Антибиотикорезистентность госпитальных штаммов Enterococcus spp. , выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови: результаты многоцентрового исследования Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

RM'AiX

www.antibiotic.ru/cmac/

КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ

Тем 20 №2

2018

Антибиотикорезистентность госпитальных штаммов Enterococcus spp./ выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови: результаты многоцентрового исследования

Клясова Г.А.1, Федорова А.В.1, Фролова И.Н.1, Хрульнова С.А.1, Ветохина А.В.2, Капорская Т.С.2, Скоробогатова Е.В.3, Молчанова И.В.4, Поспелова Т.И.5, Крайнова Л.Е.6, Шушурина С.Е.7, Хорева О.Е.8, Звёздкина Н.Н.9, Куцевалова О.Ю.10

1 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия

2 Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница, Иркутск, Россия

3 Российская детская клиническая больница ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Россия

4 Челябинская областная клиническая больница, Челябинск, Россия

5 Городская клиническая больница №2, Новосибирск, Россия

6 Новосибирская областная клиническая больница, Новосибирск, Россия

7 Самарская областная клиническая больница им. В.Д. Середавина, Самара, Россия

8 Сургутская окружная клиническая больница, Сургут, Россия

9 Краевая клиническая больница, Барнаул, Россия

10 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия

Контактный адрес:

Галина Александровна Клясова

Эл. почта: [email protected]

Ключевые слова: бактериемия, гемобластозы, ванкомицин-устой-чивые энтерококки, Еп1еюсосси$ faecium, антибиотикорезистент-ность, линезолид-резистентность.

Цель. Изучить чувствительность Enterococcus spp., выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови, к антибактериальным препаратам.

Материалы и методы. Чувствительность к антибактериальным препаратам 427 изолятов Enterococcus spp., выделенных в рамках многоцентрового исследования в 10 стационарах 8 городов России в 2002-2016 гг., была изучена методом серийных микроразведений в бульоне [CLSI 2015].

Результаты. Среди возбудителей бактериемии преобладали Е. faecium (78,2%), далее следовали E. faecalis (19,7%) и другие виды Enterococcus (2,1%). За период исследования было выявлено 50 (15%) ванкомицин-устойчивых E. faecium (Vancomycin-resistant Enterococcus -VRE), из них 33 (66%) имели ген vanA, 17 (34%) - ген vanB. В 2012 г. был выделен один изолят E. faecium, устойчивый к линезолиду (МПК 16 мкг/мл). При секвенировании линезолид-устойчивого E. faecium были определены мутации в гене, кодирующем 23S рРНК. Все VRE E. faecium, включая линезолид-устойчивый изолят, были чувствительны к даптомицину. Все изоляты E. faecium были чувствительны к тигецикли-ну, 78,7% к хлорамфениколу, 74,9% к тетрациклину. Доля E. faecium с высоким уровнем резистентности к гентамицину составила 85%, к стрептомицину - 60%, одновременно к обоим аминогликози-дам - 45%. Все E. faecalis были чувствительны к линезолиду, тейкопланину и тигециклину, 97,6% к ампициллину. В исследовании был выделен один штамм E. faecalis (1,2%) умеренно резистентный к ванкомицину с геном резистентности vanD, и один изолят E. gallinarum, устойчивый к ванкомицину, несущий гены устойчивости vanC1 и vanB.

Выводы. Изоляты E. faecalis имели более благоприятный профиль чувствительности в сравнении с E. faecium. Среди E. faecium устойчивыми к ванкомицину были 15% штаммов, к линезолиду - один (0,3%). Нечувствительными к ванкомицину были по одному изоляту E. faecalis и E. gallinarum.

Antimicrobial resistance of nosocomial Enterococcus spp. isolated from blood culture in patients with hematological malignancies

Klyasova G.A.1, Fedorova A.V.1, Frolova I.N.1, Khrulnova S.A.1, Vetokhina A.V.2, Kaporskaya T.S.2, Skorobogatova E.V.3, Molchanova I.V.4, Pospelova T.I.5, Krainova L.E.6, Shushurina S.E.7, Khoreva O.E.8, Zvyozdkina N.N9, Kutsevalova O.Yu.10

1 National Medical Research Center of Hematology, Moscow, Russia

2 Irkutsk Regional Clinical Hospital, Irkutsk, Russia

3 Russian Children's Clinical Hospital, Moscow, Russia

4 Chelyabinsk Regional Clinical Hospital, Chelyabinsk, Russia

5 City Clinical Hospital #2, Novosibirsk, Russia

6 Novosibirsk Regional Clinical Hospital, Novosibirsk, Russia

7 Samara Regional Clinical Hospital named after V.D. Seredavin, Samara, Russia

8 Surgut District Clinical Hospital, Surgut, Russia

9 Regional Clinical Hospital, Barnaul, Russia

10 Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia

Клясова Г.А. и соавт.

Contacts:

Galina A. Klyasova E-mail: [email protected]

Key words: bacteremia, hematological malignancies, VRE, Enterococcus faecium, antimicrobial resistance, linezolid resistance.

Objective. To evaluate antimicrobial susceptibility of Enterococcus spp. isolated from blood culture in patients with hematological malignancies.

Materials and methods. Antimicrobial susceptibility of 427 Enterococcus spp. collected from 10 hospitals in 8 cities of Russia in 2002-2016 as part of the multicenter study was tested by the broth microdilution method [CLSI 2015].

Results. Among bloodstream pathogens there was a prevalence of E. faecium (78.2%), followed by E. faecalis (19.7%) and other Enterococcus spp. (2.1%). A total of 50 (15%) vancomycin-resistant E. faecium (Vancomycin-resistant Enterococcus - VRE) was detected, of them 33 (66%) were harboring vanA gene, 17 (34%) - vanB gene. In 2012 one linezolid resistant E. faecium (MIC = 16 |ig/mL) was detected. Linezolid-resistant E. faecium contained the G2576T 23S rRNA mutation. All VRE faecium including the one linezolid-resistant isolate were susceptible to daptomycin. All E. faecium were susceptible to tigecycline, 78.7% - to chloramphenicol, 74.9% - to tetracycline. Proportion of E. faecium with high level resistance to gentamicin was 85%, to streptomycin - 60%, to both aminoglycosides - 45%. All E. faecalis were susceptible to linezolid, teicoplanin and tigecycline; 97.6% - to ampicillin. One isolate of E. faecalis (1.2%) with intermediate susceptibility to vancomycin (MIC = 16 |g/mL) harboring vanD gene and one isolate of E. gallinarum resistant to vancomycin, carrying vanC1 and vanB genes were detected. Conclusions. Isolates of E. faecalis had more favorable profile of antimicrobial susceptibility comparing to E. faecium. A total of 15% E. faecium were vancomycin resistant and one of them had resistance to linezolid. In this study one E. faecalis and one E. gallinarum isolates were non-susceptible to vancomycin.

Введение

Инфекции являются ведущими осложнениями у больных опухолями системы крови, и у отдельных категорий больных частота их составляет 80% и более при реализации цитостатической терапии [1]. Спектр микроорганизмов, ответственных за инфекционный процесс у иммунокомпрометированных больных, периодически претерпевает изменения. В последние годы в этиологии инфекций кровотока вновь появилась тенденция к увеличению доли грамотрицательных бактерий с сохранением весомой доли грамположительных бактерий за счет коагулазонегативных стафилококков и энтерококков. Так, при анализе 640 микроорганизмов, выделенных из гемокультур при сепсисе у 478 больных опухолями системы крови, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях 7 лечебных учреждений 5 городов России (2003-2005 гг.), на долю грамотрицательных бактерий пришлось 48%, грамполо-жительных бактерий - 46%, дрожжеподобных грибов -6% [2]. Основными возбудителями были Escherichia coli (18,5%) и коагулазонегативные стафилококки (18,4%), третью позицию занимали Enterococcus spp. (10,5%), далее следовали Klebsiella pneumoniae (7,8%) и Pseudomonas aeruginosa (7,2%). Последующий анализ 1290 микроорганизмов из гемокультуры у 946 больных опухолями системы крови (2003-2007 гг.) в рамках этого исследования не выявил существенных различий в структуре ведущих возбудителей инфекций кровотока (E. coli - 18,6%, коагулазонегативные стафилококки -18%, Enterococcus spp. - 9,9%, K. pneumoniae - 7,3%, P. aeruginosa - 7%) [3]. Отличий не было в распределении ведущих микроорганизмов по центрам, принимавшим участие в исследовании, а штаммы Enterococcus spp. в течение анализируемых пяти лет (2003-2007 гг.) устойчиво занимали третью позицию.

Детальный анализ этиологии бактериемий у гематологических больных, проведенный экспертами Четвертой Европейской конференции по инфекциям у пациентов с лейкемией (Forth European Conference on Infectious in Leukemia Group, ECIL-4) по публикациям с 2005 по

Клясова Г.А. и соавт.

2011 гг., показал, что частота выделения Enterococcus spp. из гемокультуры в среднем составляет 5%, является неоднородной и значимо варьирует в разных стационарах от полного отсутствия до 38% [4]. Наиболее высокий процент энтерококковых бактериемий (18-38%) был зарегистрирован у реципиентов аллогенных гемопоэти-ческих клеток. В 2011 г. по данным анкетирования 33 центров в рамках ЕС^-4 частота бактериемий, вызванных Enterococcus spp., была несколько выше и составила в среднем 8%, сохраняя вариабельность от 0 до 30% в разных клиниках.

Наряду с высокой частотой выделения Enterococcus spp. из гемокультуры, следует отметить увеличение ан-тибиотикорезистентности их к противомикробным препаратам и, прежде всего, к ванкомицину - антибиотику, широко используемому в гематологической практике. Летальность при инфекциях, вызванных ванкомицин-ре-зистентными энтерококками, является высокой и у больных с нейтропенией может достигать 70-80% [5].

Целью нашего исследования было изучение чувствительности к противомикробным препаратам Enterococcus spp, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови.

Материалы и методы

Изоляты бактерий. В исследование были включены госпитальные изоляты Enterococcus spp, выделенные из гемокультуры от больных опухолями системы крови и с симптомами сепсиса, находившихся на лечении в гематологических отделениях 10 лечебных учреждений России (Москва - 2 центра, Новосибирск - 2 центра, Иркутск, Челябинск, Барнаул, Самара, Сургут, Ростов-на-Дону) с 2002 по 2016 гг. Из них 9 стационаров были для лечения взрослых, один - для детей. В исследование включали первый штамм, выделенный из гемокультуры.

Кровь для микробиологического исследования брали у больных из периферической вены и/или из цен-

трального венозного катетера в коммерческие флаконы, предназначенные для культивирования образцов крови, при возникновении температуры от 38°С и выше. Инкубирование флаконов с гемокультурой проводили в автоматическом анализаторе для гемокультур или в термостате. Идентификацию микроорганизмов проводили согласно методам, принятым в каждой лаборатории.

Все микроорганизмы были доставлены в лабораторию клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, где была проведена реидентификация всех изолятов до вида. Видовую принадлежность изолятов c 2002 по 2011 гг. проводили с помощью идентификационной системы BBL Crystal Gram-positive ID Kit (Becton Dickinson, США), а с 2012 года - методом матрично-ассоцииро-ванной лазерной десорбции/ионизации - времяпролет-ной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Microflex (Bruker Daltonics, Германия). Для идентификации брали изолированные колонии микроорганизмов. Ионизацию бактериальных белков осуществляли с помощью специального реагента - матрицы (а-циано-4-гидрокси-коричная кислота и раствор, содержащий 50% ацетони-трила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Идентификацию проводили в автоматическом режиме с использованием программного обеспечения Bruker Biotyper Real Time Classification, версия 3,1 (Bruker Daltonics, Германия). Результат учитывали по значениям коэффициента видовой идентификации. Достоверными считали результаты, если коэффициент совпадения (Score) имел значение от 2,0 и выше. До проведения исследования изоляты хранили при температуре -70°С в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 20% глицерина.

Определение чувствительности к антибиотикам. Определение чувствительности к антибиотикам проводили методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтон (Oxoid, Великобритания) в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI, 2015 г.) [6]. При характеристике результатов чувствительности бактерий использовали следующие показатели - чувствительные (Ч), умеренно резистентные (УР), резистентные (Р). Термин «нечувствительные» объединял умеренно резистентные и резистентные.

Значения МПК ванкомицина, тейкопланина, лине-золида, тигециклина, левофлоксацина, тетрациклина, хлорамфеникола, ампициллина, пенициллина и эритромицина определяли методом серийных микроразведений в бульоне. Чувствительность ванкомицин-устой-чивых Enterococcus spp. к даптомицину исследовали с помощью E-теста (bioMerieux, Франция). Скрининг резистентности высокого уровня к аминогликозидам проводили на агаре Мюллера-Хинтон (Oxoid, Великобритания), содержащем гентамицин 500 мкг/мл и стрептомицин 2000 мкг/мл.

Для контроля качества определения чувствительности использовали штаммы Е. faecalis АТСС 29212 и Е. faecalis АТСС 51299.

Статистическая обработка данных проведена в программе WHONET, версия 5.6.

Определение генов резистентности. Гены резистентности к гликопептидам определяли методом ПЦР с использованием специфических праймеров на гены vanA, vanB и VanD, кодирующие резистентность к ван-комицину [7]. В качестве контроля использовали штаммы E. faecium BM4147 (vanA), E. faecalis ATCC®51299 (vanB) и E. gallinarum BM4174 (vanC). В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК маркер GeneRuler™, 100 п.н. (Thermo Fisher Scientific, США).

У линезолид-устойчивого изолята E. fаecium исследовали наличие мутаций в гене 23S рРНК и в гене L4 методом секвенирования, присутствие генов optA и cfr-методом ПЦР [8-11].

Результаты

Проведено изучение чувствительности 427 изолятов Enterococcus spp., выделенных из гемокультуры больных с заболеваниями системы крови и симптомами сепсиса, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях с 2002 по 2016 гг. Основная доля микроорганизмов была представлена Е. faecium (78,2%), существенно реже выделяли E. faecalis (19,7%), Рисунок 1. Другие виды Enterococcus spp. (2,1%) были представлены единичными изолятами E. gallinarum (n=5), E. durans (n=2), E. avium (n=1) и E. hirae (n=1).

Результаты чувствительности Enterococcus spp. и распределение значений МПК антибиотиков представлены в Таблице 1 и на Рисунке 2.

Чувствительность Е. faecium к антибактериальным препаратам

За анализируемый период исследования было выявлено 50 (15%) ванкомицин-устойчивых E. faecium (Vancomycin-resistant Enterococcus -VRE), из них первый изолят был в 2005 году (МПК ванкомицина 512 мкг/мл). VRE E. faecium были выделены в 5 центрах 4 городов (Москва, Иркутск, Челябинск, Сургут). Значения МПК50

Enterococcus spp. 2,1%

Рисунок 1. Распределение Enterococcus spp., выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови (n=427)

Примечание: Enterococcus spp. (n=9) включают E. gallinarum (n=5), E. durans (n=2), E. avium (n=1), E. hirae (n=1)

Клясова Г.А. и соавт.

Таблица 1. Чувствительность Enterococcus spp. (n=427) к антибактериальным препаратам

Показатель n (%) изолятов по категориям МПК (мкг/мл)

Ч УР Р МПК50 МПК90 Диапазон

E. faecium, n=334

Тигециклин 334 (100) 0 0 0,032 0,125 0,0075-0,125

Линезолид 333 (99,7) 0 1 (0,3) 1 2 0,125-16

Тейкопланин 301 (90,1) 0 33 (9,9) 0,25 1 0,125-128

Ванкомицин 284 (85) 0 50 (15) 0,5 512 0,12-1024

Хлорамфеникол 263 (78,7) 49 (14,7) 22 (6,6) 8 16 0,25-64

Тетрациклин 250 (74,9) 3 (0,9) 81 (24,3) 0,125 64 0,12-> 128

Стрептомицин 2000 133 (40) - 201 (60) - - <2000->2000

Гентамицин 500 51 (15) - 283 (85) - - <500->500

Эритромицин 19 (5,7) 28 (8,4) 287 (85,9) >128 >128 0,125-> 128

Левофлоксацин 16 (4,8) 2 (0,6) 316 (94,6) 64 >128 0,25->128

Ампициллин 5 (1,5) 0 329 (98,5) 128 >128 0,125-> 128

Пенициллин 4 (1,2) 0 330 (98,8) >128 >128 0,125-> 128

E. faecalis, n=84

Тигециклин 84 (100) 0 0 0,064 0,125 0,0075-0,125

Линезолид 84 (100) 0 0 1 2 0,25-2

Тейкопланин 84 (100) 0 0 0,125 0,125 0,125-0,5

Ванкомицин 83 (98,8) 1 (1,2) 0 0,5 2 012-16

Ампициллин 82 (97,6) 0 2 (2,4) 1 2 0,125-128

Пенициллин 73 (86,9) 0 11 (13,1) 2 16 0,125-> 128

Хлорамфеникол 43 (51,2) 1 (1,2) 40 (47,6) 8 64 0,5-128

Левофлоксацин 38 (45,2) 0 46 (54,8) 32 64 0,05->128

Стрептомицин 2000 35 (41,6) - 49 (58,3) - - <2000->2000

Гентамицин 500 31 (37) - 53 (63) - - <500->500

Эритромицин 20 (23,8) 6 (7,1) 58 (69,1) >128 >128 0,125-> 128

Тетрациклин 15 (17,9) 3 (3,6) 66 (78,6) 32 64 0,12-> 128

Enterococcus spp., n=9

Тигециклин 9 (100) 0 0 0,064 0,125 0,03-0,125

Линезолид 9 (100) 0 0 1 2 0,5-2

Тейкопланин 9 (100) 0 0 0,125 0,25 0,125-0,25

Хлорамфеникол 9 (100) 0 0 2 8 1-8

Ванкомицин 8 (88,9) 0 1 (11,1) 2 128 0,25-128

Гентамицин 500 8 (88,9) - 1 (11,1) - - <500->500

Ампициллин 6 (66,7) 0 3 (33,3) 1 >128 0,25->128

Пенициллин 5 (55,6) 0 4 (44,4) 4 128 0,125-128

Левофлоксацин 6 (66,7) 1 (11,1) 2 (22,2) 2 128 0,5-128

Тетрациклин 5 (55,6) 0 4 (44,4) 0,125 128 0,125-128

Стрептомицин 2000 6 (66,7) - 3 (33,3) - - <2000->2000

Эритромицин 4 (44,4) 2 (22,2) 3 (33,3) 1 >128 0,125-> 128

Примечание: Enterococcus spp. (n=9) включают E. gallinarum (n=5), E. durans (n=2), E. avium (n=1), E. hirae (n=1)

и МПК90 ванкомицина для всех исследуемых E. faecium составили 0,5 мкг/мл и 512 мкг/мл соответственно. У 56% VRE E. faecium были определены крайне высокие значения МПК ванкомицина, достигшие 1024 мкг/мл, Рисунок 3. При исследовании генов устойчивости к гли-копетидам было выявлено преобладание vanA (66%), у остальных изолятов были детектированы van B (34%),

Клясова Г.А. и соавт.

Таблица 2. Доля изолятов, нечувствительных к тейко-планину, была меньше, чем к ванкомицину и составила 9,9% (п=33). Изоляты E. faecium с геном резистентности vanB были чувствительны к тейкопланину. Значения МПК50 и МПК90 тейкопланина также были ниже значений МПК ванкомицина (0,25 мкг/мл и 1,0 мкг/мл, соответственно).

Тигециклин Линезолид Тейкопланин Ванкомицин Хлорамфеникол Тетрациклин Стрептомицин 2000 Гентамицин 500 Эритромицин Левофлоксацин Ампициллин Пенициллин

0 0

0,3 0

I Е. faecalis, n»84 11 Е. faecium, п=334

:э,9

Г2ТХ

148,8

-54.8

:2.4

94,3 195,2 98,2 98,8

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100% Рисунок 2. Нечувствительные (в %) E. faecium и E. faecalis (n=418)

Таблица 2. Гены устойчивости к гликопептидам среди VRE (n=52)

Enterococcus spp. n гены n (%) изолятов

E. faecium 50 van A 33 (66)

van B 17 (34)

E. faecalis 1 van D 1

E. gallinarum 1 van C1 +van B 1

В 2012 г. был выделен один изолят E. faecium, устойчивый к линезолиду (МПК 16 мкг/мл). Этот изолят был устойчивый ко всем тестируемым антибиотикам, за исключением даптомицина (МПК 0,5 мкг/мл) и тигецикли-на (МПК 0,06 мкг/мл). Значение МПК ванкомицина составило 1024 мкг/мл. При секвенировании линезо-лид-устойчивого E. faecium были определены мутации в гене, кодирующем 23S рРНК. Гены optA и cfr, а также мутации в гене L4 не были выявлены.

Чувствительность к даптомицину была изучена только у VRE E. faecium. Все VRE E. faecium, включая линезолид-устойчивый изолят, были чувствительны к даптомицину. На Рисунке 3 представлены распределение значений МПК даптомицина для VRE E. faecium. У 90% VRE E. faecium значения МПК даптомицина были от 2 мкг/мл и менее.

Все исследуемые E. faecium были чувствительны к тигециклину, и для этого антибиотика были характер-

I I Тигециклин Даптомицин II Линезолид |1 Ванкомицин

62

20

6

2 211 2

38

26

30

34

JÜL

МПК, мкг/мл

Рисунок 3. Распределение значений МПК ванкомицина,

линезолида, даптомицина и тигециклина среди VRE E. faecium (n=50)

ны минимальные значения МПК (МПК50 0,032 мкг/мл, МПК90 0,1 25 мкг/мл) в сравнении с другими антибактериальными препаратами. К хлорамфениколу и тетрациклину были чувствительны 78,7% и 74,9% E. faecium. У других антибиотиков (эритромицин, левофлоксацин, ампициллин) были отмечены высокие показатели устойчивости (94,3-98,8%). Доля E. faecium с высоким уровнем резистентности к аминогликозидам была существенной, особенно к гентамицину. Доля E. faecium с высоким уровнем резистентности к гентамицину составила 85%, к стрептомицину - 60%, одновременно к обоим аминогликозидам - 45%.

Чувствительность Е. faecalis к антибактериальным препаратам

Профиль чувствительности к антибактериальным препаратам у изолятов E. faecalis был более обнадеживающим, чем у E. faecium. Все E. faecalis были чувствительны к линезолиду (МПК50/90 1 /2 мкг/мл), тейкопланину (МПК50/90 0,125/0,1 25 мкг/мл) и тигециклину (МПК50/90 0,064/0,125 мкг/мл). За период исследования (2009 г.) был выделен только один изолят E. faecalis (1,2%) умеренно резистентный к ванкомицину (МПК 16 мкг/ мл) с геном резистентности vanD. Этот изолят был чувствительный к линезолиду (МПК 1 мкг/л), тейкопланину (МПК 0,25 мкг/мл), тигециклину (МПК 0,032 мкг/мл), даптомицину (МПК 0,25 мкг/мл) и резистентный к гентамицину, стрептомицину, пенициллину (МПК >128 мкг/ мл), эритромицину (МПК >128 мкг/мл), ампициллину (МПК 128 мкг/мл), левофлоксацину (МПК 64 мкг/мл).

Высокие показатели чувствительности продемонстрировал ампициллин (97,6%), к нему были устойчивы только два изолята E. faecalis. Доля нечувствительных изолятов к другим антибиотикам, включая аминоглико-зиды, была высокой и составляла от 48,8% до 82,2%, Рисунок 2.

Чувствительность Enterococcus spp. (E. gallinarum, E. durans, E. hirae, E. avium) к антибактериальным препаратам

Всего было выделено 9 изолятов, и все они были чувствительны к линезолиду, тейкопланину, тигециклину и хлорамфениколу, Таблица 1. Один изолят E. gallinarum был устойчив к ванкомицину (МПК 128 мкг/мл) и сохранял чувствительность к другому гликопептиду - тей-копланину (МПК 0,25 мкг/мл), а также к пенициллину, ампициллину, хлорамфениколу, тигециклину, даптомицину, линезолиду. У этого изолята, кроме природного гена устойчивости к ванкомицину vanC1, был детектирован дополнительный ген vanB. Из исследуемой когорты Enterococcus spp. только один изолят (E. gallinarum, vanC1, van B) проявлял высокий уровень резистентности к гентамицину. Активность in vitro других антибиотиков была ниже.

Обсуждение

Основными проявлениями инфекционного процесса, вызванного энтерококками, являются бактериемии, инфекции мочевых путей, эндокардиты, абдоминальные

Клясова Г.А. и соавт.

инфекции, иногда менингиты. Из этого перечня возможных осложнений у больных опухолями системы крови ведущую позицию занимают инфекции кровотока, причем в видовом распределении возбудителей преобладают E. faecium. Доля других видов энтерококков, способных вызывать инфекции кровотока у человека, составляет от 2% до 9% и к ним относят E. casseliflavus, E. gallinarum, E. avium, E. hirae, E. raffinosus, E. durans, E. cecorum, E. canintestini и E. mundtii [12].

Наиболее значимой характеристикой энтерококков является чувствительность их к ограниченному числу противомикробных препаратов, особенно это проявляется у E. faecium. Кроме наличия ограниченного числа потенциально активных антибиотиков, следует отметить формирование приобретенной резистентности у энтерококков, и это прежде всего касается E. faecium. Изученные нами изоляты E. faecium имели менее благоприятный профиль чувствительности в сравнении с E. faecalis.

Для Enterococcus spp. характерны межвидовые различия в чувствительности к противомикробным препаратам. Так устойчивыми к ампициллину были практически все изоляты E. faecium (98,5%) и лишь 2,4% E. faecalis. Устойчивость к пенициллинам у E. faecalis встречается редко и в большинстве стран не превышает 5% [13]. В связи с этим ампициллин остается препаратом выбора в лечении инфекций, вызванных E. faecalis, что имеет и немалую финансовую выгоду.

Высокий уровень резистентности к гентамицину и стрептомицину в нашем исследовании был определен у весомого числа изолятов, причем это проявлялось как у E. faecalis (63% и 58%, соответственно), так и у E. faecium (85% и 60%). Резистентность высокого уровня к аминогликозидам у энтерококков активно регистрируется в мире. Так в исследовании SCOPE резистентность высокого уровня к гентамицину и стрептомицину уже в 1995-1996 гг. составляла 25% и 52% у E. faecalis, 33% и 58% - у E. faecium [14]. По результатам исследования в России (1998 г.) устойчивыми к гентамицину и стрептомицину были 25% и 44% штаммов E. faecalis, 58% и 50% E. faecium, соответственно [15].

По данным European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (2016 г.) высокий уровень резистентности к аминогликозидам имели в среднем 30,5% E. faecalis и 48% E. faecium. [16]. Этот показатель был неодинаковым в разных странах, и для изолятов E. faecalis вариации составили от 12,5% (Люксембург) до 56,3% (Румыния), для E. faecium - от 9,8% (Кипр) до 80,6% (Болгария). В клинической практике высокий уровень резистентности к аминогликозидам у Enterococcus spp. проявляется отсутствием бактерицидного эффекта в комбинации их с пенициллинами. Более высокий процент определения высокого уровня резистентности к аминогликозидам у E. faecium и E. faecalis в нашем исследовании в сравнении с другими работами может быть обусловлен когортой больных, от которых были выделены изоляты, и являться следствием широкого применения сочетания бета-лактама с аминогликозидом при фебрильной нейтропении у этих больных.

До недавнего времени ванкомицин являлся препаратом выбора в лечении инфекций, вызванных

Клясова Г.А. и соавт.

E. faecium. Однако в последние годы регистрируется увеличение доли нечувствительных к нему штаммов, причем в отдельных стационарах и странах этот показатель достигает весьма внушительных цифр. Так в США по данным National Healthcare Safety Network доля VRE E. faecium достигла 83% [17]. В Европе частота детекции VRE E. faecium составляет в среднем 11,8% и варьирует от 0,4% до 46,3% по данным регистра за 2016 г. [16]. Наиболее высокий процент VRE E. faecium был определен на Кипре (46,3%), в Ирландии (44,1%) и Румынии (39%), минимальный - в Швеции (0,4%), Франции (0,6%) и Нидерландах (0,9%). Причем, в ряде стран, таких как Финляндия, Исландия, Эстония, Словения и Люксембург не были зарегистрированы VRE E. faecium [16].

Первые сообщения о выделении энтерококков, устойчивых к ванкомицину, появились в Европе в 1986 г., в США - в 1987 г. [18, 19], в России - в 2004 г. [20]. Первый VRE, выделенный в России, был идентифицирован как E. gallinarum, имел два гена устойчивости vanB, vanC1 и значения МПК ванкомицина 128 мкг/мл. Данный E. gallinarum был выделен из гемо-культуры больного острым лейкозом, находящегося на лечении в НМИЦ гематологии (г. Москва). В 2005 г. в этом же центре было зарегистрировано выделение из гемокультуры E. faecium, несущего vanA ген резистентности со значением МПК ванкомицина 512 мкг/мл [21]. Позднее появились сообщения из других центров России о выделении VRE [22, 23]. Более детальное исследование, включавшее генотипирование и мультилокусное секвенирование первых VRE E. faecium из двух гематологических центров Москвы, подтвердило их принадлежность к популяции эпидемических штаммов клональ-ного комплекса Enterococcus faecium 17 (clonal complex 17). Исследуемые 16 VRE E. faecium принадлежали к трем сиквенс типам (ST) - ST202 (n=11), ST18 (n=3) и ST262 (n=2) [24].

В нашем исследовании было выявлено 52 VRE, из них 50 изолятов E. faecium и по одному изоляту E. faecalis и E. gallinarum. У изолятов E. faecium преобладали гены резистентности vanA (66%) над генами vanB (34%). Изоляты E. faecium, несущие гены vanB, были чувствительными к другому гликопептидному антибиотику - тей-копланину, в отличие от ванкомицина. К настоящему времени описано 9 фенотипов энтерококков, устойчивых к гликопептидным антибиотикам (VanA, B, C, D, E, G, L, M, N), причем сообщения о последних трех фенотипах (Van L, M, N) были представлены в 2008 г. и позднее [25, 26]. Наибольшее клиническое значение отводится фенотипу VanA, который преобладает у E. faecium и для него характерны высокие значения МПК ванкомицина (64-1000 мкг/мл) и тейкопланина (16-512 мкг/мл). В Европе, Канаде и США также отмечено преобладание VanA фенотипа резистентности у энтерококков, в Австралии - фенотипа VanВ [27, 28].

Частота обнаружения других видов Enterococcus spp, устойчивых к ванкомицину, регистрируется существенно реже. Так по результатам исследования National Health Safety Network, включающего данные по чувствительности более 400000 бактерий из 4515 клиник, доля VRE E. faecalis составила 10%, причем этот показатель

не изменялся в течение четырех лет (2011-2014 гг.) [17]. В представленном нами исследовании изолят VRE E. faecalis имел фенотип резистентности VanD и был получен из гемокультуры в первый день поступления в НМИЦ гематологии (Москва) больной, переведенной из клиники США.

Как уже было представлено ранее, за период исследования был выделен один VRE E. gallinarum. Для этого вида энтерококков характерным является наличие фенотипа VanC с низким уровнем природной устойчивости к ванкомицину (МПК ванкомицина 2-32 мкг/мл) и сохранение чувствительности к тейкопланину. В нашем случае, наряду с природным геном vanCI, был детектирован ген vanB и высокое значение МПК ванкомицина (128 мкг/мл). В литературе имеются единичные сообщения о выделении клинически значимых штаммов VRE E. gallinarum, причем, наряду с природными генами устойчивости vanC у них определяются, как правило, дополнительно гены vanA, vanA + vanB [29].

Один (0,3%) изолят E. faecium, устойчивый к линезо-лиду (МПК 16 мкг/мл), был выделен в 2012 г. от больного острым лейкозом, находящегося на лечении в НМИЦ гематологии (г. Москва). Этот изолят был устойчивый ко всем тестируемым антибиотикам, за исключением даптомицина (МПК 0,5 мкг/мл) и тигециклина (МПК 0,06 мкг/мл), значение МПК ванкомицина составило 1024 мкг/мл. Известно несколько механизмов устойчивости к оксазолидинонам: мутации в генах 23S pPHK, мутации в генах, кодирующих рибосомальные белки L3 и L4, наличие генов cfr и optA [30]. При секвенировании линезолид-устойчивого E. faecium, выделенного в нашем исследовании, были определены мутации в гене, кодирующем 23S рРНК. Гены optA и cfr, а также мутации в гене L4 не были выявлены.

Устойчивость к линезолиду определяется только у E. faecium и E. faecalis, регистрируется редко - от 2,6% в США до 4,3% в Европе [31]. Так по данным программы Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum, включающей результаты чувствительности энтерококков за 9 лет (2004-2012 гг.) из 73 медицинских центров 33 стран, доля линезолид-устойчивых E. faecalis составила 0,92% (4 из 434 штаммов), E. faecium - 0,03% (1 из 333 штаммов) [32]. В то же время среди VRE доля обнаружения линезолид-устойчивых изолятов cущественно выше и может достигать 20-40% [33]. В большинстве случаев детекция линезолид-устойчивых Enterococcus spp. ассоциирована с предшествующим длительным применением линезолида (от 20 дней и более), в то же время есть сообщения, что только 25% больных, у которых были линезолид-устойчивые энтерококки, принимали этот препарат [33].

Все исследуемые нами Enterococcus spp., включая ванкомицин-устойчивые, были чувствительны к тиге-циклину. Низкий процент устойчивости у энтерококков к тигециклину (менее 0,5%) сообщается и другими исследователями [34].

Чувствительность к даптомицину была оценена только среди ванкомицин-устойчивых Enterococcus spp. Все исследуемые изоляты, включая линезолид-устойчивый, были чувствительны к даптомицину, у 90% из них значения МПК даптомицина составили от 2 мкг/мл и менее. В

масштабных эпидемиологических исследованиях сообщается о низком проценте (<0,3%) выделения Enterococcus spp., нечувствительных к даптомицину [35]. В исследовании Casapao и соавт. этот показатель был несколько выше и составил 2% [36]. Появление нечувствительных к даптомицину штаммов также ассоциировано с длительным применением препарата, однако, у части больных эта связь также может отсутствовать [31].

Заключение

Среди энтерококков ведущими возбудителями инфекций кровотока у больных с опухолями системы крови были E. faecium (78%), существенно реже - E. faecalis (19,7%). Изоляты E. faecalis имели более благоприятный профиль чувствительности в сравнении с E. faecium. Препаратом выбора в лечении инфекций, вызванных E. faecalis, остается ампициллин, только 2,4% E. faecalis были устойчивы. В то же время у весомой доли E. faecalis (58-63%) был определен высокий уровень резистентности к стрептомицину и гентамицину, поэтому в случае необходимости добавления аминогликозида к бета-лактаму следует проводить скрининг на наличие высокого уровня устойчивости к этим препаратам.

Особое внимание следует обратить на антибиотико-резистентность изолятов E. faecium. У 15% E. faecium была определена резистентность к ванкомицину, причем у одного из них и к линезолиду. Все VRE E. faecium были чувствительны только к тигециклину и даптомицину. Безусловно, при такой частоте обнаружения VRE E. faecium нельзя рассматривать ванкомицин как препарат выбора в лечении энтерокококковых инфекций у больных опухолями системы крови, и назначение ванкомицина будет обосновано только после подтверждения чувствительности. В настоящее время препаратом выбора при выделении из гемокультуры Enterococcus spp. следует рассматривать бактерицидный антибиотик - даптомицин, проявляющий высокую активность не только в системе кровотока, но и в биопленках. Несмотря на высокие показатели активности in vitro, применение тигециклина не рекомендовано в лечении инфекций кровотока ввиду отсутствия клинического подтверждения его эффективности при этой патологии по причине бактериостати-ческой активности и низкой концентрации препарата в кровяном русле.

Исследование показало, что наряду с E. faecium, из гемокультуры могут быть выделены другие VRE, такие как E. faecalis, E. gallinarum, подтверждая тем самым неоднозначность выбора ванкомицина в качестве стартовой терапии энтерококковых инфекций.

Авторы выражают благодарность главному внештатному специалисту-микробиологу Комитета здравоохранения Санкт-Петербурга, руководителю отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии детского научно-клинического центра инфекционных болезней Санкт-Петербурга, профессору, доктору медицинских наук Сидоренко Сергею Владимировичу -идейному вдохновителю исследований по ванкомицин-устойчивым энтерококкам.

Клясова Г.А. и соавт.

Литература

1. Okhmat V.A., Klyasova G.A., Parovichnikova E.N., et al. Spectrum and epidemiology of infection complications in patients with acute myeloid leukemia during induction and consolidation chemotherapy. Gematologiya i transfusiologiya. 2017;62(1):9-15. Russian. (Охмат В.А., Клясова Г.А., Паровичникова Е.Н., и соавт. Спектр и этиология инфекционных осложнений у больных острыми миелоидными лейкозами на этапах индукции и консолидации ремиссии. Гематология и трансфузиология. 2017;62(1):9-15.).

2. Klyasova G.A., Speranskaya L.L., Mironova A.V., et al. The pathogens causing sepsis in immunocompromized patients: structure and problems of antibiotic resistancE. Results of a multi-center cooperative study. Gematologiya i transfusiologiya. 2007;1:1-8. Russian. (Клясова Г.А., Сперанская Л.Л., Миронова А.В. и соавт. Возбудители сепсиса у иммунокомпрометированных больных: структура и проблемы антибиотикорезистентности (результаты многоцентрового исследования). Гематология и трансфузиология. 2007;1:1-8.).

3. Klyasova G.A. Infections in patients with hematological malignancies: clinical features, diagnosis and treatment. PhD Thesis. Moscow; 2009. Russian. (Клясова Г.А. Инфекции при гемобластозах и депрессиях кроветворения: клиника, диагностика и лечение: Диссертация д-ра мед. наук. М.; 2009.).

4. Mikulska M., Viscoli C., Orasch C., et al. Fourth European Conference on Infections in Leukemia Group (ECIL-4), a joint venture of EBMT, EORTC, ICHS, ELN and ESGICH/ESCMID. Aetiology and resistance in bacteraemias among adult and paediatric haematology and cancer patients. J Infect. 2013;68:321-331.

5. Suntharam N., Lankford M.G., Trick W.E., Peterson L.R., Noskin G.A. Risk factors for acquisition of vancomycin-resistant enterococci among hematology-oncology patients. Diagnostic Microb Infect Dis. 2002;43:183-188.

6. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. CLSI document M100-S25. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2015.

7. Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol. 1995;33:24-27.

8. Bonora M.G., Ligozzi M., Luzzani A., et al. Emergence of linezolid resistance in Enterococcus faecium not dependent on linezolid treatment. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2006;25:197-198.

9. Mendes R.E., Deshpande L.M., Farrell D.J., et al. Assessment of linezolid resistance mechanisms among Staphylococcus epidermidis causing bacteraemia in Rome, Italy. J Antimicrob Chemother. 2010;65(11):2329-2335.

10. Kehrenberg C., Schwarz S. Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistant Staphylococcus isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50:1156-1163.

11. Inkster T., Coia J., Meunier D., et al. First outbreak of colonization by linezolid- and glycopeptide-resistant Enterococcus faecium harbouring the cfr gene in a UK nephrology unit. J Hosp Infect. 2017;97(4):397-402.

12. Tan C.-K., Lai C.-C., Wang J.-Y., et al. Bacteremia caused by non-faecalis and non-faecium enterococcus species at a medical center in Taiwan 2000 to 2008. J Infect. 2010;61(1):34-43.

13. European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance Atlas of Infectious Diseases Stockholm: ECDC; 2017. Available at: https://ecdc.europa.eu/en/surveillance-atlas-infectious-diseases. Accessed: 21.06.2018.

14. Jones R.N., Marshall S.A., Pfaller M.A., et al. Nosocomial enterococcal blood stream infections in the SCOPE Program: antimicrobial resistance, species occurrence, molecular testing results, and laboratory testing accuracy. SCOPE Hospital Study Group. Diagn Microbiol Infect Dis. 1997;2:95-102.

15. Sidorenko S.V., Rezvan S.P., Grudinina S.A., Krotova L.A., Sterkhova G.V. Multicenter trial of enterococcus antibiotic susceptibility. Antibiotiki i himioterapija. 1998;9:9-17. Russian. (Сидоренко С.В., Резван С.П., Грудинина С.А., Кротова Л.А., Стерхова Г.В. Результаты многоцентрового исследования антибиотикочувствительно-сти энтерококков. Антибиотики и химиотерапия. 1998;9:9-17.).

16. European Centre for Disease Prevention and Control. Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2015. Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARSNet). Stockholm: ECDC; 2016. Available at: https://ecdc.europa.eu/sites/portal/ files/media/en/publications/Publications/antimicrobial-resistance-europe-2015.pdf. Accessed: 21.06.2018.

17. Weiner L.M., Webb A.K., Limbago B., et al. Antimicrobial-Resistant Pathogens Associated With Healthcare-Associated Infections: Summary of Data Reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2011 -2014. Infect Control Hosp Epidemiol. 2016;37:1288-1301.

18. LeClercq R., Derlot E., Duval J., Courvalin P. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N Engl J Med. 1988;319:157-161.

19. Uttley A.H., Collins C.H., Naidoo J., George R.C. Vancomycin-resistant enterococci. Lancet. 1988;i57-58.

20. Kliasova G., Sidorenko S., Speranskaja L., Fedorova A.V. Detection of vanb2 in Enterococcus gallinarum in Moscow, Russia. Intern J Antimicrob Agents. 2004;24(2):131.366/79P.

21. Fedorova A.V., Cherkashin E., Kliasova G., et al. First detection of vancomycin-resistant enterococci in Russia: genetic background. Clin Microbiol Infect. 2006;12(S4):131;P1819.

22. Bagirova N.S., Dmitrieva N.V. Enterococcal bacteraemia in patients with haematological malignancies. Clin Microbiol Infect. 2006;12(S4):8;P699.

23. Lyubimova A.V., Zueva L.P., Kolodgieva V.V., Goncharov A.E. Prevalence of Colonization of Neonatal Intensive Care Unit Patients with Vancomycin-Resistant Enterococci. Jepidemiologija i vakcinoprofilaktika. 2011;4(59):27-30. Russian. (Любимова А.В., Зуева Л.П., Колоджиева В.В., Гончаров А.Е. Ванкомицин-рези-стентные энтерококки в отделениях реанимации. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011;4(59):27-30.).

24. Brilliantova A.N., Kliasova G.A., Mironova A.V., et al. Spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in two haematological centres in Russia. Intern J Antimicrob Agents. 2010;35(2):177-181.

25. Cattoir V., Leclercq R. Twenty-five of shared life with vancomycin-resistant enterococci: is it time to divorce? J Antimicrob Chemother. 2013;68:731-742.

26. Boyd D.A., Willey B.M., Fawcett D., Gillani N., Mulvey M.R. Molecular characterization of Enterococcus faecalis N06-0364 with low-level vancomycin resistance harboring a novel D-Ala-D-Ser gene cluster, vanL. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(7):2667-2672.

27. Deshpande, L.M., Fritsche T.R., Moet G.J., Biedenbach DJ., Jones R.N. Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of vancomycin-resistant enterococci from North America and Europe: a report from the SENTRY antimicrobial surveillance program. Diagn Microbiol Infect Dis. 2007;58:163-170.

28. Coombs G.W., Pearson J.C., Daly D.A., et al. Molecular epidemiology of enterococcal bacteremia in Australia. J Clin Microbiol. 2014;52:897-905.

29. Eshaghi A., Shahinas D., Li A., et al. Characterization of an Enterococcus gallinarum Isolate Carrying a Dual vanA and vanB CassettE. J Clin Microbiol. 2015;53(7):2225-2229.

30. Dekhnich A.V., Hachatryan N.N. New and old oxazolidinones: tedizolid vs. linezolid. Klinicheskaja mikrobiologija i antimikrobnaja himioterapija. 2017;19(2):121-129. Russian. (Дехнич А.В., Хача-трян Н.Н. Новые и старые оксазолидиноны. Тедизолид и линезо-лид - в чем отличия? Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2017;19(2):121-129.).

31. Patel R., Gallagher J.C. Vancomycin-resistant enterococcal bacteremia pharmacotherapy. Ann Pharmacother. 2015;49(1):69-85.

32. Mendes R.E., Hogan P.A., Streit J.M., Jones R.N., Flamm R.K. Zyvox® Annual Appraisal of Potency and Spectrum (ZAAPS) program: report of linezolid activity over 9 years (2004-12). J Antimicrob Chemother. 2014;69(6):1582-1588.

33. Pogue J.M., Paterson D.L., Pasculle A.W., Potoski B.A. Determination of risk factors associated with isolation of linezolid-resistant strains of vancomycin-resistant enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2007;28(12):1382-1388.

34. Aznar J., Lepe J.A., Dowzicky M.J. Antimicrobial susceptibility among E. faecalis and E. faecium from France, Germany, Italy, Spain and the UK (T.E.S.T. Surveillance Study, 2004-2009). J Chemother. 2012;24(2):74-80.

35. Sader H.S., Farrell D.J., Flamm R.K., Jones R.N. Daptomycin activity tested against 164457 bacterial isolates from hospitalised patients: summary of 8 years of a Worldwide Surveillance Programme (20052012). Int J Antimicrob Agents. 2014;43(5):465-469.

36. Casapao A.M., Kullar R., Davis S.L., et al. Multicenter study of highdose daptomycin for treatment of enterococcal infections. Antimicrob Agents Chemother. 2013;57(9):4190-4196.

Клясова Г.А. и соавт.