CC BY
38
Антигенные и биологические свойства вирусов гриппа типа В, выделенных в России в 2006 - 2010 годах
А.В. Иванова ([email protected]), Д.М. Даниленко, Т.Г. Лобова, Т.М. Гудкова, В.А. Григорьева, М.Ю. Еропкин
НИИ гриппа СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Резюме
Исследована популяция вирусов гриппа В, выделенных в России за четырехлетний период. Описаны особенности выделения на двух различных системах: культуре клеток MDCK и куриных эмбрионах. Показано, что большинство вирусов гриппа В за указанный период относилось к викторианской разновидности. При этом антигенный и генетический анализ позволил зарегистрировать антигенный дрейф вирусов гриппа типа В данной группы.
Ключевые слова: вирусы гриппа типа В, выделение вирусов, антигенный анализ, антигенный дрейф
Antigenic and Biological Properties of Influenza Type B Viruses Isolated in Russia in 2006 - 2010
A.V. Ivanova ([email protected]), D.M. Danilenko, T.G. Lobova, T.M. Gudkova, V.A. Grigorieva, M.Yu. Eropkin Research Institute of Influenza, Saint-Petersburg Abstract
Comparative rate of isolation of influenza type B viruses for a four-year period was examined. Characteristical features of isolation in two model systems: MDCK cell culture and embryonated chicken eggs are described. Antigenic and genetic analysis allowed to demonstrate the antigenic drift in viruses belonging to B-victoria lineage.
Key words: influenza type B viruses, virus isolation, antigenic analysis, antigenic drift
Введение
В мире ежегодно регистрируются эпидемии гриппа. По данным Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, за последние 35 лет в России ежегодно регистрировали от 25,3 до 48,3 млн случаев гриппа и других острых заболеваний верхних дыхательных путей [5]. В последнее десятилетие вирусы гриппа В являются неотъемлемыми этиологическими агентами эпидемий в стране и составляют значительную часть выделенных вирусов гриппа. С 1988 года в циркуляции регистрируются две антигенные разновидности вирусов гриппа В: В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88.
В/Виктория/2/87-подобные изоляты доминировали в 1980-х годах, после чего преимущественное распространение в мире получили возбудители, родственные эталону В/Ямагата/16/88 [3, 4, 7, 12 - 14, 17]. После десятилетнего периода исчезновения из циркуляции первые В/Виктория/2/87-подобные вирусы (дрейф-вариант В/Гонконг/330/01) были изолированы на территории России только в феврале 2003 года [6, 8, 15, 16, 18].
В настоящее время наблюдаются социркуляция двух эволюционных ветвей и возникновение реас-сортантов между ними. Высокий процент вирусов гриппа В в составе циркулирующих в период эпидемии является следствием непрерывных антигенных изменений, наиболее характерных для молекулы гемагглютинина (НА).
В этой ситуации резко повышается значимость лабораторных исследований вирусов гриппа
для обеспечения возможности раннего распознавания этиологии эпидемии. В целях характеристики возбудителя проводят вирусологические исследования - выделение и типирование штаммов вируса гриппа, изучение свойств вирионных белков, а также влияния на них различных факторов [1]. Такие исследования имеют огромное практическое значение для непрерывного заблаговременного обновления штаммового состава гриппозных диа-гностикумов и вакцин и приведения их в соответствие с антигенной структурой циркулирующих вирусов [9].
Материалы и методы
Материал для выделения вирусов гриппа (назо-фарингеальные мазки) был получен из больниц и поликлиник Санкт-Петербурга, а также из базовых вирусологических лабораторий Федерального центра по надзору за гриппом (БВЛ).
Выделение вирусов проводили в клеточной культуре MDCK, полученной из референс-центра ВОЗ (CDC, Атланта, США), и на 10-дневных куриных эмбрионах (КЭ), поставляемых ООО «Племрепро-дуктор» [10].
Реакцию гемагглютинации (РГА) и реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) ставили по методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75%-ной взвеси человеческих эритроцитов группы крови 0 (I) или 0,5%-ной взвеси куриных эритроцитов в случае вирусов, выделенных на КЭ [10].
Животные. Для получения диагностических сывороток были использованы белые беспородные
крысы весом 300 - 400 граммов. Животные предоставлены питомником АМН РФ «Рапполово».
Сыворотки. При идентификации эпидемических изолятов использовались гипериммунные диагностические сыворотки крови крупного рогатого скота или овец, присылаемые ежегодно Референс-центром ВОЗ. Для антигенного анализа применяли гипериммунные к эпидемическим и референс-штаммам вируса гриппа крысиные сыворотки.
Результаты и обсуждение
На территории России в эпидемический сезон 2006 - 2007 годов наблюдалась одновременная циркуляция двух эволюционных ветвей. Вирусы гриппа типа В были изолированы в Астрахани, Новосибирске, Санкт-Петербурге, Воронеже, Иркутске, Твери, Хабаровске, Калининграде, Туле, Нижнем Новгороде, Ставрополе, Челябинске и Самаре. Подавляющее большинство изолятов принадлежало к викторианской разновидности данного возбудителя. Лишь в Новосибирске и Челябинске регистрировалась циркуляция вирусов только яма-гатской группы.
В лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа было изучено 95 штаммов вируса гриппа типа В - 18,45% от общего количества изолированных возбудителей этого эпидемического сезона. Следует отметить, что в сезон 2006 - 2007 годов только один вирус гриппа типа В из восьми выделенных в Санкт-Петербурге был изолирован на КЭ - В/Санкт-Петербург/18/07.
По данным РТГА, штаммы 2007 года викторианской линии были подобны референс-штамму В/Ма-лайзия/2506/04 и взаимодействовали со штаммо-специфической сывороткой до 1/2 - 1/4 гомологичного титра, а с эталоном предыдущих лет - В/Гон-конг/330/01- до 1/4 - 1/8 гомологичного титра. По результатам секвенирования, все российские изоляты викторианской ветви были подобны современному вакцинному штамму В/Малай-зия/2506/04 и отличались от эталонного штамма В/Гонконг/330/01 рядом дифференциальных замен, две из которых являются существенными. Это замены К129^ сопровождающаяся сменой заряда аминокислоты с положительного на нейтральный, и К48Е - смена заряда с положительного на отрицательный. Все современные эпидемические изоля-ты также приобрели в положении 80 лизин вместо аргинина. Подобная смена заряда аминокислоты может существенно повлиять на конфигурацию и структуру данной области молекулы НА. Отмечен и ряд штаммоспецифических замен, как, например, V87A у изолята В/Иркутск/97/07.
Вирусы ямагатской группы были близки к предыдущему вакцинному штамму В/Шанхай/361/02. Изоляты реагировали со штаммоспецифической сывороткой В/Флорида/07/04 до 1 - 1/2 гомологичного титра. По данным секвенирования, все вирусы были подобны эталонному штамму В/Фло-рида/07/04, отличающемуся рядом замен (три из
них существенны) от более раннего эталона этой ветви - В/Сычуань/379/99. Это замены, сопровождающиеся сменой заряда аминокислоты: T56D и N126D - с нейтрального на отрицательный и K166N - с отрицательного на нейтральный. В положении 75 произошла замена неполярной аминокислоты на полярную - треонина на изолейцин. Кроме того, все изоляты характеризуются заменами K48R и Т168^ Вирус В/Новосибирск/4/07 приобрел одну существенную штаммоспецифиче-скую замену, сопровождающуюся сменой размера аминокислоты: аспарагин замещается тирозином в положении 166 - ароматическим соединением с большим радикалом (эта замена характерна для референс-штаммов В/Челябинск/306/07 и В/Еги-пет/144/05), и вторую - V29A, характерную для референс-штамма В/Сычуань/379/99.
В эпидемический сезон 2007 - 2008 годов вирусы гриппа В широко циркулировали на территории России и были изолированы в Санкт-Петербурге, Калининграде, Астрахани, Туле, Москве, Вологде, Самаре, Хабаровске, Нижнем Новгороде, Екатеринбурге, Курске, Улан-Удэ, Саратове, Твери, Белгороде, Рязани, Чите и Челябинске.
Всего в лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа было изолировано 278 вирусов гриппа типа В - 40,6% от всех изолятов. Пять штаммов из 28-ми, выделенных в Санкт-Петербурге, были изолированы как на клеточной культуре MDCK, так и на развивающихся куриных эмбрионах.
Подавляющее большинство вирусов гриппа типа В изоляции 2007 - 2008 годов являются представителями ямагатской ветви этого возбудителя. По данным РТГА, вирусы гриппа В 2008 года имели антигенное сходство с референс-штаммом В/Флорида/07/04 и отличались от него при взаимодействии со штаммоспецифической сывороткой не более чем на 1/4 гомологичного титра, в отличие от антисыворотки к В/Флорида/04/06, которая взаимодействовала в РТГА лишь до 1/4 - 1/8 гомологичного титра. Секвенирование гемагглю-тинина подтвердило, что штаммы обладают заменами H40Y и V252M, характерными для В/Флорида/07/04 и В/Флорида/04/06; кроме того, все изоляты приобрели изолейцин в положении 150, аспарагиновую кислоту в положении 229 и тирозин в положении 165, что характерно для референс-штамма В/Англия/552/07. Имеется ряд штаммоспецифических замен: A19D, Т121А, Р17^, М2501, а также A146D и Т1981, характерные для эталона В/Брисбен/3/07, которые приводят к потере сайта гликозилирования. Из изолированных 278 вирусов гриппа типа В к викторианской группе принадлежали лишь два вируса - В/Мо-сква/25/08 и В/Чита/3/08, оба они были подобны референс-штамму В/Малайзия/2506/04 и характеризовались стандартным набором замен -К48Е, K80R, К129^ помимо этого, они имели ряд штаммоспецифических замен: Т121А, Е198К
Таблица 1.
Антигенный анализ вирусов гриппа, выделенных в России в 2006 - 2010 годах
Вирусы гриппа типа В Диагн. сыворотка CDC Поликлональные крысиные антисыворотки к вирусам гриппа В викторианской разновидности
В/Брисбен/ 60/08 В/Малайзия/ 2506/04 В/Калининград/ 6/05 В/СПб./ 12/06 В/Хабаровск/ 287/07 В/Астрахань/ 01/07
^320 ^320 ^320 ^640 ^640 Г320
В/Брисбен/60/08 640 320 < Н.д.* Н.д. Н.д. <
В/Малайзия/2506/04 1280 80 320 320 320 640 160
В/Калининград/6/05 640 Н.д. 160 320 640 Н.д. Н.д.
В/С.-Петербург/12/06 320 Н.д. 160 160 640 Н.д. Н.д.
В/Хабаровск/287/07 640 Н.д. 320 160 160 640 Н.д.
В/Астрахань/1/07 1280 40 80 Н.д. Н.д. Н.д. 320
В/Иркутск/78/07 1280 Н.д. 160 160 640 640 Н.д.
В/Ставрополь/1/07 640 Н.д. 80 80 160 640 Н.д.
В/Москва/25/08 1280 Н.д. 80 40 160 320 Н.д.
В/Чита/3/08 1280 Н.д. 80 80 80 320 Н.д.
В/С.-Петербург/40/09 1280 320 < Н.д. Н.д. Н.д. <
В/С.-Петербург/102/09 640 320 < Н.д. Н.д. Н.д. <
В/С.-Петербург/207/09 640 80 < Н.д. Н.д. Н.д. <
В/Екатеринбург/2/10 40 80 < Н.д. Н.д. Н.д. <
В/Москва/4/10 80 160 < Н.д. Н.д. Н.д. <
Вирусы гриппа типа В Диагн. сыворотка CDC Поликлональные крысиные антисыворотки к вирусам гриппа типа В ямагатской разновидности
В/Флорида/ 07/04 В/Флорида/04/06 В/Калининград/ 4/05 В/Хабаровск/ 36/05 В/Калининград/ 12/08
Г320 ^640 Ы60 ^320 ^320
В/Флорида/07/04 2560 320 640 160 320 80
В/Флорида/04/06 2560 160 640 160 160 80
В/Калининград/4/05 1280 160 320 160 80 160
В/Хабаровск/36/05 1280 320 160 160 320 160
В/Новосибирск/4/07 640 320 Н.д.* 160 320 Н.д.
В/Челябинск/306/07 1280 160 Н.д. 80 160 Н.д.
В/Калининград/12/08 1280 40 40 80 80 320
В/Тула/15/08 2560 160 40 80 80 160
* Н.д. — нет данных.
(в сайте гликозилирования) и D163E, последняя из которых характерна для референс-штамма В/Гонконг/330/01. Стоит также отметить, что оба вируса были зарегистрированы в самом конце эпидемического сезона и стали предвестниками
возвращения на эпидемическую арену викторианской ветви.
В эпидемический сезон 2008 - 2009 годов на территории России вирусы гриппа типа В были изолированы в Калининграде, Нижнем Новгороде, Но-
восибирске, Санкт-Петербурге, Самаре, Челябинске и Туле. В лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа в этот сезон было изучено 145 штаммов гриппа типа В - 25,6% от общего количества изолированных в эпидемический сезон возбудителей. При этом в Санкт-Петербурге лишь четыре изо-лята были выделены только на КЭ, 22 штамма - как на клеточной культуре MDCK, так и на КЭ, остальные 119 штаммов - только в культуре клеток MDCK. Вирусы 2008 - 2009 годов выделения принадлежали к викторианской ветви возбудителей гриппа В. Все изоляты реагировали до 1 - 1/2 гомологичного титра с антисывороткой к современному эталонному вирусу В/Брисбен/60/08, полностью утратив сродство с эталоном предыдущих лет - В/Малай-зия/2506/04, что свидетельствует о значительном антигенном дрейфе. Данные секвенирования выявили, что все штаммы приобрели замены, характерные для референс-штамма В/Брисбен/60/08: N75^ V146I, N165^ S172P и V225I. Кроме того, появились группы замен, типичные только для российских изо-лятов, такие как: R278K, S279I, P339L и R347K, - и ряд штаммоспецифических замен: Т341, М98Р, S142F, L268F, L269V, K307R, Е313Ч L329V, а также замены в положениях 197, 198, 199 и 333, которые привели к утрате сайта гликозилирования. Замена S142F произошла в области рецепторсвязывающего сайта. Следует отметить, что замены, приведшие к утрате сайта гликозилирования, были выявлены у вирусов, изолированных на развивающихся куриных эмбрионах, которые в свою очередь и отличались по своим антигенным свойствам от аналогов, выделенных на клеточной культуре MDCK, и реагировали с антисывороткой В/Брисбен/60/08 слабее - до 1/2 - 1/8 гомологичного титра.
В эпидемический сезон 2009 - 2010 годов вирусы гриппа типа В были вытеснены пандемическим вирусом гриппа подтипа А(Н^1) и изоляция штаммов началась только с середины февраля 2010 года в городах Дальневосточного округа. Вирусы были выделены в Екатеринбурге, Иркутске, Мурманске, Москве и Туле. В лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа было изучено 36 штаммов вируса гриппа В - 8% от общего количества изолированных возбудителей этого эпидемического сезона. По данным РТГА, штаммы нынешнего года принадлежали к викторианской линии. Вирусы взаимодействовали со штаммоспецифической сывороткой к референс-штамму В/Брисбен/60/08 до 1 - 1/4 гомологичного титра, а с сывороткой к современному диагностическому штамму В/Санкт-Петербург/40/09 - до 1 - 1/8 гомологичного титра.
Генетический анализ выявил общую замену для всех исследованных вирусов викторианской линии - 11464 которая приводит к потере сайта гли-козилирования. Эта мутация является реверсивной по отношению к современному вакцинному штамму В/Брисбен/60/08, так как у всех эталонных штаммов предыдущих лет (В/Виктория/2/87, В/Гон-конг/330/01, В/Малайзия/2506/04) в данной позиции находился валин и только у В/Брисбен/60/08-подобных штаммов появляется изолейцин и возникает сайт гликозилирования. Остальные аминокислотные замены, обнаруженные у российских изолятов 2010 года, являются одиночными. Среди них Т37А у изолята В/Екатеринбург/2/10 также приводит к утрате сайта гликозилирования. Стоит отметить, что данная замена не связана с системой выделения, поскольку штамм был выделен на клеточной культуре MDCK. Отмечены замены R101K, Т214А, H314Y (у двух изолятов из Москвы и Тулы), F356L. При этом перечисленные аминокислотные замены не влияли на антигенные свойства вирусов.
Выводы
Таким образом, анализ антигенных свойств вирусов гриппа типа В показал, что с 2006 по 2010 год в России произошла смена эволюционных ветвей и у вновь пришедших представителей викторианской группы выявлен антигенный дрейф в молекулах гемагглютинина (табл. 1). Практически все вирусы гриппа типа В, выделенные в указанный период, были изолированы на клеточной культуре MDCK. По данным В.Т. Ивановой и соавт., в последнее время у вирусов гриппа типа В исчезает сайт гликозилиро-вания 187-й аминокислоты, что приводит к большему сродству с рецепторами клеток млекопитающих [4]. Тем не менее штаммы вирусов гриппа типа В по-прежнему выделяются и на куриных эмбрионах, хотя и в незначительном количестве. Представляет интерес тот факт, что при оценке ингибиторочувствительности эпидемических вирусов гриппа типа В обнаруживаются четкие различия между двумя эволюционными ветвями. До дивергенции все исследованные штаммы были высокоустойчивы к термостабильным ингибиторам нормальной сыворотки лошади. Вирусы викторианской ветви сохранили эту высокую устойчивость к ингибиторам, тогда как Ямагата-подобные вирусы оказались ингибиторочувстви-тельными [5]. Это свидетельствует о достаточно глубоких структурных изменениях вирусов ямагат-ской группы [2]. Однако отдельные современные викторианские вирусы 2010 года выделения стали проявлять ингибиторочувствительность. Ш
Литература
1. Бурцева Е.И, Иванова В.Е., Оскерко Т.А., Слепушкин А.Н. Свойства вирусов гриппа А и В, выделенных на куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK // Вопр. вирусологии. 2001. № 1. С. 29 - 33.
2. Гринбаум Е.Б., Литвинова О.М., Банников А.И. и др. Полиморфизм популяции современных вирусов гриппа А и В человека // Вестник РАМН. № 9 (2). 1994. С. 36 - 40.
Иванова А.В. Сравнительный анализ вирусов гриппа викторианской линии по антигенным и биологическим свойствам / Тезисы докладов участников VII Всероссийской конференции молодых исследователей. - СПб., 2004. С. 102, 103.
Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н. и др. Особенности вирусов гриппа, обусловивших эпидемический подъем заболеваемости в России в 2002- 2003 гг. Возврат циркуляции вирусов гриппа, подобных В/Виктория/2/87 // Вопр. вирусологии. 2004. № 3. С. 12 - 17.
5. Карпова Л.С., Маринич И.Г. Уровни, структура и динамика годовой заболеваемости гриппом и ОРЗ в России // Эпидемиология и Вакцино-профилактика. 2006. № 2 (27). С. 23 - 26.
6. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Исакова И.Н. и др. Фенотипиче-ские особенности эпидемических штаммов вируса гриппа типа В, выделенных в разные годы // Вопр. вирусологии. 2006. № 5. С. 38 - 41.
7. Литвинова О.М., Коновалова Н.И., Лобова Т.Г. Вирусологический анализ вирусов гриппа, циркулировавших в России в 1998 - 2004 гг. / Материалы международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты». СПб., 2 - 5 ноября 2004 г. С. 26.
8. Литвинова О.М., Смородинцева Е.А., Деева Э.Г. и др. Этиология современного гриппа // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2001. № 1. С. 5 - 9.
9. Маринич И.Г., Соминина А.А., Карпова Л.С. и др. Информация о ситуации по гриппу в мире и России со второго полугодия 2002 по сентябрь 2003 года // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2003. № 6 (13). С. 13 - 20.
10. Монисов А.А. Выделение вирусов гриппа в клеточной культуре: Методические рекомендации. - М.: НИИ гриппа, 1999. - 12 с.
11. Соминина А.А., Бурцева Е.И., Коновалова Н.И. и др. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация: Методические рекомендации. - М., 2006. - 24 с.
12. Соминина А.А., Монаенко А.О., Смородинцева Е.А. и др. Анализ этиологической структуры гриппоподобной заболеваемости и мониторинг эпидемии гриппа 1998 - 1999 гг. с использованием методов лабораторной диагностики // Вестник РАМН. 2001. № 3. С. 8 - 12.
13. Che X.S., Bolar T.V., Zhao P. et al. Cocirculation and evolution of two lineages of influenza B viruses in Europe and Israel in the 2001 - 2002 season // Journal of Clinical Microbiology. 2003. V. 41 (12). P 5770 - 5773.
14. Kanegae Y., Sugita S., Endo A. et al. Evolutionary pattern of the hemagglutinin gene of influenza В viruses isolated in Japan: cocirculat-ing lineages in the same epidemic season // Journal of Virology. 1990. V. 64 (6). P. 2860 - 2865.
15. McCullers J.A., Saito T., Iverson A. Multiple genotypes of influenza В virus circulation between 1979 and 2003 // Journal of Virology. 2004. V. 78. (23). P. 12817 - 12828.
16. Oh D.Yu, Barr I.G., Mosse J.A. et al. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells // J. Clin. Microb. 2008. V. 46. P 2189 - 2194.
17. Shaw M.W., Xu X., Li Y. et al. Reappearance and global spread of variants of influenza B/Victoria/2/87 lineage viruses in the 2000 - 2001 and 2001 - 2002 seasons // Virology. 2002. V. 303. P. 1 - 8.
18. Shih S., Chen G., Yang C. et al. Laboratory-based surveillance and molecular epidemiology of influenza virus in Taiwan // Journal of Clinical Microbiology. 2005. V. 43 (4). P. 1651 - 1661.
короткой строкой
Профилактика пневмококковой болезни у новорожденных и детей вакцинами: 13-валентной пневмококковой конъюгированной и 23-валентной пневмококковой полисахаридной
рекомендации Консультативного комитета по иммунизации (ACIP)(выдержки)
В связи с лицензированием в США (февраль 2010 г) 13-валентной пневмококковой конъюгированной полисахарид-белковой вакцины (PCV13 (Prevnar 13 (Превенар 13), Wyeth Pharmaceuticals Inc., продается компанией Pfizer) Консультативный совет по иммунизации выпустил обновленные рекомендации по предотвращению инвазивных пневмококковых заболеваний среди младенцев и детей младшего возраста от 13 пневмококковых сероти-пов, охваченных новой вакциной. Превенар 13 содержит семь серотипов, включенных в Превенар 7 (серотипы 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F), и шесть дополнительных (1, 3, 5, 6A, 7F и 19A). Превенар 13 назначается в возрасте 6 недель - 71 месяца.
Рекомендации включают вакцинацию: 1) плановую - детей 2 - 59 месяцев; 2) групп риска - детей 60 - 71 месяца с сопутствующими заболеваниями; 3) дополнительную для детей, которые ранее получили > 1 дозы препарата Превенар 7.
Для плановой иммунизации детей вакциной Превенар 13 рекомендуется четыре дозы по схеме: 2 - 4 - 6 и 12 - 15 месяцев. Младенцы и дети, которые получили
> 1 дозы препарата Превенар 7, должны завершить иммунизацию по схеме вакциной Превенар 13. Одна дополнительная доза препарата Превенар 13 рекомендуется для всех детей в возрасте 14 - 59 месяцев, которые получили четыре дозы вакцины Превенар 7 или другой соответствующий возрасту препарат. Для детей, входящих в группу риска, дополнительные дозы вакцины Превенар 13 рекомендуются в возрасте 71 месяца.
Рекомендации также предназначены для целевого использования 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакцины у детей в возрасте 2 - 18 лет с сопутствующими заболеваниями.
Подробную информацию о вакцине Превенар 13 и полный текст рекомендаций по ее использованию смотрите в MMWR, 2010 год, № 59, страницы 258 - 261.
Источник:
Recommendations and Reports. 2010. № 59 (RR 11). P. 1 -18.
