CC BY
58
5. Медведева Л. М. Памяти З. В. Ермольевой посвящается // Вестник Волгоградского государственного университета. — 2014. — № 4. — С. 131—133.
6. Перепечаев Б. П. Солдаты жизни. Волгоград. 1977 // Музей ВолгГМУ. № 720 н/в.
7. Петрова И. А., Комиссарова Е. В. Медики в Сталинградской битве // История в подробностях. —2012. — № 8 (26). — С. 68—77.
8. Тыдман С. Л. Воспоминания. 5 марта 1981 // Музей ВолгГМУ. КП № 553.
9. Юров В. С. Капельное переливание крови в полевом подвижном госпитале // Доклады на конференциях хирургов. 1941—1945 гг. — Музей ВолгГМУ. КП № 222.
10. Юров В. С. Проникающие ранения брюшной полости // Доклады на конференциях хирургов. 1941—1945 гг. — Музей Волгоградского государственного медицинского университета. КП № 222.
Контактная информация
Белова Любовь Ивановна — к. ист. н., доцент кафедры истории и культурологии, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: belovalubov@gmail.com
УДК 547.785.5
АНТИАГРЕГАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ IN VITRO НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
БЕНЗИМИДАЗОЛА
А. Ф. Кучерявенко, В. С. Сиротенко, К. А. Гайдукова, Д. Г. Матохин,
А. А. Спасов, Л. Н. Диваева, А. С. Морковник, Т. А. Кузьменко, В. А. Анисимова
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии,
НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, Ростов-на-Дону
На экспериментальной модели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов плазмы кроликов in vitro была изучена антиагрегантная активность 16 новых конденсированных производных бензимидазола. В качестве препарата сравнения были выбраны антиагрегантные препараты — ацетилсалициловая кислота и тиклид. Соединения под шифром ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15 проявили дозозависимое ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов, превосходя в несколько раз по активности ацетилсалициловую кислоту, однако при этом незначительно уступали тиклиду Определена острая токсичность LD50 веществ под шифрами ДАБ-14 и ДАБ-15.
Ключевые слова: антиагрегантное действие, агрегация тромбоцитов, ацетилсалициловая кислота, тиклид.
IN VITRO АNTIAGGREGATЮN ACTIVITY OF NOVEL BENZIMIDAZOLE DERIVATIVES
A. F Kucheryavenko, V. S. Sirotenko, K. A. Gaydu^va, D. G. Matokhin,
A. A. Spasov, L. N. Divaeva, A. S. Morkovnik, T. A. Kuzmenko, V. A. Anisimova
In vitro antiaggregation activity of 16 novel condensed derivatives of benzimidazole was studied in the experimental model of ADP-induced platelet aggregation in rabbit plasma. Acetylsalicylic acid (ASA) and ticlid were used as comparator drugs. DAB-13, DAB-14 and DAB-15 compounds showed a dose-dependent inhibitory effect on platelet aggregation in rabbit plasma in vitro. Anti-platelet aggregation activity of DAB-13, DAB-14 and DAB-15 compounds was found to be several times higher than that of ASA, and was slightly superior to anti-platelet aggregation activity of ticlid. The acute toxicity of LD50 DAB-13, DAB-14 and DAB-15 compounds was measured.
Key words: antiaggregation activity, platelet aggregation, acetylsalicylic acid, ticlid.
Ключевая роль активации тромбоцитарно-сосуди-стого гемостаза в патогенезе ишемических нарушений в различных органах определяет целесообразность использования антиагрегантных средств и других методов для их лечения и профилактики [5, 7, 11]. В настоящее время эффективность антитромбоцитарной терапии доказана в хорошо спланированных клинических исследованиях, продемонстрировавших, что длительный прием антитромбогенных средств снижает риск сосудистых эпизодов [9]. Наиболее широкое применение в клинической практике нашли антиагрегантные препараты, относящиеся к ингибиторам циклооксигеназы
тромбоцитов — ацетилсалициловая кислота и блокаторы P2Y12-рецепторов—тиклопидин, клопидогрель, пра-сугрель, тикангрелор, кангрелор [8, 10]. Эти препараты проявляют различные механизмы действия, однако основной точкой приложения для данных лекарственных средств является стадия необратимой агрегации. Необходимо отметить также, что эти препараты обладают недостатками, к которым относится позднее наступление основного терапевтического эффекта, повышение риска кровотечений различного генеза, тромбоцитопения, нейтропения, аллергические реакции, а также развитие резистентности при длительных курсах
Выпуск 1 (53). 2015
89
лечения [4]. Это объясняет актуальность выявления и изучения новых соединений с антиагрегантной активностью. Как показали ранее проведенные исследования биологической активности производных бензимидазола в Волгоградском государственном медицинском университете, отдельные производные данного класса проявляют выраженную антиагрегантную активность [1,2]. Поэтому нам представилось интересным изучить способность новых производных этой трициклической системы, оказывать влияние на тромбогенный потенциал крови.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить антиагрегантную активность новых производных бензимидазола на модели АДФ-индуцирован-ной агрегации тромбоцитов in vitro.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В данной работе проведено экспериментальное исследование влияния 16 новых производных бензимидазола под шифром ДАБ [НИИ ФОХ ЮФУ] на процессы агрегации тромбоцитов in vitro.
Эксперименты выполнены на 9 кроликах, весом 3,0—3,5 кг. Острая токсичность определялась на 75 белых нелинейных мышах-самцах массой 20—22 г при внутрибрюшинном введении. Исследования проводили согласно методическим руководствам и нормативным документам (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96; правилам и Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997); правилам лабораторной практики (GLP) в Российской Федерации, утвержденным приказом Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. № 267). Животные содержались в условиях вивария (температура 22—24 °С, относительная влажность воздуха 40—50 %) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением правил качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). В течение 24 ч до экспериментов животные находились в условиях полной пищевой депривации со свободным доступом к воде. На момент проведения исследований все животные были здоровыми, без изменений поведения, режима сна и бодрствования, аппетита.
Для исследования была выбрана модель АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов по методу G. Born, в модификации В. А. Габбасова, воспроизведенная на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола» 220 LA (Россия) [13]. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно цент-
рифугировали в течение 15 мин при 3000 об./мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. В качестве индуктора агрегации использовали аденозин-5-дифос-форную кислоту (АДФ) («Serva», Венгрия), в конечной концентрации 5 мкМ. Соединения и препараты сравнения ацетилсалициловая кислота («Sigma», США) и тиклид («Sanofi-syntelabo», Франция) in vitro изучались в концентрации 100 мкМ. Уровень агрегации оценивался по значению степени агрегации, определяемой как максимальное приращение светопропускания после добавления индуктора. Для оценки активности соединений определяли Д % ингибирования функциональной активности тромбоцитов. Для расчета индекса EC50 (эффективная концентрация, подавляющая процесс агрегации тромбоцитов на 50 %), который проводили с использованием метода регрессионного анализа, вещества изучались в концентрации 100, 10 и 1 мкМ.
Исследование токсичности наиболее активных соединений выполнялось в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития [6]. Острая токсичность определялась на 65 белых нелинейных мышах-самцах массой 20—22 г при внутрибрюшинном введении. Гибель животных регистрировалась в течение двух недель. Величину токсикологического показателя — LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона.
Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием критерия Манна-Уитни при помощи пакета статистических программ программного обеспечения Microsoft Excell 2006.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате исследования было показано, что новые производные бензимидазола оказывают анти-агрегантный эффект in vitro в различной степени выраженности.
При исследовании соединений в концентрации 100 мкМ было установлено выраженное антиагрега-ционное действия у соединений под шифрами ДАБ-4, ДАБ-7, ДАБ-9, ДАБ-12, ДАБ-13, ДАБ-14, ДАБ-15, ДАБ-25 и ДАБ-26. Ингибирование агрегации тромбоцитов под влиянием этих соединений превышало 50 %. При этом вещества ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15 по своей активности достоверно превосходили препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту и оказывали эффект, сравнимый с эффектом тиклида. По антиагрегантной активности соединения ДАБ-7, ДАБ-12, ДАБ-20, ДАБ-21 ДАБ-22 и ДАБ-24 были сопоставимы друг с другом и c ацетилсалициловой кислотой, однако уступали тикпиду. Соединения ДАБ-5, ДАБ-8 и ДАБ-23 оказали самую низкую антитромбо-цитарную активность, ингибируя агрегацию тромбоцитов в концентрации 100 мкМ на 32,00, 40,29 и 40,99 % соответственно (табл. 1).
90
Выпуск 1 (53). 2015
Таблица 1
Влияние новых производных бензимидазола в концентрации 100 мкМ, ацетилсалициловой кислоты (АСК) и тиклида на АДФ-индуцированную (5 мкМ) агрегацию тромбоцитов (М ± т)
№ п/п Шифр соединения Ингибирование агрегации тромбоцитов А % (М ± m) в концентрации 100 мкМ
1 ДАБ-4 72,16 ± 6,40*#
2 ДАБ-5 32,8 ± 3,20*
3 ДАБ-7 54,33 ± 3,70*
4 ДАБ-8 40,29 ± 4,30*
5 ДАБ-9 69,84 ± 3,10*#
6 ДАБ-12 50,83 ± 5,30*
7 ДАБ-13 81,57 ± 7,40*#
8 ДАБ-14 87,33 ± 8,30*#
9 ДАБ-15 81,21 ± 4,10*#
10 ДАБ-20 44,52 ± 3,80*
11 ДАБ-21 47,66 ± 7,10*
12 ДАБ-22 49,27 ± 5,90*
13 ДАБ-23 40,99 ± 4,40*
14 ДАБ-24 46,58 ± 4,10*
15 ДАБ-25 59,54 ± 8,50*
16 ДАБ-26 50,96 ± 5,30*
17 АСК 52,06 ± 4,20*
18 Тиклид 80,9 ± 2,70*
*р < 0,05 — изменения статистически достоверны по сравнению с исходными показателями;
#изменения статистически достоверны по сравнению с АСК.
Исследование влияния наиболее активных веществ на агрегацию тромбоцитов в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкМ выявило дозозависимый эффект, в результате которого 8 из 16 изученных соединений по эффективной концентрации (IC50) превосходили препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту. При этом вещества
под шифрами ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15 проявили наибольшую антиагрегантную активность in vitro, превосходя ацетилсалициловую кислоту в 57, 58 и 65 раз соответственно. Однако при этом данные соединения уступали другому препарату сравнения тиклопидину в 1,8, 1,7 и 1,5 раза соответственно (табл. 2).
Далее была изучена острая токсичность трех наиболее активных соединений под шифрами ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15. Соединение ДАБ-13 в дозировке 100 мг/кг вызывало летальный исход у 100 % подопытных животных. LD50 веществ под шифрами ДАБ-14 и ДАБ-15 составила 113 и 115 мг/кг соответственно, и для них был рассчитан условный терапевтический индекс (УТИ) (табл. 3).
Таким образом, соединения ДАБ-14 и ДАБ-15 по УТИ превосходят ацетилсалициловую кислоту в 2,4 и 3,4 раза соответственно, однако в 6,2 и 4,4 раза уступают тикпиду.
Далее была изучена зависимость антиагрегантного действия новых производных бензимидазола от их химической структуры. Так как в целом все изученные вещества ингибировали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro и отличались лишь по степени выраженности эффекта, можно предположить, что в антиагрегантную активность данного класса вносит положительное влияние базовая структура.
Анализ влияния заместителей на высокий уровень антиагрегантной активности новых производных бензимидазола производился для заместителей в положении 1. В группе веществ, относящихся к данному ряду соединений, значимый вклад в антиагрегантную активность, по-видимому, вносят метоксифеноксиэтильный и фторбензильный заместители.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате изучения 16 новых производных бензимидазола на предмет ингибирования агрегации тром-
Таблица2
Эффективная концентрация (ЭК50) производных бензимидазола (М ± т)
№ п/п Шифр соединения А % ингибирования агрегации тромбоцитов (по трем опытам) в концентрациях: ЕС 50, М
100 мкМ 10 мкМ 1 мкМ
1 ДАБ-4 72,16 ± 6,4*# 39,5 ± 3,1*# 30,9 ± 4,9*# 1,3 х 10'э
2 ДАБ-7 54,33 ± 3,7* 31,55* 21,25*# 7,3 х 10'э
3 ДАБ-9 69,84 ± 3,1*# 33,18 ± 6,2* 24,26 ± 3,1*# 2,14 х 10'э
4 ДАБ-12 50,83 ± 5,3* 30,42 ± 4,3* 20,5 ± 2,9*# 1,15 х 10'э
5 ДАБ-13 81,57 ± 7,4*# 41,72 ± 2,1*# 37,13 ± 4,6*# 7,0 х 10'°
6 ДАБ-14 87,33 ± 8,3*# 44,3 ± 5,1*# 32,18 ± 4,2*# 6,8 х 10'°
7 ДАБ-15 81,21 ± 4,1*# 48,06 ± 3,6*# 35,43 ± 5,3*# 6,1 х 10‘6
8 ДАБ-25 59,54 ± 8,5* 46,74 ± 3,1*# 32,25 ± 4,8*# 1,9 х 10‘э
9 ДАБ-26 50,96 ± 5,3* 38,35 ± 2,9*# 34,75 ± 3,6*# 1,2 х 10‘4
10 АСК 52,06 ± 4,2* 20,8 ± 3,5* 4,6 ± 1,7 1,04 х 10‘4
11 Тиклид 80,9 ± 2,7* 55,7 ± 1,2* 39,04 ± 1,2* 3,9 х 10‘6
*р < 0,05, изменения статистически значимы по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни;
#р < 0,05, изменения статистически значимы по отношению к эффекту препарата сравнения ацетилсалициловой кислоты.
Выпуск 1 (53). 2015
91
Таблица 3
Антиагрегантная активность (ЭК50), величина острой суточной токсичности (ЛД50), и терапевтический индекс (УТИ) соединений ДАБ-14 , ДАБ-15, ацетилсалициловой кислоты (АСК) и тиклида
№ п/п Шифр соединения гп о СП о LD50, мг/кг УТИ LD5o/EC5o
1 ДАБ-14 6,8 х 10'6 113 39,78
2 ДАБ-15 6,1 х 10'° 115 56,9
3 АСК 1,04 х 10‘4 310 16,9
4 Тиклид 3,9 х 10‘6 300 250,0
боцитов in vitro показано, что данный подкласс является перспективным для изучения данного вида активности.
Были найдены высокоактивные соединения под шифрами ДАБ-14 и ДАБ-15, которые по условному терапевтическому индексу превосходят препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту в 2,4 и 3,4 раза соответственно, что свидетельствует о целесообразности дальнейшего более углубленного фармакологического изучения данных соединений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимова В.А., Спасов А.А., Островский О.В. и др. Синтез и фармакологическая активность 3-(аро-ил) и 3-(гетароил)имидазо[1,2-а]бензимидазолов // Химико-фармацевтический журнал. — 2002. — Т. 36. — № 12. — С. 3—8.
2. Анисимова В. А., Спасов А. А., Толпыгин И. Е. и др. Синтез и фармакологическая активность солей 3-аце-тил-2-R^ диалкиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимида-золов // Химико-фармацевтический журнал. — 2010. — Т 44. — № 3. — С. 8—13.
3. Габбасов З. А., Попов Е. Г., Гаврилова И. Ю. и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов // Лабораторное дело. — 1989. — № 10. — С. 15—18.
4. Грицан Г. В. Резистентность к аспирину у больных с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу / Г. В. Грицан, И. А. Ольховский, М. А. Столяр, Ю. В. Косницкая // Сибирское медицинское обозрение. — 2013. — № 4. — С. 19—23.
5. Мельникова Е., Кадинская М., Гзрасименко Д. и др. Патология гемостаза и системная воспалительная реакция у пациентов с ишемическим инсультом // Врач. — 2011. — № 14. — С. 15—18.
6. Миронов А. Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств // Под общ. ред. д. м. н. А. Н. Миронова. — М., 2012. — С. 939.
7. Спасов А.А., Недогода В.В., Конан К. и др. Механизм снижения чувствительности тромбоцитов к лекарственным средствам под влиянием низкоэнергетического лазерного облучения крови // Гематология и трансфузиология. — 2001. — № 2. — С. 36—39.
8. Толпыгина С. Н. Применение ацетилсалициловой кислоты с целью первичной и вторичной профилактики у пациентов с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений / С. Н. Толпыгина, С. Ю. Марцевич, Н. В. Киселева, Е. Н. Хосева // Сердце: журнал для практикующих врачей. — 2011. — № 6. — С. 358—365.
9. Angiolillo D. J. , Capodanno D., Goto S. Platelet thrombin receptor antagonism and atherothrombosis // Eur Heart J. — 2010. — № 31 (1). — P 17—28.
10. Fiedler K. A. Randomised, double-blind trial on the value of tapered discontinuation of clopidogrel maintenance therapy after drug-eluting stent implantation. Intracoronary Stenting and Antithrombotic Regimen: CAUTЮN in Discontinuing dopidogrel Therapy — ISAR^AUTION / K. A. Fiedler, J. Mehilli, S. Kufner, A. Schlichting, et al. // Thromb. Haemost. — 2014. — № 111 (6). — P 1041—1049.
11. Jennings L. K. Mechanisms of platelet activation: need for new strategies to protect against platelet-mediated atherothrombosis // Thromb. Haemost. — 2009. — № 102 (2). — P. 248—257.
Контактная информация
Кучерявенко Аида Фатиховна — д. м. н.,
доцент кафедры фармакологии, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: aidakucheryavenko@yandex.ru
92
Выпуск 1 (53). 2015
