CC BY
1954 ¥
Птицеводство
www.agroyug.ru
к-
DOI 10.24412^-33489-2023-5-54-57 УДК 619:636.5.033:579.62
Леонова М.А., кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Леонов С.В., старший научный сотрудник Тареева Е.А., младший научный сотрудник,
ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН) Силин М.А., руководитель ООО «НОВАБИОТИК»
ж
АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ В ОТНОШЕНИИ УСТОЙЧИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПТИЦЕВОДЧЕСКИХ ПРЕДПРИЯТИЙ
Аннотация. Целью работы являлось изучение влияния фермента глюкозооксидазы на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы E. coli (из открытого водоема, используемого животными для водопоя и водоплавающей птицей), Ps. aeruginosa (с поверхности оборудования системы водопоения), Ent. faecalis (из бедренного сустава птицы), S. enterica ssp. houtenae (из комбикорма для промышленной птицы). Изучаемые изоляты отличаются высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам широкого спектра действия и физико-химическим факторам внешней среды. Взвесь суточных культур бактерий (1 млрд. КОЕ/мл) вносили в лунки плоскодонного планшета с забуференной пептонной водой и ферментом в концентрации 200,0 г/т. Инкубацию и считывание проводили в Tecan Spark 10M (Tecan) по программе: шейкирование каждые 10 минут, 96 RPM и амплитудой 6мм, +37,0 оС, оценка оптической плотности после шейкирования, каждые 15 минут, с усреднением показателей по 9 лучам при длине волны 530 нм. Установлено, что в течение 29 часов, ферментный препарат «Новатур»® в рекомендованной дозе 200 г/т сдерживает рост указанных бактерий.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, глюкозооксидаза, кишечная палочка, синегнойная палочка, энтерококк, сальмонелла, антибактериальный.
Summary. The aim of the work was to study the effect of the enzyme glucose oxidase on opportunistic and pathogenic microorganisms E. coli (from an open reservoir used by animals for watering and waterfowl), Ps. aeruginosa (from the surface of drinking water equipment), Ent. faecalis (from the femur of a bird), S. enterica ssp. houtenae (from compound feed for industrial poultry). The studied isolates are highly resistant to broad-spectrum antibacterial drugs and physical and chemical environmental factors. A suspension of daily bacterial cultures (1 billion CFU/ml) was added to the wells of a flat-bottom plate with buffered peptone water and enzyme at a concentration of 200.0 g/t. Incubation and reading was carried out in Tecan Spark 10M (Tecan) according to the program: shaking every 10 minutes, 96 RPM and an amplitude of 6 mm, +37.0 °C, assessment of optical density after shaking, every 15 minutes, averaging over 9 beams at a wavelength 530 nm. It has been established that within 29 hours, the Novatur® enzyme preparation at the recommended dose of200 g/t inhibits the growth of these bacteria.
Key words: antibiotic resistance, glucose oxidase, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, enterococcus, salmonella, antibacterial.
Введение. В промышленном птицеводстве длительное время считалось основополагающим применение кормовых антибиотиков для снижения развития вторичных инфекций [1]. Однако, при поражении кишечника и усиленной десквамации
слизистой, оставался высоким риск попадания крупных молекул кормового антибиотика в кровоток и далее в мышечную ткань [2].
Кормовые антибиотики ориентированы на разрушение наружной клеточной стенки бактерий,
www.amtk.su +7-914-558-11-19
изготовление запчастей по образцу заказчика
ISOKOL
Technology
поэтому подавляют преимущественно грамположи-тельную микрофлору. После термической обработки антибиотик остается в мясе.
Применение бактериальных вакцин в птицеводстве сложно технологически (инъекционные препараты), а формирование иммунного ответа длительно - при вакцинации, например, против сальмонеллы, не возникает достаточной перекрестной защиты от разных серотипов [3].
Нанометаллы блокируют экзоферменты бактерий и ферменты пищеварительного тракта организма. Также необходимо учитывать, что металл при взаимодействии с белковыми структурами клеток эпителиоцитов приводит к ускорению десквамации, и при длительном применении создает условия для развития сепсиса [4].
Применение бактериофагов долгое время считалось решением проблемы антибиотикорезистентно-сти. Однако, чтобы заменить антибиотики фагами, необходимо учитывать ряд характеристик - высокую специфичность к определенному виду бактерии. Поскольку фаги являются вирусами, иммунная система организма птицы может рассматривать их как активный антиген и, следовательно, они могут быть быстро элиминированы из системного кровообращения за счет клиренса ретикуло-эндоте-лиальной системы до того, как они аккумулируются в местах-мишенях, или они могут быть инактивиро-ваны механизмами адаптивной иммунной защиты. Длительная терапия может приводить к тому, что бактерии приобретают устойчивость к фагам путем мутации [5]. Некоторые фаги могут выживать в кишечнике только при достижении определенного количества бактерий. Фаги могут только уменьшать, но не полностью устранять S. typhimurium в кишечнике животных [6].
Маннаолигосахариды как пребиотики сами по себе не могут ингибировать и убивать патогены, поэтому они не могут предотвращать или лечить бактериальные инфекции, как это делают антибиотики [5].
Препараты на основе органических кислот применяют в птицеводстве для подавления развития патогенных бактерий в корме и воде. Одной из новых проблем, связанных с использованием органических кислот в качестве альтернативы антибиотикам, является их способность повышать выживаемость чувствительных к кислоте патогенов, подвергающихся воздействию низкого рН, путем индукции реакции толерантности к кислоте [7]. К негативным сторонам органических кислот также можно отнести истощение поджелудочной железы; формирование бактерий, разрушающих кислоты и использующих их в качестве источника энергии [5].
Экстракты растений, также известные как фи-тобиотики, используют в кормлении животных и птицы благодаря их антимикробной, противовоспалительной, антиоксидантной и антипаразитарной активности [8,9]. Однако из-за сложного состава биоактивных компонентов проводить систематические и всесторонние токсикологические исследования, оценку безопасности, активности трав и их экстрактов затруднительно, так как отсутствуют нормы и регламенты [5].
Использование ферментов исключает формирование антибиотико-устойчивых микроорганизмов в виду того, что антибактериальное свойство, например, глюкозооксидазы, в значительной степени зависит от ее способности генерировать и накапливать перекись водорода в окружающей
среде посредством превращения глюкозы, опосредованного глюкозооксидазой [10].
В современном мире остается актуальным поиск препарата широкого спектра антибактериальной активности, при этом применимого в разные технологические периоды, без необходимости учета времени выведения самого препарата, либо его метаболитов в сроки предубойной выдержки.
Цель исследования - определить антибактериальную эффективность рекомендованной дозы глюкозооксидазы в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, выделенных с объектов промышленных птицеводческих предприятий.
Материалы и методы. Исследования по определению влияния глюкозооксидазы на динамику роста тестовых изолятов микроорганизмов (МО) были проведены на базе лаборатории болезней птиц Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИЭВСиДВ) СФНЦА РАН.
В качестве объекта исследований был использован препарат «Новатур»® (ООО «Новабиотик», Россия). Препарат представляет собой фермент глюкозооксидазу в водорастворимой форме с итоговой концентрацией 200,0 г/т. Активность фермента не ниже 1000,0 ЕД/г, диапазон pH=2,5-7,0, диапазон рабочей температуры +30,0-+70,0оС (оптимум +37,0-+40,0 оС).
Для тестирования использовали изоляты МО, выделенные из промышленных объектов и отличающиеся высокой устойчивостью к физико-химическим факторам внешней среды:
Escherichia coli 2863/22 - изолят, выделенный из открытого водоема, используемого животными для водопоя и водоплавающей птицей. Характеристики: чувствителен к антибактериальным препаратам широкого спектра действия; устойчив к нагреву до +45 оС; устойчив ультрафиолетовому облучению (длина УФ волны 290нм) до 20 минут.
Enterococcus faecalis №2959/22 - изолят, выделенный из опорного аппарата птицы (бедренный сустав). Характеристики: обладает высокой про-теолитической активностью (на модифицированном агаре Эйкмана просветление вокруг колонии появлялись уже спустя 18 часов инкубирования); устойчив к широкому спектру антибиотических препаратов (в частности к гентамицину, канамици-ну, амоксициллину, тетрациклину, доксициклину, норфлоксацину, энрофлоксацину, офлоксацину, флорфениколу, хлорамфениколу, полимексину, фуразолидону, цефотаксиму, линкомицину, азитро-мицину, тилозину); устойчив к ультрафиолетовому облучению (длина УФ волны 290нм) до 30 минут, повышенным температурам до +45 оС, кислотам и их солям.
Salmonella enterica subspecies houtenae №2838/22
- изолят, выделенный из комбикорма для промышленной птицы. Характеристики: чувствителен к антибиотикам (исключение - полипептидные группы (полимиксин); устойчив к кормовым антибиотикам
- флавофосфолипол, энрамицин, авиламицин, вирджиниомицин, мультиомицин + китасамицин, бацитрацин; устойчив к нагреву до +45 оС, устойчив к ультрафиолетовому облучению (длина УФ волны 290нм) до 30 минут.
Pseudomonas aeruginosa №2368/21 - изолят, выделенный с поверхности оборудования системы во-допоения. Характеристики: устойчив к гентамицину, канамицину, амоксициллину, амоксиклаву, ампициллину, тетрациклину, доксициклину, норфлоксацину, энрофлоксацину, офлоксацину, флорфениколу, хлорамфениколу, полимексину, фуразолидону,
56 У
Птицеводство
_www.agroyug.ru
цефотаксиму, сульфаниламидам, тримето-приму, линкомицину, тилозину; устойчив к нагреву до +60 оС, обработка УФ (290 нм) - устойчив до 60 минут; обладает выраженной каталазной активностью. Обладает способностью инактивировать перекисные соединения и слабые растворы формальдегида. Мукоидная (биопленкообразующая) форма изолята МО способна производить альгинат (образует слизь, защищающую бактерию) в большом количестве при воздействии неблагополучных факторов. При их отсутствии быстро переключается на немукоидный фенотип.
На первом этапе изоляты восстанавливали суточным культивированием при 37,0 оС из лиофилизированного состояния на средах обогащенных факторами роста (бульон Хоттингера, мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА) с добавлением к объёму 5,0% стерильной сыворотки лошади. Из суточных культур МО готовили взвесь с концентрацией 0,5 единиц по МакФарленду (1,0х108 КОЕ/мл) на стерильном 0,9% растворе натрия хлористого. Получаемую взвесь тестировали методом серийных разведений на приборе спирального посева EasySpiral (Interscience) с последующей оценкой результата на приборе подсчета колоний Scan 500 (Interscience).
На втором этапе пересев МО проводили в забуференную пептонную воду (ЗПВ) производства ООО «НПЦ «Биокомпас-С», приготовленную согласно наставлению. Для культивирования МО использовали плоскодонный прозрачный 96-луночный планшет Thermo Scientific (cat. №456529) с крышкой.
В лунки полистиролового плоскодонного планшета вносили по 180,0 мкл стерильной ЗПВ, после чего в экспериментальные лунки вносили взвесь микроорганизмов (1 млрд. КОЕ/мл) в 6 повторах в объеме 10,0 мкл. В лунки положительного контроля вносилась взвесь МО в объеме 10,0 мкл и 10,0 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. В лунки отрицательного контроля вносили 20,0 мкл 0,9% раствора натрия хлористого. В экспериментальные лунки вносили по 10,0 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлористого с ферментом, создавая итоговую концентрацию 200,0 г/т.
Для выравнивания старта роста и снижения влияния манипуляций на динамику роста, планшет находился на подложке из ДТ16 на охлаждаемом столике (температура +4,0 оС).
Заполненный планшет закрывали крышкой и помещали в Tecan Spark 10M (Tecan), устанавливали программу: шейкирование каждые 10 минут, 96 RPM и амплитудой 6 мм, +37,0 оС. Оценку оптической плотности (ОП) каждой лунки проводили в автоматическом режиме, после шейкиро-вания, каждые 15 минут, с усреднением показателей по 9 лучам. Длина волны 530 нм. Мониторинг и контроль работы оборудования проводили посредством SPARKCONTROL Dashboard.
Через 29 часов образцы из лунок были отобраны для определения концентраций микроорганизмов, которое проводили методом спирального посева EasySpiral (Interscience), после чего проводили подсчет КОЕ/мл по полученным оптическим плотностям методом сплайн интерполяции.
Результаты исследований и их обсуждение.
Рисунок 1. Динамика роста Escherichia coli 2863/22.
Рисунок 2. Динамика роста Enterococcus faecalis №2959/22.
Рисунок 3. Динамика роста Salmonella enterica subspecies houtenae №2838/22.
Рисунок 4. Динамика роста Pseudomonas aeruginosa №2368/21.
www.amtk.su +7-914-558-11-19
изготовление запчастей по образцу заказчика
SOKOL
Technology
В контрольной лунке рост тестового изолята кишечной палочки начинается спустя 3,25 часа с момента инкубации планшеты. Во всех экспериментальных лунках рост не отмечен.
Спустя 29 часов инкубации концентрация кишечной палочки составила 6,8х109 КОЕ/мл, во всех экспериментальных лунках рост не выявлен.
В контрольной лунке рост тестового изолята энтерококка начинается спустя 17 часов с момента инкубации планшеты. Во всех экспериментальных лунках рост не отмечен.
Спустя 29 часов инкубации концентрация энтерококка составила 8,6х109 КОЕ/мл, ни в одной из экспериментальных лунок рост не выявлен.
В контрольной лунке рост тестового изолята сальмонеллы начинается уже спустя 3,5 часа с момента инкубации планшеты. Во всех экспериментальных лунках рост не отмечен.
Спустя 29 часов инкубации концентрация сальмонеллы составила 6,9х109 КОЕ/мл, ни в одной из экспериментальных лунок рост не выявлен.
В контрольной лунке рост тестового изолята синегной-ной палочки начинается уже спустя 3,5 часа с момента инкубации планшеты. Во всех экспериментальных лунках рост не отмечен.
Спустя 29 часов инкубации концентрация синегнойной палочки составила 9,2х1010 КОЕ/мл, во всех экспериментальных лунках рост не установлен.
Заключение. В результате исследований установлено, что препарат «Новатур»® (ООО «Новабиотик», Россия), включающий фермент глюкозооксидазу в водорастворимой форме с итоговой концентрацией 200,0 г/т, оказывает стойкий бактерицидный эффект в отношении полевых изолятов Escherichia coli 2863/22, Enterococcus faecalis №2959/22, Salmonella enterica subspecies houtenae №2838/22, Pseudomonas aeruginosa №2368/21, обладающих рядом характеристик, препятствующих воздействию на них стандартных методов терапии и профилактики.
ЛИТЕРАТУРА
1. Черкашина Н.В. Анализ современного состояния проблемы использования антибиотиков в качестве кормовой добавки / Н.В. Черкашина, Л.И. Дроздова,
B.Л. Махортов, П.Г. Васильев, М.Г. Щербаков, Л.В. Демина, А.А. Ильязов, М.С. Сирик // Аграрный вестник Урала. - 2011. - №3 (82). - С. 39-42.
2. Грозина А.А. Морфологическая оценка стенки кишечника цыплят кросса «Кобб 500» на фоне применения антибиотика и пробиотика / А.А. Грозина, В.В. Пронин, М.С. Дюмин // Российский ветеринарный журнал. -№.4. - 2014. - С. 16-17.
3. Desin T. S. Salmonella vaccines in poultry: past, present and future / T.S. Desin, W. Koster, A.A. Potter // Expert Rev. Vaccines. - 2013. - Vol.12. - P. 87-96. doi: 10.1586/ erv.12.138.
4. Olagoke F.K. Control of Soil Extracellular Enzyme Activities by Clay Minerals - Perspectives on Microbial Responses [Электронный ресурс] / F.K. Olaaoke, K. Kalbitz,
C. Vogel// Soil Systems. - 2019. - Vol. 3(4). - №64 // URL : https://www.mdpi.com/2571-8789/3/4/64 (дата обращения: 28.11.2022).
5. Guyue Ch. Antibiotic alternatives: the substitution of antibiotics in animal husbandry? [Электронный ресурс] / Ch. Guyue, H. Haihong, X. Shuyu, W. Xu, D. Menghong, H. Lingli, Yu. Zonghui // Frontiers in Microbiology. - 2014.
- Vol. 5. doi: 10.3389/fmicb.2014.00217 // URL: https:// www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2014.00217 (дата обращения: 30.01.2023).
6. Callaway T.R. Evaluation of phage treatment as a strategy to reduce Salmonella populations in growing swine / T.R. Callaway, T.S. Edrington, A. Brabban, B. Kutter, L. Karriker, C. Stahl, E. Wagstrom, R. Anderson, T.L. Poole, K. Genovese et al. // Foodborne Pathog. Dis. - 2011. - Vol. 8.
- P. 261-266. doi: 10.1089/fpd.2010.0671.
7. Ricke S.C. Perspectives on the use of organic acids and short chain fatty acids as antimicrobials / S.C. Ricke // Poult. Sci. - 2003. - Vol.82. - P. 632-639.
8. Vondruskova H. Alternatives to antibiotic growth promoters in prevention of diarrhoea in weaned piglets: a review / H. Vondruskova, R. Slamova, M. Trckova, Z. Zraly, I. Pavlik // Vet. Med. - 2010. - Vol. 55. - P. 199-224.
9. Hashemi S.R. Herbal plants and their derivatives as growth and health promoters in animal nutrition / S.R. Hashemi, H. Davoodi // Vet. Res. Commun. - 2011. - Vol. 35. -169-180. doi: 10.1007/s11259-010-9458-2.
10. Cooper R.A. Inhibition of biofilms by glucose oxidase, lactoperoxidase and guaiacol: the active antibacterial component in an enzyme alginogel / R.A. Cooper // Int. Wound J. - 2013. - Vol. 10. - P. 630-637.
