CC BY
125
УДК 615. 281 [6:539] - 022.532
АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ЖЕЛЕЗА И МЕДИ НА КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
© 2010 г. И.В. Бабушкина1, Г.В. Коршунов1, Д.М. Пучиньян1, С.П. Власова2, А.В. Федорова2, И.А. Горошинская3, В.Б. Бородулин2
1Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, ул. Чернышевского, 148, г. Саратов, 410002, sarniito@yandex.ru
2Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, meduniv@sgmu.ru
3Ростовский научно-исследовательский
онкологический институт, ул. 14линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, rnioi@list.ru
1Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopedy, Chernyshevskiy St., 148, Saratov, 410002, sarniito@yandex.ru
2Saratov State Medical University, B.Kazachia St., 112, Saratov, 410012, meduniv@sgmu.ru
3Rostov Research Oncological Institute, 14-line, 63, Rostov-on-Don, 344037, rnioi@list.ru
Изучалось антибактериальное действие наночастиц меди и железа на полиантибиотикорезистентные штаммы Pseudomonas aeruginosa, выделенные от больных с гнойными осложнениями травматолого-ортопедического стационара, и изменение биохимических свойств бактерий после воздействия нанопорошков.
Ключевые слова: наночастицы, железо, медь, Pseudomonas aeruginosa.
Antibacterial action of nanoparticles of copper and iron on polyantibiotic resistant .strains Pseudomonas aeruginosa, excreted from patients with purulent complications of a traumatological orthopaedic hospital and change of biochemical properties of bacteria under the na-nopowder influence have been studied.
Keywords: nanoparticles, iron, copper, Pseudomonas aeruginosa.
Проблема устойчивости микроорганизмов к антибиотикам требует новых подходов к лечению вызванных ими заболеваний. Существуют внутрибольнич-ные штаммы бактерии Pseudomonas aeruginosa, устойчивые ко всем известным антибиотикам. Создание высокоэффективных антибактериальных препаратов является актуальной проблемой современной медицины в связи с постоянно возрастающим числом гнойных осложнений [1]. Металлы в виде наночастиц, обладающие низкой токсичностью и пролонгированным действием, являются одним из перспективных претендентов на создание нового класса антибактериальных средств [2].
Одной из главных причин изменения физических и химических свойств малых частиц по мере уменьшения их размеров является рост относительной доли «поверхностных» атомов. С энергетической точки зрения уменьшение размеров частицы приводит к возрастанию роли поверхностной энергии. Уменьшение частиц до нанометровых размеров приводит к проявлению в них так называемых квантовых размерных эффектов. В настоящее время уникальные физические свойства наночастиц, возникающие за счёт поверхностных или квантово-размерных эффектов, являются объектом интенсивных исследований [3, 4].
Наночастицы металлов проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе бактерио-
статическое и бактерицидное действия. Имеются отдельные примеры изучения бактерицидного эффекта наночастиц железа и меди на штаммы E. coli, St. aureus. Препараты меди, введённые в организм животных в виде наночастиц, обладают пролонгированным действием и меньшей токсичностью по сравнению с солями. Наночастицы меди при введении в организм стимулируют механизмы регуляции микроэлементного состава и активность антиоксидантных ферментов. Полученные положительные результаты свидетельствуют о перспективности использования наночастиц в качестве антибактериальных средств [2, 5].
Наночастицы железа как в виде водной суспензии при подкожном введении, так и в виде мази при нанесении на раны обладают ярко выраженным ранозажив-ляющим эффектом. На основе нанопорошков железа и меди получены и апробированы препараты для ускоренного ранозаживления и лечения ожогов. Препараты позволили ускорить до 1,5 раз процесс заживления, причем после лечения не оставалось рубцов [5].
Материалы и методы
Использовали нанопорошки меди и железа, полученные из крупнодисперсных порошков с помощью плазменной технологии, основанной на испарении сырья (крупнодисперсного порошка или прутка) в плазменном потоке с температурой 5000 - 6000 К и
конденсации пара до ультрадисперсных частиц требуемого размера (дисперсность частиц 30 нм).
Исследования проводили на 20 штаммах Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящихся на лечении в травматоло-го-ортопедическом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО) и обладающих резистентностью к 5 и более профильным антибиотикам. В пробирки с разведенными нанопорошками в физиологическом растворе в различных концентрациях (0,1, 1, 10 мг/мл) добавляли по 100 мкл конечной суспензии (50000 КОЕ/мл) микроорганизмов и оставляли инкубировать в течение 30, 60, 120 и 180 мин при комнатной температуре. В качестве контроля использовали бактериальную взвесь, разведённую в аналогичных пропорциях с физиологическим раствором и инкубированную в течение того же времени. После этого с каждого из разведений производили высев на мясо-пептонный агар, по 100 мкл на каждую чашку Петри. Все чашки помещали в термостат на 24 ч при 37 °С. Подсчёт колоний производили на следующий день. Тогда же исследовали биохимические свойства микроорганизмов в опытной и контрольной культурах.
Результаты и обсуждение
Установлено, что антибактериальная активность наночастиц железа колеблется в широком диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мг/мл, но все изучаемые концентрации при времени воздействия до 180 мин вызывают снижение количества колоний, выросших на мясо-пептонном агаре, не более чем на 42 % по сравнению с контролем (p < 0,01). Использование концентрации 0,1 мг/мл вызывает снижение количества клеток только на 22 % (р < 0,01), даже при максимальной экспозиции. Использование максимальной концентрации 10 мг/мл в течение 180 мин приводило к уменьшению числа колоний на 42 %. Результаты подсчета колоний Pseudomonas aeruginosa, выросших на твердых питательных средах, после воздействия различных концентраций наночастиц железа, а также результаты подсчёта в контрольной группе, не подвергавшейся влиянию ультрадисперсных порошков, представлены в табл. 1.
При изучении антибактериального действия нано-частиц меди на клинические полиантибиотикорези-стентные штаммы Pseudomonas aeruginosa обнаружено, что антибактериальная активность наночастиц меди колеблется в широком диапазоне концентраций от 0,01 до 10 мг/мл, при этом использование концентрации 10 мг/мл вызывает гибель 96 % бактериальных клеток в течение 60 мин по сравнению с контролем (p < 0,001). Дальнейшее увеличение времени воздействия (до 180 мин) повышает антибактериальный эффект незначительно - до 97 % (p < 0,001). В меньших концентрациях антибактериальная активность наночастиц меди также выражена в достаточной степени, но при увеличении времени воздействия нано-частиц на бактериальную суспензию. Концентрация 1 мг/мл при 30-минутном воздействии уменьшает ко-
личество колоний на 38 %, увеличение времени воздействия до 60 мин приводит к уменьшению числа колоний на 76 %, до 120 мин - на 87 %, до 180 мин - на 91 % по сравнению с контролем (p < 0,001).
Таблица 1
Количество колоний Pseudomonas aeruginosa, выросших на твердых питательных средах, после воздействия наночастиц железа
Время воздействия, мин Опытные группы, M±m
1-я, 0,1 мг/мл, n=20 2-я, 1 мг/мл, n=20 3-я, 10 мг/мл, n=20 Контроль, n=20
30 618±15,3** 584±26,2*** 503±8,7*** 686±15,8
60 508±21,8*** 486±9,7*** 415±13,9*** 594±7,3
120 355±10,4*** 326±18,4*** 296±7,8*** 412±13,8
180 358±11,3*** 303±14,8*** 266±9,1*** 459±9,2
** - p < 0,01; *** - p < 0,001.
Представляет интерес воздействие низких концентраций наночастиц меди в течение длительного времени, так как это снижает риск возникновения побочных эффектов в виде местнораздражающего, цитоток-сического действия. Наночастицы меди в концентрации 0,1 и 0,01 мг/мл через 180 мин уменьшают количество колоний, выросших на плотной питательной среде, на 59 и 47 % соответственно по сравнению с контролем (р < 0,001).
Результаты подсчета колоний Pseudomonas aerugi-nosa, выросших на твердых питательных средах, после воздействия различных концентраций наночастиц меди, а также результаты подсчёта в контрольной группе представлены в табл. 2.
Таблица 2
Количество колоний Pseudomonas aeruginosa, выросших на твердых питательных средах, после воздействия наночастиц меди
Наночастицы меди при одинаковых условиях воздействия, концентрации и временных экспозициях проявляют более высокую антибактериальную активность по отношению к клиническим полианти-биотикорезистентным штаммам синегнойной палочки, чем наночастицы железа: при 30-минутном воздействии антибактериальная активность наночастиц меди в 2,4 раза выше, чем наночастиц железа, при 60-минутном- в 4,2 раза, при воздействии в течение 120 мин - в 4,1 раза, 180 мин - в 2,7 раза. Использование концентрации наночастиц 10 мг/мл выявляет еще более выраженное преобладание антибактериального эффекта наночастиц меди по сравнению с наночастицами железа. Сравнительная антибактериальная активность наночастиц железа и меди представлена на рисунке.
Время воздействия, мин Опытные группы, M±m
1-я, 0,1 мг/мл, n=20 2-я, 1 мг/мл, n=20 3-я, 10 мг/мл, n=20 Контроль, n=20
30 556±8,8*** 420,4±16,6*** 394±11,7*** 678±28,8
60 434±4,2*** 135,2±2,2*** 22,5±3,7*** 563,3±12,1
120 490,6±6,9*** 92,4±9,3*** 21.3±1,7*** 711±23,3
180 221±10,4*** 48,5±2,2*** 34,4±3,4*** 539,2±7,6
*** - p < 0,001.
Количество погибших клеток, %
Время воздействия, мин
Сравнение антибактериальной активности наночастиц железа и меди в концентрации 1 мг/мл
При изучении биохимической активности штаммов Pseudomonas aeruginosa установлено, что после воздействия наночастиц железа в концентрации 1 мг/мл наблюдаются обратимые изменения ферментативной активности микроорганизмов - снижение ферментации углеводов. 35 % изучаемых штаммов после воздействия взвеси наночастиц перестают ферментировать маннит, 15 - фруктозу (p < 0,05). В контрольной группе биохимические свойства оставались неизменными.
При изучении биохимической активности штаммов Pseudomonas aeruginosa после воздействия наночастиц меди в концентрации 1 мг/мл выявлено более выраженное ингибирующее действие на биохимическую активность микроорганизмов.
После воздействия взвеси наночастиц меди 63 % изучаемых опытных штаммов дают отрицательную реакцию на нитриты, 10 - на нитраты, 20 - на лизин;
Поступила в редакцию_
47 % штаммов перестают ферментировать маннит, 24 - ксилозу (p < 0,05). В контрольной группе биохимические свойства оставались неизменными.
Вывод
Полученные результаты показывают, что наибольшей антибактериальной активностью в отношении клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa обладает нанопорошок меди. Использование его в низкой концентрации (1 мг/мл) приводит к гибели 85 % поли-антибиотикорезистентных штаммов синегнойной палочки в течение 60 мин. В этом отношении наночасти-цы являются перспективным антибактериальным средством при инфекциях, вызванных полиантибиотикоре-зистентными штаммами Pseudomonas aeruginosa. Антибактериальная активность нанопорошка железа значительно ниже и отмечается в основном при концентрации наночастиц 10 мг/мл, при использовании которой могут отмечаться токсические эффекты.
Литература
1. Белобородое В.Б. Актуальные аспекты антимикробной терапии хирургических инфекций // Инфекции в хирургии. 2003. № 1. С. 28-30.
2. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсного порошка железа / Н.Н. Глу-щенко [и др.] // Применение биомагнитных носителей в медицине: материалы симп. М., 2002. С. 86-94.
3. Baraton M.I. Synthesis, Functionalization and Surface Treatment of Nanoparticles // Am. Sci. L.A., 2002. Р. 234-236.
4. Аттестация наночастиц металлов, используемых в качестве биологически активных препаратов / И.П. Арсентьева [и др.] // Нанотехника. 2007. № 2. С. 72-77.
5. Байтукалов Т.А. Физико-химические особенности ранозаживляющих свойств наночастиц железа и магния в составе различных полимеров: автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 2006. 20 с.
17 апреля 2009 г
