиморфными, а гены локуса НРА-4 не полиморфны.
Таблица 2. Распределение НРА-генотипов среди белых европейцев и доноров г. Санкт-Петербурга
Генотип Частота генотипов, %
J.G. McFarland, 1993 Bontadini et ;Н., 2000 Собственные данные
НРА-1а/1а 72 78 74,7
НРА-1а/1Ь 26 16 21,9
НРА-1Ь/1Ь 2 6 3,4
НРА-2а/2а 85 76 83,3
НРА-2а/2Ь 14 22 15,5
НРА-2Ь/2Ь 1 2 1,7
НРА-3а/3а 37 53 38,35
НРА-3а/3Ь 48 38 50,7
НРА-3Ь/3Ь 15 9 14,95
НРА-4а/4а 99 нет данных 100
НРА-4а/4Ь < 0,1 нет данных 0
НРА-4Ь/4Ь < 0,1 нет данных 0
НРА-5а/5а 80 58,5 83,8
НРА-5а/5Ь 19 40 16,2
НРА-5Ь/5Ь 1 1,5 0
I
Поэтому, при подозрении на НРА-аллоиммунизацию важно учитывать этническую принадлежность пациентов.
Антитела и их клиническое значение
Гемотрансфузии, беременности и прием лекарственных препаратов стимулируют иммунный ответ
и могут привести к выработке антител к тромбоцитам. Независимо от специфичности индуцированные антитела могут разрушать тромбоциты, что обусловливает снижение их числа в крови. Антитела, вырабатываемые к тромбоцитам, разделяют на аутоантитела, аллоантитела и лекарственно-зависимые антитела [2—5].
В основе патогенеза всех аутоиммунных заболеваний лежит срыв толерантности к собственным антигенам (аутотолерантность). В результате этого возникает иммунный ответ против собственных антигенов или тканей, так как иммунная система продуцирует огромное разнообразие антиген-специфических рецепторов, в том числе способных реагировать с ауто-антигенами. Тромбоцитарные аутоантитела направлены против GP-тромбоцитов [12]. По данным литературы, большинство антител связываются с ре-цепторными GP-комплексами ПЬ/Ша и 1Ь/1Х. Большая часть аутоантител принадлежит к классу IgG, меньшая часть — к ^М и IgА. Выработка аутоантител к тромбоцитам может приводить к развитию аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, тромбоци-топении новорожденных (опосредованной наличием аутоиммунных антител у матери) и рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов (при наличии аутоантител у реципиента) [13].
Сенсибилизация аллоантигенами в результате беременностей или гемотрансфузий может приводить к выработке аллоантител. По специфичности аллоантитела к тромбоцитам подразделяют на 3 группы: АВО-антитела, HLA-антитела и антитела к тромбоцит-специфичным антигенам [1—5].
Появление у реципиента анти-НРА и анти-Н^-антител может являться причиной развития иммунологических реакций негемолитического типа и привести к полному отсутствию клинического эффекта от переливания тромбоцитов. Иногда после трансфузий тромбоцитов доноров, несовместимых с реципиентом как по НРА, так и Н^, в организме больного происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляющиеся развитием аутоиммунной тромбоцитопении и приводящие к тяжелым геморрагическим проявлениям [13].
Установлено, что Н^-иммунизация развивается только в ответ на введение несовместимых лейкоцитов. Трансфузии тромбоцитов сами по себе не могут вызвать выработку HLA-антител, так как они не содержат антигенов II класса гистосовместимости, необходимых для Т-хелперной активации В-клеток (только В-лимфоциты, активированные Т-клетками и моноцитами крови, могут давать необходимый стимул для продукции антител) [12]. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов возникает чаще у реципиентов, имеющих в анамнезе многократные трансфузии цельной крови и компонентов, так как с каждой последующей трансфузией повышается вероятность получения антигена, отсутствующего у реципиента, и возникновения иммунного ответа.
Клиническими последствиями аллоиммунизации могут быть: рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов, посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура (ПТП) и аллоиммунная тромбоцитопения плода и новорожденного (АИТПН) [1—5].
Рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов
Осложнением трансфузий тромбоцитов является состояние рефрактерности, определяемое как отсутствие существенного увеличения их количества у реципиента в ответ на переливание тромбоцитного концентрата. Развитие рефрактерности может быть обусловлено иммунными или неиммунными причинами. Однако, у пациентов, получающих множественные трансфузии, этиология рефрактерности может быть многофакторной. Неиммунными причинами развития рефрактерности являются спленоме-галия, ДВС-синдром, прием лекарственных препаратов (например, амфотерицин В), тромбоз вен печени. Иммунная тромбоцитарная рефрактерность связана с наличием антител у реципиента [1—5, 14]. Главной причиной иммунной рефрактерности у пациентов с множественными трансфузиями является наличие Н^-А и/или HLA-В-антител. У 3—9 % рефрактерных пациентов встречаются НРА-антитела (анти-НРА-1а, 1Ь, 3а, 2Ь и 15Ь-антитела) в сочетании с HLA-антителами [5]. HLA-антитела преимущественно встречаются у женщин, имеющих в анамнезе беременности, и у пациентов с множественными трансфузиями. Развитие HLA-сенсибилизации при трансфузиях обусловлено примесью лимфоцитов, содержащихся в большинстве гемокомпонентов [14]. Пороговой величиной, так называемой «дозой иммуно-генной нагрузки», является 1 х 106 клеток на трансфузию [15]. Однако описаны случаи отсутствия рефрактерности у некоторых пациентов с Н^-анти-телами после трансфузии случайно отобранных донорских тромбоцитов. Этот феномен может наблюдаться при трансфузии тромбоцитов со слабой экспрессией антигенов Н^ локуса В. Например, может быть «широкая» специфичность экспрессии В12 и его «сплитов» — В44 и В45 на тромбоцитах и лимфоцитах [9, 14].
Высокий титр АВО-антител, тромбоцитарные ау-тоантитела и лекарственно-зависимые антитела у реципиента также могут стать причиной рефрактерно-сти. Сроки развития рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов у реципиентов зависят от количества трансфузий в анамнезе. У пациентов с множественными трансфузиями в анамнезе рефрактерность развивается в течение 10 дней, а у пациентов, в анамнезе которых трансфузий не было, рефрактерность возникает в среднем через 60 дней. Причем у больных, не имеющих в анамнезе трансфузий, развитие рефрак-терности наступало после переливания тромбоцитов и эритроцитов по объему в 2 раза превосходящему объемы, необходимые для получения рефрактерности
со
о
сч
СО
со
о
ej
СО
у больных, в анамнезе которых гемотрансфузии были [14, 16-19].
Посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура
Клинический случай тромбоцитопении, развившейся у женщины на 7-е сутки после трансфузии тромбоцитов и спонтанно разрешившейся через 3 нед, был впервые описан в 1959 г. van Loglem et al. Спустя 2 года подобный случай описали Shulman et al. и ввели термин «посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура». ПТП развивается у сенсибилизированого реципиента с анти-НРА-антителами, которому переливают тромбоциты донора с антигенами, к которым имеются антитела. Данное осложнение развивается у гомозиготных по НРА реципиентов и может ассоциироваться с тромбоцитарными антителами одной или нескольких специфичностей [14]. ПТП чаще встречается у женщин, имеющих в анамнезе беременности, развивается на 7-10-е сутки после трансфузии тромбоцитов и сопровождается тромбоцитопенией. Заболевание начинается быстро и характеризуется падением количества тромбоцитов менее 10 х 109. Средняя и тяжелая степень течения сопровождается кровотечением из слизистых оболочек пищеварительного и мочевого тракта. Развитие данного осложнения связано с наличием определенной аллели HLA II клас-са-DRB3*01:01 [4]. Специфичность антител, вызывающих данное осложнение, установлена только в нескольких исследованиях зарубежных авторов. Чаще всего причиной ПТП являются антитела анти-НРА-1а (85 % случаев), 2b (5 %), 3а (7 %) [5].
Аллоиммунная тромбоцитопения плода и новорожденного
АИТПН развивается в результате разрушения тромбоцитов ребенка антителами матери, направленными против специфических HPA. Частота встречаемости данной патологии составляет 1 случай на 1200 родов в европейской популяции и 1 на 500-700 родов в Японии [4, 5]. Патогенез данного заболевания аналогичен патогенезу гемолитической болезни новорожденных, обусловленной несовместимостью матери и плода по антигену D системы Резус. В отличие от несовместимости по D-антигену, АИТПН может развиться уже при первой беременности [20-24]. Выработка антител у матери при беременности происходит к антигенам тромбоцитов плода, унаследованным от отца и отсутствующим у матери. Антитела матери, принадлежащие к IgG, проникая через плацентарный барьер и адсорбируясь на антигенах тромбоцитов плода, вызывают их деструкцию макрофагами [20]. Большинство антигенов тромбоцитов плода экспресси-руются уже к 18-й неделе беременности, поэтому деструкция тромбоцитов может наблюдаться на ранних сроках. После рождения тяжесть проявления тромбоцитопении зависит от скорости удаления анти-тромбоцитарных антител матери из кровотока плода.
Обычно количество тромбоцитов плода возвращается к норме в течение 1—3 нед после родов. Заболевание часто является кратковременным, протекающим без последствий для здоровья ребенка. Но встречаются и тяжелые формы с развитием внутричерепных кровоизлияний и, как следствие, нейрологических нарушений или смерти в период тромбоцитопении. Согласно данным литературы, половина случаев внутричерепных кровоизлияний, ассоциированных с аллоиммун-ной тромбоцитопенией, происходит внутриутробно [20—24]. В европейской популяции 2—2,5 % беременных женщин не имеют антигена HPA-1a, и большинство из них ожидают детей HPA-1a положительных, так как 97,5 % людей имеют этот антиген. Однако только 6—12 % этих женщин вырабатывают HPA-1a-антитела. Выработка антител связана со специфичностью антигена HLA-DR. Так, наличие у матери аллели HLA-DRB3*01:01 стимулирует выработку анти-НРА-1а-антител, а наличие HLA-DRB1*13 и HLA-DRB1*14 — анти-НРА-5Ь-антител [22, 25]. Среди белого населения 80—90 % случаев АИТПН обусловлены анти-НРА-1а-антителами, 10—15 % — анти-НРА-5Ь-антителами и малая часть — анти-НРА-3а-антителами. В литературе также описаны случаи тромбоцитопе-нии, вызванной антителами другой специфичности [5, 26-30].
Подбор тромбоцитов для трансфузии
В клинической медицине широко применяются гемотрансфузии крови и ее компонентов, в частности тромбоцитных концентратов. В соответствии с требованиями по переливанию крови в нашей стране и за рубежом тромбоциты пары донор - реципиент должны быть идентичны по антигенам систем AB0 и Rh. Однако, при ограниченном количестве доноров и большом числе нуждающихся реципиентов, допускаются трансфузии тромбоцитов группы крови 0 реципиентам других групп. В этом случае существует опасность осложнения гемолитического типа из-за высокого титра АВ0-антител у донора. В литературе описаны подобные случаи и установлено, что риск развития посттрансфузионных осложнений гемолитического типа выше у реципиентов с множественными трансфузиями тромбоцитов и особенно у детей. Оптимальным способом лечения тромбоцитопений новорожденных являются трансфузии тромбоцитов идентичных по АВ0 и Rh, с низким титром естественных антител и совместимых по HPA- и HLA-антигенам [31, 32].
В связи с объективной трудностью исследования антигенов тромбоцитов и лейкоцитов, подбор совместимых по антигенам тромбоцитов и лейкоцитов пар донор — реципиент не проводится. Обычно однократная трансфузия тромбоконцентрата, полученного афе-резом, не требует подбора по системе HLA и HPA. Аллоиммунизированные пациенты с множественными трансфузиями и рефрактерностью к тромбоцитам
в анамнезе требуют комплексного подхода к подбору гемокомпонента, предусматривающего совместимость по антигенам HLA I класса локусов А и В или постановку перекрестной лимфоцитотоксической пробы на совместимость. Число подходящих доноров обеспечивается при наличии регистра типированных доноров в 2—5 тыс. человек. Однако было замечено, что около 30 % трансфузий тромбоцитов, подобранных в лимфоцитотоксическом тесте, являются неэффективными. Трансфузии тромбоцитов, совместимых по антигенам системы HLA, у 20—25 % больных приводили к выработке антител против специфических антигенов тромбоцитов [33—35].
Все перечисленное привело к применению за рубежом, кроме HLA-перекрестной пробы, перекрестной пробы с тромбоцитами донора, а также к типирова-нию антигенов тромбоцитов при подборе совместимых гемокомпонентов аллоиммунизированным реципиентам [9].
Учитывая определенные трудности типирования тромбоцитарных антигенов серологическими методами, в последние годы все чаще с этой целью применяются молекулярно-генетические методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). С учетом имеющихся в настоящее время данных о характере и месторасположении единичных нуклеотидных замен, обусловливающих полиморфизм НРА, молекулярно-генетические методы типирования антигенов тромбоцитов сводятся к детекции этих замен в структуре ДНК соответствующих генов [36].
Молекулярно-генетические методы детекции антигенов тромбоцитов
Для детекции НРА к настоящему времени предложено несколько методов, основанных на технологии ПЦР: полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ), ПЦР с аллель-специфическими праймерами (ПЦР-АСП) и ПЦР-гибридизация с аллель-специфичными олигонуклеотидами (АСО) [37—39].
Коротко остановимся на каждом из них.
ПЦР-ПДРФ-метод основан на том, что в результате мутации (нуклеотидной замены) в ДНК появляются новые (или утрачиваются существовавшие) места (сайты) узнавания для специфических рестриктаз — ферментов, способных разрезать ДНК в строго определяемых последовательностями нуклеотидов участках. Таким образом, обработка амплифицированного в ПЦР исследуемого участка ДНК соответствующим образом подобранной рестриктазой и последующее разделение продуктов рестрикции (чаще всего электрофорезом в агарозе или полиакриламидном геле) позволяет по картине ПДРФ выявить искомую мутацию. Данный методический подход достаточно широко используется для детекции единичных нуклеотид-ных замен, в том числе и для типирования НРА.
ПЦР-АСП метод основан на использовании в ПЦР так называемых аллель (или сиквенс)-специ-
фических праймеров (АСП), комплементарных или нормальному, или мутированному аллелю. Кроме того, в реакции используется и так называемый «общий» праймер, комплементарный участку ДНК как нормального, так и мутированного аллеля.
ПЦР при типировании НРА проводится в 2 пробах для каждого антигена, которые отличаются друг от друга используемыми АСП. Продукт ПЦР — ампли-фикат — выявляется в той пробе, где тестируемая ДНК содержит участок, комплементарный одному из двух АСП. Обнаружение амплификата в обеих пробах свидетельствует о гетерозиготном носительстве исследуемого аллеля. Этот метод был впервые использован при типировании антигенов системы HLA, а затем и для генотипирования тромбоцитов.
В последние годы в научно-исследовательских лабораториях широко внедрено типирование антигенов, основанное на секвенировании — SBT (sequence-based typing). Секвенирование представляет собой определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК путем получения серии комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. Этот метод позволяет получить информацию о полной последовательности ДНК (новых аллелях и мутациях). Главными недостатками технологии SBT являются:
— трудоемкость (сложная и длительная процедура подготовки ДНК для секвенирования);
— низкая производительность;
— высокая стоимость оборудования и реагентов и, как следствие, высокая себестоимость типирования одного образца;
— отсутствие у компаний-производителей секве-наторов специальных реагентов, оборудования и программного обеспечения для серологического типиро-вания и для определения антител к антигенам HPA и HLA. Поэтому данный метод вряд ли найдет широкое применение в клинических лабораториях в ближайшее время.
Широкое использование тест-систем, основанных на описанных методах ПЦР, для типирования тромбоцитов в повседневной практике лабораторий затруднено необходимостью проведения электрофореза для оценки конечного результата реакции. Поэтому в настоящее время разработаны тест-системы для ПЦР в реальном времени, позволяющие значительно упростить процесс исследования [40—44].
Выявление антител к тромбоцитам
Проведенный нами анализ данных литературы о существующих методах выявления антитромбоци-тарных антител, показал, что наиболее эффективными являются методы иммуноферментного анализа и им-мунофлюоресцентные [45—47]. Однако проведение тестов с использованием указанных методов требует наличия дорогостоящего оборудования или/и реактивов, что ограничивает их применение. В связи с этим, за рубежом был разработан твердофазный антигло-
«ч
о
ej
СО
со
о
сч
СО
булиновый тест, принцип которого заключается в адсорбции донорских тромбоцитов, предварительно сенсибилизированных исследуемой сывороткой реципиента, на поверхность плашки и последующей детекции антител после добавления эритроцитов, нагруженных анти-IgG-антителами. При наличии в исследуемой сыворотке антитромбоцитарных антител, анти-IgG взаимодействует с ними, что приводит к равномерному распределению эритроцитов по плашке. При отсутствии антитромбоцитарных антител эритроциты образуют осадок в виде точки. Многими авторами была показана высокая чувствительность твердофазного метода для определения ауто- и аллоантител [45].
«Золотым стандартом» для идентификации тромбоцит-специфических антител признан метод иммобилизации тромбоцитарных антигенов специфическими моноклональными антителами (МА1РА) с использованием моноклональных мышиных антител, специфичных к гликопротеинам тромбоцитов. Преимущество МА1РА состоит в том, что антитела (человека и мышиные) присоединяются к соответствующему антигену мембраны тромбоцита, что позволяет сократить ложноположительные реакции. Метод позволяет не только выявлять антитела, но и проводить фенотипирование редко встречающихся антигенов (например, НРА-5Ь/5Ь). Однако метод имеет и свои недостатки. Выявление антител основано на формировании трехмолекулярного соединения, связывающего мышиные и человеческие антитела с мембраной тромбоцита, на которой локализованы соответствующие эпитопы. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться вследствие конкуренции между человеческими и мышиными антителами за присоединение к одному и тому же эпитопу, что затрудняет диагностику иммунных тромбоцитопений. Кроме того, метод очень трудоемкий и не подходит для скрининга [48, 49].
Другим методом, обладающим высокой чувствительностью и специфичностью, является метод проточной цитофлуориметрии. Метод позволяет выявлять антитромбоцитарные антитела разных классов иммуноглобулинов (^М, IgG и ^А) [34]. По данным литературы, проточная цитометрия является первым шагом для выявления антител. Преимуществами служат высокая скорость, позволяющая анализировать большие клеточные объемы, и возможность выполнения сложных одновременных измерений нескольких параметров каждой клетки в одной суспензии. Все это позволяет использовать метод для скринин-говых исследований [50—51]. На втором этапе применяется метод МА1РА, позволяющий определять специфичность антител. Такой алгоритм дает возможность проводить исследования антител более эффективно [48, 49].
Определенную трудность в стандартизацию методов выявления алло- и аутоантител к тромбоцитам вносит отсутствие референтных образцов с установленной специфичностью (обычно такие образцы используются для постановки положительного контроля для подтверждения правильности исследования антител по аналогии с использованием моноклональных антител к антигенам эритроцитов при их типирова-нии). В последние годы было получено несколько образцов моноклональных антител, имеющих специфичность к антигенам тромбоцитов, в частности анти-НРА-1а, 3Ь. Однако эти немногие образцы зачастую получены к синтетическому пептиду, содержащему НРА-1а, и не взаимодействуют с указанным антигеном, присутствующим на интактных тромбоцитах, поэтому могут использоваться только в иммунофер-ментном методе [52].
С целью стандартизации методов выявления антител к антигенам тромбоцитов периодически проводятся многоцентровые исследования. На 15-м рабочем совещании КВТ (Международного общества переливания крови) анализировали результаты выявления аутоантител в образцах сыворотки, полученных от 2 пациентов с иммунной тромбоцитопенией, а также оценивали чувствительность и специфичность выявления аллоантител анти-НРА-1а и анти-НРА-3 и методы НРА-генотипирования с помощью стандартных протоколов. Результаты тестирования образцов сывороток с антителами, проведенного 30 лабораториями-участниками, были неоднозначны. Выявленные специфичности аутоантител разнились между лабораториями, были найдены отсутствующие специфичности и в одном из образцов не получен общий результат. С выявлением анти-НРА-1а-анти-тел и генотипированием НРА успешно справились все лаборатории; трудно диагностируемые анти-НРА-3а и анти-НРА-3Ь не были определены во многих лабораториях. На основании проведенного анализа сделан вывод о том, что протоколы и методы исследования антител требуют доработки [49]. Аналогичные данные получили R. Fontao-Wende1 et а1. при исследовании частоты сенсибилизации к антигенам тромбоцитов у пациентов многопрофильного стационара до и после трансфузий методами флуоресценции, МА1РА, проточной цитофлуориметрии и в лимфоцитотоксическом тесте. Анализ данных показал, что не было 100 % совпадения результатов тестирования разными методами. Только в 8,1 % образцов антитела были выявлены всеми 4 методами [53].
Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что методы выявления антител к антигенам тромбоцитов нуждаются в дальнейшем изучении, совершенствовании и стандартизации.
ЛИТЕРАТУРА
со
1. Norton A., Allen D., Murphy M. Review: Platelet alloantigen and antibodies and their clinical significance. Immunohematology 2004;20(2):89—102.
2. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина Л.Л. Тромбоциты
и антитромбоцитарные антитела. М.: Монолит, 2003. 128 с.
3. Transfusion and transplantation science (Fundamentals of biomedical science). Editor R. Knight. Oxford, 2012. 304 p.
4. Murphy M., Pamphilon D. Practical Transfusion Medicine. Wiley-Blackwell, 2013. 549 p.
5. Green A., Hoffbrand A., Catovsky D. et al. Postgraduate Haematology. Wiley-Blackwell, 2011. 1076 p.
6. Landau M., Rosenberg N. Molecular insight into human platelet antigens: structural and evolutionary conservation analyses offer new perspective to immunogenic disorders. Transfusion 2011;51:558-69.
7. Gouttefangeas C., Diehl M., Keilholz W. Thrombocyte HLA molecules retain nonrenewable endogenous peptides of megakaryocyte lineage and do not stimulate direct allocytotoxity in vitro. Blood 2000;95(10):3168-75.
8. Kao K.J., Scornik J.C., McQueen C.F. Evalution of individual spesificities
of class I HLA on platelet by a new developed monoclonal antibody. Hum Immunology 1990;27(4):285-97.
9. Schiffer C.A. Management of alloimmunized, refractory patients in need of platelet transfusions. "Vbx Sang 1997;73:197-8.
10. Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Сергеевич Д.С. и др. Мембранные рецепторы тромбоцитов: функции и полиморфизм. Вестник ВОГиС 2006;10(3):553-64.
11. Bontadibi A., Tazzari P.L., Manfroi S. et al. Human-platelet-antigen and neutrophil-antigen gene frequency in the Italian population determined by polymerase chain reaction with sequence specific primers. Haematologica 2000;85:430.
12. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д.Б.
и др. Иммунология. М.: Логосфера, 2007. 555 с.
13. Chong B.H. Diagnosis, treatment and pathophysiology of autoimmune trombocytopenias. Crit Rev Oncol Hematol 1995;20(3):271-96.
14. Kickler T. The challenge of platelet alloimmunization: management and prevention. Transfus med rev 1990; 4(4 Suppl. 1):8—18.
15. Мельникова В.Н., Кирьянов Г.Ю., Филиппова О.И. Карантинизация лейкофильтрованных донорских эритроцитов - важное звено в обеспечении инфекционной и иммунологической безопасности гемотрансфузий. Трансфузиол 2007;8(1—2):63.
16. Tasaku T., Fujiik K., Gotoh K. et.al. Significance of platelet-reactive antibody screening for patients facing frequent platelet transfusions. Immunohematology 2002;18(4):104-8.
17. Allen D., Samon J., Benjamin S. et al. Survey of the use and clinical effectiveness of HPA-1a/5b-negative platelet concentrates in proven or suspected platelet alloimmunization. Transfusion Med 2004;14:409-17.
18. Lin S., Lo S., Lib D. Anti-platelet antibodies in multiply transfused patients. Vox Sang 2002;83(2):242.
19. Головкина Л.Л., Зотиков Е.А. Алло-иммунизация к антигенам систем НРА и HLA у гематологических больных
с множественными трансфузиями компонентов крови. Новое в трансфузи-ологии 2003;34:12-22.
20. Масчан А.А., Румянцев А.Г. Иммунно-опосредованные тромбоцитопении новорожденных: дифференциальный диагноз и принципы терапии. Вопр гематол/онкол и иммуно-патол в педиатрии 2010;9(3):3-7.
21. Kaplan C. Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia: a 50-year story. Immunohematol 2007;23(1):9-13.
22. Muniz-Diaz E. Diagnostic evaluation of FNAIT. ISBT Science Series 2007;2:48-55.
23. Husebekk A., Kjaer Kilie M., Kjeldsen-Kragh J. et al. Screening of anti-HPA-1a antibodies in HPA-1a-negative mothers. Science Series 2007;2:111-3.
24. Husebekk A., Skogen B., Kilie M.K. et al. Foetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT). ISBT Science Series 2011;6:261-4.
25. Loewenthal R., Rosenberg N., Kalt R. et al. Compound heterozygosity of HLA-DRB3*01:01 and HLA-DRB4*01:01 as a potential predictor of fetal neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion 2013;53:344-52.
26. Davoren A., Curtis B.R., Aster R.H. et al. Human platelet antigen-specific alloantibodies in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion 2004;44:1220-5.
27. Davonen A., Smith G., Lucas G. et al. Neonatal alloimmune thrombocytopenia due to HPA-3a antibodies: a case report. Immunohematology 2002;18(Suppl. 2): 33-6.
28. Foxcoft Z. Intrauterine death involving fetomaternal alloimmune thrombocytopenia due to HPA 5a antibodies. Vox Sang 2004;87(3):133.
29. Peterson J.A., Balthazor S.M.,
Curtis B.R. et al. Maternal alloimmunization against the rare platelet-specific antigen HPA-9b is an important cause of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion 2005;45:1487-95.
30. Marin L., Torio A., Muro M. et al. Alloimmune neonatal neutropenia and thrombocytopenia associated with maternal anti HNA-1a, HPA-3b, HLA antibodies. Pediatr/Allergy/Immunol 2005;16:279-82.
31. Shehata N., Tinmouth A., Naglie G. et al. AB0-identical versus nonidentical platelet transfusion: a systematic review. Transfusion 2009;49(11):2442-53.
32. Moolten D. Group 0 red blood cells in massive transfusion-when to pull the switch? Immunohematology 2008;24(3):116-8.
33. Allen D., Ouwehand M., Kekomaki R. et al. Interlaboratory variation in the detection of HPA-specific alloantibodies and in molecular HPA typing. Vox Sang 2007;93:316-24.
34. Bertrand G., Drame G., Martageix C. et al. Prediction of the fetal status in non-invasive management of alloimmune thrombocytopenia. Blood 2010;10:1182.
35. Nance S., Hsu S., Vassallo R. et al. Review: Platelet matching for alloimmunezed patients - room for improvement. Immunohematology 2004;20(2):80-8.
36. VeldhuisenB., van der Schoot C.E., Haas M. Blood group genotyping:from patient to high-throughput donor screening. Vox Sang 2009;97:198-206.
37. Metcalfe P., Waters A.H. HPA-1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP): a rapid and simple technique. Br J Haematol 1993;85:227-31.
38. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acid Res 1988;16:1215-8.
39. Gavanagh G., Dunn A.N., Chapman C.T. HPA genotyping by PCR sequence-specific priming (PCR-SSP): a streamlined method for rapid routine investigations. Transfusion Med1997;7:41-5.
40. Panzer S. Report on the Tenth International Platelet Genotyping and Serology Workshop on behalf of the International Society of Blood Transfusion. Vox Sang 2001;80:72-8.
41. Li R., Pei B., Li Q. Multicolor real-time polymerase chain reaction genotyping of six human platelet antigens using displacing probes. Transfusion 2007;47:1637-42.
42. Ёлов А.А., Бурылёв В.В., Минеева Н.В. и др. Типирование антигенов тромбоцитов методом ПЦР в реальном времени. Молекулярная диагностика. Сб трудов VII всерос науч.-практич. конфер с международным участием 2010;III:60—1.
43. Ёлов А.А., Лихонин А.Г. Генотипиро-вание ДНК доноров и реципиентов крови как метод обеспечения антигенной безопасности трансфузий. Трансфузиол 2009;10(1-2):33.
44. Mинеева Н.В., Ёлов А.А., Бурылёв В.В. и др. Типирование антигенов тромбоци-
ej СО
со
о
ej
СО
тов доноров и пациентов методом ПЦР в реальном времени. Трансфузиол 2011;12:62.
45. Shibata Y., Juji T., Nishizawa Y. et al. Detection of platelet antibodies by a newly developed mixed agglutination with platelets. Vox Sang 1981;41(1):25—31.
46. Nguyen X., Dugrillon A., Beck C. et al. Novel method for simultaneous analysis of specific platelet antibodies: SASPA.
Br J Haematol 2004;127(5):552—60.
47. Meyer O., Agaylan A., Bombard S. et al. Novel antigen-specific capture assay for the detection of platelet antibodies and HPA-1a phenotyping. Vox Sang 2006;91:324-30.
48. Kaplan C., Freedman J., Foxcroft Z. et al. Monoclonal platelet antigen capture assays (MAIPA) and reagents: a statement. Vox Sang 2007;93:298-9.
49. Sachs U.J., Kiefel V., Kroll H. et al. Report on the 15th International Society of Blood Transfusion platelet immunology workshop. Vox Sang 2012;103:343-52.
50. Hezard N., Simon G., Mace C. et al. Is flow cytometry accurate enough to screen platelet autoantibodies? Transfusion 2008;48:513-8.
51. Lucas G., Culliford S., Green A. et al. Recipient-derived HPA-1a antibodies: a cause of prolonged thrombocytopenia after unrelated
donor stem cell transplantation. Transfusion 2010;50:334-9.
52. Ghevaert C., Wilcox D.A., Fang J. et al. Developing recombinant HPA-la-specific antibodies with abrogated Fcgamma receptor binding for the treatment of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia. J Clin Invest 2008;118(8):2929-38.
53. Fontao-Wendel R., Silva L., Saviolo C. et al. Incidence of transfusion-induced platelet-reactive antibodies evaluated by specific assay for the detection
of human leukocyte antigen and human platelet antigen antibodies. Vox Sang 2007;93(3):241-9.
