CC BY
40
УДК 616.981.452:616-093/-098
Г.А.Ерошенко, Г.Н.Одиноков, Л.В.Анисимова, Н.Ю.Шавина,
Н.А.Виноградова, В.В.Кутырев
АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫЕ ШТАММЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ И РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИХ ДЕТЕКЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В работе приведены данные об антибиотикоустойчивых штаммах Yersinia pestis, выделенных из клинических источников и от животных, и показаны причины их резистентности к различным лекарственным препаратам. Сообщается о разработке двух ПЦР для выявления генов устойчивости к антибиотикам, эффективность которых подтверждена при использовании коллекции антибиотикоустойчивых штаммов Y. pestis.
Ключевые слова: возбудитель чумы, антибиотикоустойчивость, гены, детекция, полимеразная цепная реакция.
Штаммы Yersinia pestis, циркулирующие в естественных условиях в природных очагах чумы, как правило, чувствительны к действию антибиотиков [7, 14, 16]. Так проведенное E.Hemandez etal. [7] изучение чувствительности 94 штаммов Y pestis, выделенных в разных регионах, к 24 различным антибиотикам, показало, что все изоляты были чувствительны к изученным антибиотикам, включая флуорхинолоны, аминогликозиды и доксициклин. Наиболее активными в отношении Y. pestis оказались флуорхинолоно-вые антибиотики, цефалоспорины третьего поколения и аминогликозиды.
Впервые для лечения чумы в качестве антимикробных агентов были применены сульфонамид (1938 г.) и стрептомицин (1946 г.) [13]. Их использование привело к резкому падению смертности среди заболевших чумой. В настоящее время для лечения этой болезни широко применяются антибиотики стрептомицин, тетрациклин и хлорамфеникол. Основным из них является стрептомицин, однако из-за ограниченного доступа к стрептомицину в некоторых странах вместо него применяют гентамицин или гентамицин в сочетании с тетрациклином. Хлорамфеникол является препаратом выбора для лечения чумы, осложненной менингитом или плевритом, так как в этих случаях другие антибиотики менее эффективны [2, 9, 12]. Альтернативными лекарственными препаратами для чумы являются флуорохинолоны, а для ее профилактики используют сульфонамид, триметоприм-сульфаметоксазол и тетрациклин [5].
В 1995 г. на о. Мадагаскар от больного человека был изолирован штамм Y. pestis с множественной лекарственной устойчивостью (MDR - multi-drug resistance) к препаратам, используемым для лечения (стрептомицин, хлорамфеникол, тетрациклин), профилактики (сульфонамид, тетрациклин), а также к препаратам резерва (канамицин, ампициллин, спектиномицин) [5]. Как оказалось, детерминанты устойчивости к антибиотикам были локализованы на конъюгативной плазмиде pIP1202 (150 т.п.н.), принадлежавшей группе несовместимости Inc6-C. Устойчивость к ампициллину была вызвана наличием TEM-1 пенициллиназы (blaTEM1), хлорамфе-
николу - хлорамфеникол ацетилтрансферазы I типа (catI)), к канамицину - 3’-0-аминогликозид фосфо-трансферазы I типа [aph(3’)-I], к сульфонамиду -лекарственно-устойчивой дегидроптероат синтазы (sull), и к стрептомицину - 3’-9-0-аминогликозид аденилилтрансферазы (ant3’9) [4, 5]. Устойчивость к тетрациклину была обусловлена эффлюксом [tet(D)]. Плазмида pIP1202 могла с высокой частотой передаваться между штаммами возбудителя чумы [4-6, 8].
В том же году на о. Мадагаскар был выделен еще один клинический антибиотикоустойчивый штамм Y. pestis, содержавший другую конъюгативную плазмиду pIP1203 (40 т.п.н.), с высоким уровнем резистентности к стрептомицину, которая также могла с высокой частотой передаваться штаммам чумного микроба. Плазмида pIP1203 содержала два гена strA (801 п.н.) и strB (804 п.н.), кодирующих аминогли-козид 3’-O- и 6-О-фосфотрансферазные активности [5]. В течение последующих трех лет (1996-1998 гг.) на о. Мадагаскар были выделены два клинических изолята, один из них отличался устойчивостью к ампициллину, а другой - к хлорамфениколу [3]. Затем в столице острова (г. Антананариву) были изолированы три штамма Y pestis: один с устойчивостью к тетрациклину (от крысы) и два - к ампициллину (от блох) [3].
В 2004 г. pIP1202 - подобная конъюгативная плазмида была обнаружена в Восточном Китае у штамма холерного вибриона V cholerae О139, устойчивого, по крайней мере, к 6 антибиотикам -ампициллину, стрептомицину, гентамицину, хло-рамфениколу и треметоприм-сульфаметаксозолу. Идентичность MDR плазмид Y. pestis и V. cholerae составила 99,99 % [11]. Анализ MDR штаммов V. cholerae O139, изолированных в Восточном Китае с 1994 по 2006 год, выявил значительный рост изолятов, содержавших р1Р1202-подобную плазмиду, - от 7,69 до 92,16 % [11].
Плазмиды с практически идентичными плазмиде pIP1202 последовательностями были выявлены у штаммов Salmonella enterica серотипа Newport у патогенных для рыб штаммов Yersinia ruckeri, а также у многочисленных энтеробактериальных патогенов,
изолированных из розничных мясных продуктов в 2002-2005 гг. в США [15]. Все эти данные свидетельствуют о возрастающем распространении р1Р1202-подобных MDR плазмид среди зоонозных патогенных бактерий, а также о возникновении в природе резервуара MDR подвижных генетических элементов, которые могут передаваться возбудителям опасных и особо опасных инфекционных болезней.
Появление в природе атипичных антибиотикоустойчивых штаммов У. рвъиъ представляет серьезную проблему для здравоохранения, поскольку это может привести к повышению процента летальности среди заболевших чумой. К тому же именно MDR штаммы могут быть использованы в качестве биологического агента в актах биотерроризма [10]. Все это требует проведения мониторинга выделяемых штаммов У. рвъиъ по их антибиотикоустойчивости, а также разработки современных и эффективных методов идентификации MDR штаммов.
В настоящее время для выявления штаммов У. рвъиъ, резистентных к лекарственным препаратам, используются микробиологические методы, которые занимают достаточно продолжительное время, что затрудняет своевременный выбор лекарственного препарата для лечения больного человека. Развитие высокоэффективных технологий современной молекулярной микробиологии позволяет осуществлять выявление лекарственной устойчивости у штаммов У. рвъиъ на качественно новом уровне. Большой эффективностью и быстротой получения результатов отличается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предназначенный для детекции различных генов. До сих пор этот метод использовали для выявления у возбудителя чумы генов вирулентности или видоспецифических участков ДНК.
Целью нашего исследования была разработка способа выявления у штаммов У. рв8й8 генов, кодирующих устойчивость к некоторым антибиотикам, на основе метода ПЦР.
Материалы и методы
В работе использовано 49 штаммов У. pestis основного и неосновных подвидов различного происхождения. Штаммы культивировали на агаре или в бульоне LB при 37 °С. ДНК штаммов выделяли общепринятым способом [1]. Полимеразную цепную реакцию проводили по следующей программе: 1 цикл - 94 °С 5 мин, затем 35 циклов при 94 °С 45 с, 60 °С 1 мин, 72 °С 45 с и завершающий цикл 72 °С 3 мин. Определение наличия продукта ПЦР-ампли-фикации осуществляли методом электрофореза в 1-2 % агарозном геле [1].
Результаты и обсуждение
В связи с широким распространением у патогенных бактерий множественной устойчивости, вызванной плазмидой р1Р1202, нами был проведен
компьютерный анализ генов антибиотикорезистент-ности этой плазмиды, полная нуклеотидная последовательность которой представлена в базе данных NCBI GenBank. Выявлено наличие двух генов strA и strB, кодирующих устойчивость к стрепомицину (Sm), двух генов tetA и tetC - к тетрациклину (Тс) и гена cat - к хлорамфениколу (Cm), а также других генов. Были определены размеры генов и их локализация на pIP1202: strA (размер гена 804 п.н.), положение гена 34715-35518 от начала последовательности плазмиды; strB (837 п.н.), положение гена 35519-36354; tetA (1185 п.н.), положение гена 1477544-148728; tetR (657 п.н.), положение гена 148824-149480; cat (660 п.н.), положение гена 40829-41483. Все перечисленные гены из состава плазмиды pIP1202 кодируют резистентность к антибиотикам, широко применяемым для лечения чумы.
На следующем этапе для выявления этих генов у штаммов Y. pestis нами были рассчитаны праймеры, последовательности которых представлены в табл.1. Локализация некоторых праймеров указана на рис.1 (А, Б, В). Кроме праймеров на гены антибиотикоу-стойчивости pIP1202, были также рассчитаны праймеры на ген канамицинустойчивости npt (796 п.н.), кодируемый траспозоном Tn5, часто встречающимся среди членов семейства Enterobacteriaceae (табл.1).
Для изучения эффективности разработанных праймеров были использованы природные штаммы Y. pestis основного и неосновных подвидов, а также коллекция антибиотикоустойчивых штаммов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб» (табл. 2). Среди штаммов, резистентных к антибиотикам, присутствовали: четыре канамицинустойчивых
штамма Y. pestis: КМ219, КМ244. КМ245 и КМ258, полученные путем введения в геном исходных штаммов транспозона TnJ, кодирующего устойчивость к канамицину; два тетрациклинустойчивых штамма - PKR133 (Tcr) и Java (Tcr); два устойчивых к хлорамфениколу штамма КМ131 и КМ221,
Таблица 1
Последовательности рассчитанных праймеров на гены антибиотикоусточивости
Праймер Нуклеотидная последовательность 5’-3’
strA-S CATTCTGACTGGTTGCCTG
strA-As ATTGCGGGACACCACATCA
strB-S ACCTGTTCTCATTGCGGAC
strB-As GAAAGGCACCCATAAGCGT
tetA-S TACAGTGCCGTGCCAATCA
tetA-As TCTGCCGTTTGTCATTGCG
tetR-S ATGAGACAGGGATTGACGG
tetR-As TGACTGACCGCTGAAATCG
cat-S ATTCACATTCTTGCCCGCC
cat-As ATCAGCACCTTGTCGCCTT
Tn5(Kan)-S ATTCGGCTATGACTGGGCA
Tn5(Kan)-As ATGTTTCGCTTGGTGGTCG
Рис. 1. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов strA (А), tetA (Б) и cat (В) плазмиды pIP1202. Указано положение прямого и обратного праймеров
сконструированных за счет введения плазмиды Flac::Tn9, содержащей транспозон Tn9 с генами устойчивости к Cm, а также резистентные к стрептомицину штаммы КМ118, КМ122, КМ677, И-2998 (Smr), A-250 (Smr), полученные путем направленной селекции на средах со стрептомицином или под действием ультрафиолета.
При изучении коллекции природных и антибиотикоустойчивых штаммов Y. pestis, использованных в этой работе, с помощью праймеров, сконструированных на ген cat плазмиды pIP1202, был получен положительный сигнал амплификации у штаммов Y. pestis КМ131 и КМ221, устойчивых к хлорамфе-николу (табл. 2). В ПЦР у этих штаммов выявляли амплификаты, которые имели размер 377 п.н., что соответствовало ожидаемому (рис. 2).
Устойчивость к хлорамфениколу у Cmr штаммов Y. pestis КМ131 и КМ221 обусловлена введенной в
них плазмидой F’lac::Tn9. По данным проведенного нами компьютерного анализа, ген устойчивости к хлорамфениколу, расположенный в Tn9, имеет практически идентичную последовательность гену cat, локализованному на плазмиде pIP1202. Такую же последовательность, по данным NCBI GenBank, имеет и ген cat, расположенный на плазмидe pIP1206 штамма Esherichia coli 1540, транспозоне Tn-Cam204 и плазмиде pO111, включенных в геном других штаммов E. coli. Это означает, что разработанная нами ПЦР на ген cat будет эффективна для выявления генов устойчивости к хлорамфениколу (и Cmr штаммов Y. pestis), расположенных на мобильных генетических элементах разного происхождения.
С праймерами на гены strA и strB, а также на tetA и tetR (плазмида pIP1202) ни с одним из исследованных природных и авторских антибиотикоустойчивых штаммов Y. pestis не получено по-
Таблица 2
Выявление антибиотикоустойчивых штаммов Y pestis c помощью разработанных ПЦР
Антибио- Наличие Наличие
№ Название штамма тнкоустой- гена сat гена npt
чивость (Cmr) (Kmr)
Антибиотикоустойчивые штаммы
1-4 КМ219, КМ244, КМ245, v r - +
КМ 258 Kmr
5-9 КМ677, КМ118, КМ122, S r - -
И2998, А 250
10-11 КМ131, КМ 221 Cmr +
12-13 PKR133 (Tcr), Java (Tcr) Tcr
Природные штаммы
14-49 PKR133, 15 Hamburg, - - -
Sonche, Exu 21, Exu 33,
КМ 776, КМ 567, А-1792,
М-956, А-1793, А-161,
М-519, А-1825, А-1836,
А-100, 231исх, 353,1203,
А-1486, И-1270, 7896,
3544 Арм., 1146, 818,
А1633, А1724, A1725,
2183, 2817, КМ 683,
A1802, A1815, A1817,
КМ 684, И-3069, И-3071
ложительного результата, что свидетельствовало об отсутствии у них генов, идентичных таковым, расположенным на плазмиде pIP1202, и о наличии у них других механизмов резистентности к Sm и Tc. Несмотря на то, что проведенное нами компьютерное моделирование комплементарности сконструированных праймеров последовательностям генов strA, strB, tetA, tetR свидетельствует об их эффективности для выявления этих генов, тем не менее, для подтверждения возможности их использования на практике необходимы бактериальные штаммы, содержащие мобильные генетические элементы с генами резистентности к Sm и Tc, гомологичными генам pIP1202. Эффективность разработанных праймеров на эти гены предстоит выяснить в дальнейшем.
Нами была также разработана ПЦР для выявления гена npt устойчивости к канамицину, локализо-
Рис. 2. ПЦР-анализ штаммов Y. pestis с праймерами на ген cat устойчивости к хлорамфениколу:
Штаммы Y. pestis: 1 - Маркер молекулярных масс VAva; 2 - КМ219; З - КМ244; 4 - КМ245; 5 - КМ258; б - PKR133 (Tcr); 7 - Java;
8 - КМ131; 9 - КМ221; 10 - отрицательный контроль. Стрелкой указан размер амплификата
Рис. 3. ПЦР анализ штаммов Y. pestis с праймерами на ген npt устойчивости к канамицину:
Штаммы Y. pestis: 1 - КМ122; 2 - КМ245; 3 - КМ244; 4 - КМ258;
5 - Java (Tcr); 6 - КМ118; 7 - КМ677; 8 - КМ221; 9 - КМ219;
10 - отрицательный контроль. Стрелкой указан размер амплификата
ванного на транспозоне Tn5, который встречается у разных представителей семейства Enterobacteriaceae. С помощью разработанной ПЦР были получены положительные сигналы у штаммов КМ219, КМ244, КМ245, КМ258, устойчивых к канамицину (табл. 2, рис. 3). В ПЦР выявлялись амплификаты ожидаемого размера - 361 п.н.
Ген npt устойчивости к канамицину, расположенный на транспозоне Tn5, часто встречается у бактерий и носит разные названия - nptII, aph и npt, но, по данным NCBI GenBank, имеет идентичную последовательность и одинаковые размеры независимо от его источника, из чего следует, что разработанная нами ПЦР позволит провести идентификацию гена npt устойчивости к канамицину, имеющего разное происхождение.
Таким образом, разработаны ПЦР, выявляющие гены устойчивости к хлорамфениколу (cat) и канами-цину (npt), у штаммов возбудителя чумы. Созданные ПЦР могут найти свое применение при проведении мониторинга антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя чумы. В дальнейшем предстоит расширить круг выявляемых генов антибиотикоустойчивости, что необходимо для быстрой идентификации резистентных штаммов Y. pestis.
Работа выполнена по государственному контракту № 56-Д от 29.06.2010 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукД. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.
2. Becker T.M., Poland J.D., Quan T.J. et al. Plague meningitis a retrospective analysis of cases reported in the United States, 19701979. West. J. Med. 1987; 147:554-7.
3. Chanteau S., Retsitorahina M., Rahalison et al. Current epidemiology of human plague in Madagaskar. Microbes Infect. 2000; 2:25-31.
4. Galimand M., Guiyoule A., Gerbaud G. et al. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferrable plasmid. N.
5б
Engl. J. Med. 199У; 33У:6УУ-80.
5. Galimamnd M., Carniel E., Courvalin P. Resistance of Yersinia pestis to antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 2006; 50(10):3233-6.
6. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchrieser C. et al. Transferable plasmid-mediated to streptomycin in a clinical isolate of Yersinia pes-tis. Emerg. Infect. Dis. 2001; У(1):43-8.
У. Hernandez E., Giradet M., Ramissie F. et al. Antibiotic susceptibilities of Yersinia pestis to 24 antimicrobial agents. JAntimicrob. Chemother. 2003; 52:1029-31.
8. Hinnebusch B.J., Rosso M.-L., Schwan J.L., Carniel E. High-frequency conjugative transfer of antibiotic resistance genes to Yersinia pestis in the flea midgut. Mol. Microbiol. 2002; 2:349-54.
9. McCrumb F.R., Mercurier S., Robic J. et al. Chloramphenicol and terramycin in the treatment of pneumonic plague. Am. J. Med. 1953; 14:284-93.
10. Navais E. Problems associated with potential massive use of antimicrobial agents as prophylaxis or therapy of a biterrorist attack. Clin. Microbiol. Infect. 2002; 8:534-9.
11. Pan J.-C., Ye R., Wang H.-Q. et al. Vibrio cholerae O139 multi-drug resistance mediated by Yersinia pestis pIP1202-like conjugative plasmids. Antimicrob. Agents. Chemother. 2008; 52(11):3829-36.
12. Plague Manual: Epidemiology, Distribution, Surveillance and control. WHo/CSR/EDC/99.2 [cited 2010 Oct 14]. Available from: http://www.who.int/csr/resources/publications/plague/WHO_ CDS_CSR_EDC_99_2_EN
13. Pollitzer R. Plague (WHO monograph series no. 22). Geneva: World Health Organization; 1954. б98 р.
14. Smith M.D., Vinh DX., Hoa N.T.T. et al. In vitro antimicrobial susceptibilities of strains of Yersinia pestis. Antimicrob. Agent. Chemother. 1995; 39:2553-4.
15. Weich T.J., Fricke W.F., McDermott P.F. et al. Multiple Antimicrobial Resistance in plague: an emerging public health risk. PLoS ONE. 200У; 3:e309.
16. Wong J.D., Barash J.D., Sandfort R.F. et al. Susceptibilities of Yersinia pestis strains to 12 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44(У):1995-6.
G.A.Eroshenko, G.N.Odinokov, L.V. Anisimova, N.Yu.Shavina, N.A.Vinogradova, V.V.Kutyrev
Antibiotic-Resistant Strains of Plague Agent and Development of Procedure for Their Detection by PCR Method
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe", Saratov
The data of antibiotic-resistant strains of Yersinia pestis isolated from clinical sources and animals are shown in the present study. Highlighted are the reasons of their resistance to different drugs. Represented are two PCRs developed for detection of antibiotic resistance genes, their efficiency has been confirmed using collection of antibiotic-resistant strains of Y. pestis.
Key words: plague agent, antibiotic resistance, genes, detection, polymerase chain reaction.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. ManiatisN., FrichE., Sambrook D. [Genetic Engineering Techniques. Molecular Cloning]. Moscow: Mir; 1984. 479 p.
Authors:
Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Anisimova L.V., Shavina N.Yu., Vinogradova N.A., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: mi-crobe@san.ru
Об авторах:
Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Анисимова Л.В., Шавина Н.Ю., Виноградова Н.А., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru
Поступила 07.12.10.
5У
