CC BY
74
38 БИОТЕРАПИЯ
УДК 577.115:616-097:615.015.44
E. V Tolcheva1, A. Yu. Barishnikov1, N. A. Oborotova1, M. A. Kortava1, K. A. Barishnikov1,
D. Mongait2, T. S. Levchenko2, V. P. Torchilin2
ANTI-CD5-IMMUNOLIPOSOMES AS A TRANSPORT SYSTEM FOR TARGET DRUG DELIVERY TO CD5+-CELLS
1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2 Department of Pharmaceutical Sciences, Northeastern University, Boston, MA
ABSTRACT
One of the ways decreasing a side effect of antitumor drugs on normal cells and increasing their therapeutic effect is a target drugs delivery to tumor cells by means of immunoliposomes. In this study anti-CD5-immunoliposomes as a model system for target transport to CD5+-cells were obtained. Monoclonal antibodies ICO8O directed against CD5-anti-gen were attached to distal terminals of polyethyleneglycol chains. The capacity of immunoliposomes to bind to were checked on MOLT4 cell line. Binding specificity has been proved by CD5-receptor blockade by unlabeled antibodies, by correlation of percentage of antigen positive cells identified by ICO8O and by percentage of the cells bound to immunoliposomes, and also by the absence of immunoliposomes reaction with granulocytes.
Key words: immunoliposomes, antigen CD5, target drug delivery, sterically protected liposomes.
Е. В. Толчева1, А. Ю. Барышников1, Н. А. Оборотова1, М. А. Кортава1, К. А. Барышников1,
Д. Монгайт2, Т. С. Левченко2, В. П. Торчилин2
АНТИ-СБ5-ИММУНОЛИПОСОМЫ КАК ТРАНСПОРТНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ К СБ5+-КЛЕТКАМ
1 ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
2 Северо-восточный университет, Бостон, штат 'Массачусетс
РЕЗЮМЕ
Одним из способов, позволяющих уменьшить побочное действие на нормальные клетки и увеличить терапевтический эффект противоопухолевых химиопрепаратов, является адресная доставка препаратов к опухолевым клеткам с помощью иммунолипосом. В данной работе были получены анти-С05-иммунолипосомы в качестве модельной системы для направленного транспорта к С05+-клеткам. Моноклональные антитела 1С080, направленные против антигена СЭ5, были присоединены к дистальным концам цепей полиэтиленгликоля. Способность иммунолипосом специфически связываться с СЭ5-антигеном была проверена на клеточной линии М0СГ4. Специфичность связывания была подтверждена блокадой СЭ5-рецептора немечеными антителами, корреляцией процента антигенположительных клеток, выявляемых 1С080, и процентом клеток, связавшихся с иммунолипосомами, а также отсутствием реакции иммунолипосом с гранулоцитами.
Ключевые слова: иммунолипосомы, антиген СЭ5, направленная доставка, пространственно стабилизированные липосомы.
ВВЕДЕНИЕ
Противоопухолевые лекарственные препараты обладают различными побочными эффектами вследствие их токсичности как для опухолевых, так и нормальных клеток. Один из способов, позволяющих уменьшить побочное действие на нормальные клетки и увеличить терапевтический эффект лекарственных
средств, — это доставка препаратов с помощью липо-сом. Направленный транспорт липосом к опухолевым клеткам является актуальной задачей, т. к. это позволит селективно доставлять лекарственные соединения к клетке. Использование иммунолипосом для адресной доставки лекарства — один из путей выполнения данной задачи. Иммунолипосомы представляют собой
липосомы, на поверхности которых расположены антитела.
Доставка лекарственного препарата с помощью иммунолипосом представляет собой технологию, которая может быть использована для направленного воздействия на отдельные органы и ткани. Так, например, были получены иммунолипосомы, избирательно действующие на клетки головного мозга [11], легкого [16], молочной железы [12], ВИЧ-инфицированные клетки [8, 25, 26], клетки иммунной системы [6], а также на другие клетки-мишени. Специфическая доставка осуществляется за счет высокоаффинного связывания моноклональных антител с их специфическими антигенами. Эффективность метода зависит, во-первых, от специфичности лиганда (антитела) и, во-вторых, от проникновения липосомы в клетку и от внутриклеточной доставки липосо-мального содержимого.
Присоединение молекул антител к поверхности «классической» липосомы приводит к их быстрому удалению из кровотока благодаря действию клеток ре-тикуло эндотелиальной системы (РЭС) [4, 18].
Для преодоления захвата липосом мононуклеарами РЭС были разработаны «липосомы-невидимки» («stealth liposomes»). С этой целью поверхность липо-сом модифицировали полиэтиленгликолем (ПЭГ, PEG)
— полимером с гибкой гидрофильной цепью [18, 19, 23] — путем встраивания полиэтиленгликоль-липид-ных конъюгатов в липидный бислой. Молекулы антител могут быть ковалентно связаны с поверхностью липосомы посредством короткого якоря [5, 15] или прикреплены к дистальным концам цепей ПЭГ [3, 11, 17]. Использование ПЭГ как линкера между липосо-мой и антителом является более предпочтительным, т. к. антитело не экранировано пространственным барьером нитей полимера и может свободно взаимодействовать с антигеном на поверхности клетки-мишени [3]. Было разработано несколько методов нековалентного (через образование комплекса биотин-авидин) и ковалентного присоединения молекул антител к ПЭГ. Для этого использовали ПЭГ-липидные конъюгаты с концевыми группами, активированными посредством биотина [10, 20], гидразида, №3’-(пиридил-дитио)пропионата [13], малеимида [10, 13], сукцини-лового эфира [2]. Кроме того, антитела могут быть присоединены к концевым карбоксильным группам ПЭГ карбодиимидным методом [5]. Все перечисленные способы, однако, требуют предварительной модификации антитела или подразумевают использование токсичных реагентов. Для одностадийного присоединения лигандов, содержащих N^-группу (включая белки, пептиды и другие молекулы), к дистальным концам цепей ПЭГ в отсутствии каких-либо токсичных реагентов было предложено использовать п-нит-рофениловый эфир ПЭГ-липидного конъюгата (pNP-PEG-Lipid) [21]. п-нитрофенилкарбонил-ПЭГ-липид-ный конъюгат связывается с любым NH2-содержащим лигандом с образованием стабильной и нетоксичной карбаматной (уретановой) связи [14, 21].
В нашем исследовании в качестве векторной модели были использованы моноклональные антитела ICO80 против антигена CD5. Антиген CD5 является мономерным гликопротеидом с молекулярной массой 67 кДа, экспрессированным на всех этапах дифферен-цировки Т-лимфоцитов [1]. Плотность антигена на поверхности клеток повышается в процессе дифферен-цировки. Он также найден на субпопуляции В-клеток. Было обнаружено, что антиген CD5 интернализуется после связывания с антителом. Это может способствовать проникновению липосомы в клетку и, тем самым, доставке лекарственного средства во внутриклеточное пространство.
Цель настоящей работы — получить иммуноли-посомы и показать их специфическое связывание с CD5-антигеном. В качестве модельной системы для тестирования иммунолипосом были использованы клеточные линии MOLT4 (Т-лимфобласты, острый лимфобластный лейкоз) и лимфоциты периферической крови здоровых доноров. В данной работе для присоединения антител к липосомальной поверхности был выбран метод, основанный на использовании п-нитрофенилового эфира ПЭГ-липидного конъюгата (п-нитрофениловый эфир ПЭГ-диолеоилфосфатиди-лэтаноламина), как способ, не требующий предварительной модификации антитела.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
L-a-фосфатидилхолин (PC, egg, chicken) (Avanti Polar Lipids), холестерол (Chol) (Sigma), 1,2-дистеаро-ил^п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин-К-[меток-си(полиэтиленгликоль(MW 2000)] (mPEG2000-DSPE) (Avanti Polar Lipids), сукцинимидный эфир 5-(и-6)-кар-боксифлюоресцеина (Carboxyfluorescein, succinimidyl ester) (CF) (Molecular Probes), ^-диолеоил^-глицеро-З-фосфатидилэтаноламин^-(карбоксифлюоресцеин) (DOPE-CF) (Avanti Polar Lipids), ^-диолеоил^-гли-церо-3-фосфатидилэтаноламин^-[п-нитрофенилкар-бонил (полиэтиленгликоль (MW 3400)] (pNP-PEG3400-DOPE) (Department of Pharmaceutical Sciences, Bouve College of Health Sciences, Northeastern University, Boston, MA 02115, USA), моноклональные антитела ICO80 (анти^5) (получены в ГУ НИИ РОНЦ им.
Н. Н. Блохина РАМН), n-октил-ß-D-глюкопиранозид (Sigma), клеточная линия MOLT4 (Т-лимфобласты, острый лимфобластный лейкоз) (American Type Culture Collection, Manassas, VA), моноклональные антитела анти-CD20 (ICO 180) (МедБиоСпектр), клеточная линия MOLT4 (Т-лимфобласты, острый лимфобластный лейкоз; ATCC Number: CRL-1582).
1. Приготовление липосом.
Липосомы были приготовлены из следующих липидов: PC, Chol, mPEG2000-DSPE (мольное соотношение компонентов 2:1:0.15). Для этого липидную пленку суспендировали в буферном растворе, содержащем 5 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, рН 7,4, и озвучивали в течение 20 мин при слабом нагревании, затем пропускали последовательно через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 и 100 нм (Nuclepore) посредством
мини-экструдера (Avanti Polar Lipids) [22]. Размер полученных липосомальных частиц определяли методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размера частиц (Coulter N4+ MD Submicron Particle Size Analyzer, Beckman Coulter). Общая концентрация липидов составляла от 5 до 20 мг/мл, размер полученных частиц — 110+5 нм.
Аналогичным методом получали флюоресценто меченные липосомы, содержащие PC, Chol, mPEG2000-DSPE и DOPE-CF (молльное соотношение компонентов 2:1:0,15:0,03).
2. Получение флюоресцентно меченных антител ICO80 (ICO80-CF).
Для определения количества антител IC080, связавшихся с активированным ПЭГ-липидным конъюгатом (pNP-PEG3400-D0PE), антитела были помечены флюоресцентным красителем, карбоксифлюоресцеи-ном (CF). Для этого раствор антител IC080 диализова-ли против карбонатного буферного раствора (pH 8,3) в течение ночи при температуре 4 °C при постоянном перемешивании (диализные мешки с MWC0 12-14000 Да). Концентрацию белка после диализа определяли по поглощению при 280 нм. К раствору антител добавляли сукцинимидный эфир карбоксифлюо-ресцеина, растворенный в ДМСО (диметилсульфок-сид), из расчета на 1 мг белка 0,5-1мг флюоресцентной метки. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение часа при постоянном перемешивании в темноте [9]. Для удаления непрореагировавшей флюоресцентной метки реакционную смесь диализовали против карбонатного буферного раствора (pH 9,0) в течение ночи при температуре 4 °C при постоянном перемешивании.
3. Присоединение антител к активированному ПЭГ-липидному конъюгату.
Антитела IC080 (меченные CF или немеченые), растворенные в карбонатном буферном растворе, pH 9,0 (концентрация IC080 — 0,5-2 мг/мл), добавляли к pNP-PEG3400-D0PE, растворенному в Na-цитратном буферном растворе (рН 5,0), содержащем 10 мг/мл n-октил-Р^-глюкопиранозид, варьируя молльное соотношение белок/pNP-PEGз400-DOPE от 1:20 до 1:40 соответственно [14, 21]. Реакционную смесь инкубировали при рН 8,8 в течение суток при температуре 4 °C при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
4. Приготовление иммунолипосом.
Пространственно стабилизированные анти-
CD5-иммунолипосомы получали путем встраивания антитело-ПЭГ-липидного конъюгата в липосомы. Такой конъюгат включался в липосомальный бислой благодаря своей липидной составляющей. Для этого реакционную смесь CF-IC080-PEG3400-D0PE (см. п. 3) и предварительно приготовленные пэгилированные липосомы (см. п. 1) инкубировали в течение ночи при температур 4 °C при постоянном перемешивании [14]. Несвязанные молекулы антител и п-октил-Р^-глюко-пиранозид удаляли посредством диализа против бу-
ферного раствора, содержащего 5 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, рН 7,4, в течение 2 сут при температуре 4 °С при постоянном перемешивании (с 5-кратной сменой буферного раствора). При этом использовали диализные мешки с размером пор 300 кДа. Удаление свободного белка проверяли методом гель-фильтрации на носителе Sepharose CL-4B. Размер полученных иммунолипосом составил 140+10 нм.
Аналогичным методом получали флюоресцентно меченные липосомы, содержащие IC080-PEG3400-DOPE (липосомы помечены с помощью DOPE-CF).
5. Определение количества белка, связанного с ли-посомалъной поверхностью.
Количество флюоресцентно меченного белка, связанного с поверхностью липосомы [7], определяли по флюоресценции с помощью флюоресцентного спектрофотометра (Hitachi F-2000, Hitachi Instruments, Schaumburg, IL) в присутствии тритон Х-100.
6. Проверка специфической активности анти-СВ5-иммунолипосом на клеточной линии MOLT4.
Клеточную линию M0LT4 вели в культуральной среде RPMI 1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (Fetal Bovine Serum), 2 мМ L-глутамина и 1 % амфотерицина Б при температуре 37 °C и 5 % С02.
6.1. Способность антител IC080 специфически связываться c антигеном CD5, экспрессированным на поверхности клеток M0LT4, проверяли с помощью реакции иммунофлюоресценции по стандартной методике. Для этого клетки M0LT4 дважды отмывали и ре-суспендировали в фосфатном буферном растворе, содержащем 10 мМ Na2HP04, 1,8 мМ KH2P04, 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,4 (PBS), 1 % бычьего сывороточного альбумина (для уменьшения неспецифического связывания). Клетки (0,5+1х106) инкубировали с IC080-CF в течение 30 мин в темноте при 4 °C. После этого клетки дважды отмывали фосфатным буферным раствором (рН 7,4) от несвязавшихся антител и фиксировали раствором 1% формалина.
Аналогичным методом проверяли специфическую активность CF-IC080-SL, IC080-SL-CF.
6.2. Специфическую активность анти-CD5-имму-нолипосом проверяли методом конкурентного связывания. Метод основан на ингибировании связывания иммунолипосом с клетками при добавлении антител, способных специфически узнавать антиген на поверхности клеток-мишеней, иными словами, конкурировать за сайты специфического связывания. С целью ингибировать связывание иммунолипосом клетки инкубировали в течение 30 мин с избытком немеченых антител IC080. В качестве отрицательного контроля клетки инкубировали в течение 30 мин с неспецифическими к антигену CD5 антителами — анти-CD20 (против В-клеточных антигенов). Затем к клеткам добавляли флюоресцентно меченные иммунолипосомы и инкубировали 30 мин в темноте при температуре 4 °C. После этого клетки дважды отмывали PBS от не-связавшихся антител и фиксировали раствором 1% формалина в PBS.
Клетки также анализировали на проточном цито-флюориметре FACSCan (Becton Dickinson, США).
7. Проверка специфической активности анти-СВ5-иммунолипосом на лимфоцитах периферической крови доноров.
Способность антител, связанных с поверхностью пространственно стабилизированных липосом, специфически соединяться с антигеном CD5, экспрессированным на поверхности Т-лимфоцитов периферической крови доноров, проверяли с помощью реакции иммунофлюоресценции по стандартной методике.
Клетки крови анализировали на проточном цито-флуориметре FACSCan (Becton Dickinson, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для предотвращения экранирования молекул антител цепями полимера (mPEG2ooo), расположенного на поверхности липосомы и защищающего ее от действия клеток РЭС, было предложено использовать полимерный линкер между липидом и белком PEG3400, превышающий по своей длине полимерные нити mPEG2000 [14, 21]. Опубликованная ранее схема с использованием п-нитрофенилового эфира ПЭГ-липид-ного конъюгата для получения иммунолипосом позволяет присоединять лиганд к пэгилированному липиду в одну стадию, т. е. не требует предварительной модификации белка, а также не подразумевает использование токсичных реагентов. При рН среды, близком к нейтральному, скорость гидролиза pNP-PEG-Lipid сопоставима со скоростью аминолиза (присоединения лиганда к PEG-Lipid) [21, 24]. При щелочных значениях рН реакция протекает преимущественно с образованием белок-ПЭГ-липидного конъюгата. Однако не все антитела сохраняют свою специфическую активность при щелочных значениях рН среды. Химическая модификация антител также может привести к снижению их специфической активности, что будет отрицательно сказываться на способности иммунолипосом осуществлять направленную доставку лекарственных препаратов к клеткам.
В нашем исследовании в качестве векторной модели были использованы моноклональные антитела IC080 против антигена CD5. Присоединение иммуноглобулина к ПЭГ-липидному конъюгату проводили согласно известной методике [21] и определяли количество молекул антител, связавшихся с одной липосомой. Количество молекул белка, приходящееся на одну ли-посому, варьировало от 33 до 82 в зависимости от соотношения белок/ПЭГ-липид и от концентрации каждого из компонентов. Для проверки специфической активности антител, связанных с поверхностью липосом, были использованы клеточные линии M0LT4 и клетки периферической крови здоровых доноров.
Было обнаружено, что полученные нами иммуно-липосомы специфически связываются с CD5+-клетка-ми (рис. 1 и 2). На рис. 1 показаны результаты флюоресцентного окрашивания клеток с помощью иммуно-липосом, в которых метка расположена на молекуле белка, на рис. 2 — окрашивание клеток иммунолипо-
сомами, где метка присоединена к поверхности липо-сомы. Специфичность связывания иммунолипосом с клетками проверяли методом блокады С05-рецепто-ра немечеными антителами 1С080. Оказалось, что блокирование рецептора препятствует соединению иммунолипосом, меченных карбоксифлюоресцеином, с клетками (рис. 3). В то же время присутствие избытка немеченых моноклональных антител анти-СЭ20 В-лимфоцитов человека не мешает связыванию иммунолипосом. Не происходит соединения с клетками контрольных пэгилированных липосом, не содержащих моноклональные антитела (см. рис. 1, 2 и 3).
1.Cells MOLT4
2.FAM-SL
3.FAM-IC080-SL
Рис. 1. Анализ специфического связывания анти-С05-иммунолипосом с клетками МОСГ4 методом проточной цитофлюориметрии:
А — сравнительная гистограммная характеристика: по оси абсцисс — количество клеток, по оси ординат — интенсивность флюоресценции; Б — результат статистической обработки данных; 1 — неокрашенные клетки МОСГ4; 2 — связывание с клетками пространственно стабилизированных липосом, меченных кар-боксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к липиду), 8Ь-СБ; 3 — связывание с клетками пространственно стабилизированных иммунолипо-сом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к белку), СБ-1СО80-8Ь
Способность 1СО80-иммунолипосом избирательно связываться с СЭ5-антигеном на поверхности лимфоцитов периферической крови здоровых доноров показана на рис. 4. Среди популяции лимфоцитов периферической крови 65-70 % лимфоцитов являются СЭ5+ (рис. 4, Б). Было показано, что иммунолипосомы связываются с 65-70 % лимфоцитов периферической
ЦІ
з
(J
1.Cells MOLT4
2.FAM-SL 3.IC080-SL-FAM
Рис. 2. Анализ специфического связывания анти-С05-иммунолипосом с клетками MOLT4 методом проточной цитофлюориметрии:
А — сравнительная гистограммная характеристика: по оси абсцисс — количество клеток, по оси ординат — интенсивность флюоресценции; Б — результат статистической обработки данных; 1 — неокрашенные клетки MOLT4; 2 — связывание с клетками пространственно стабилизированных липосом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к липиду), SL-CF; 3 — связывание с клетками пространственно стабилизированных иммуноли-посом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к липиду), ICO80-SL-CF
крови донора. В анализируемых образцах периферической крови присутствовало 62,5 % Т-лимфоцитов (рис. 4, В). На рис. 4, Г видно, что иммунолипосомы не взаимодействуют с гранулоцитами, что также доказывает селективность связывания 1С080-иммунолипо-сом с клетками, на поверхности которых экспрессирован антиген CD5.
ВЫВОДЫ
Таким образом, нами были получены иммуноли-посомы, содержащие на дистальных концах цепей по-лиэтиленгликоля моноклональные антитела ICO80, направленные против антигена CD5. Конъюгация антител с липидом не повлияла на их способность специфически связываться с CD5+-клетками. Специфичность связывания была подтверждена блокадой CD5-рецептора немечеными антителами, корреляцией процента антигенположительных клеток, выявляемых
Рис. 3. Анализ конкурентного связывания анти-СЭ5-иммунолипосом с клетками МОСГ4 методом проточной цитофлюориметрии:
1 — неокрашенные клетки; 2 — связывание с клетками пространственно стабилизированных им-мунолипосом, меченных карбоксифлюоресцеином (СБ-1СО80-8Ь); 3 — связывание флюоресцентно меченных иммунолипосом с клетками в присутствии избытка немеченых антител ІСО80; 4 — связывание флюоресцентно меченных иммунолипосом с клетками в присутствии избытка немеченых антител СЭ20; 5 — связывание с клетками пространственно стабилизированных липосом, меченных карбоксифлюоресцеи-ном(СБ-8Ь)
Рис. 4. Анализ специфического связывания анти-СЭ5-иммунолипосом с клетками периферической крови здоровых доноров методом проточной цитофлюо-риметрии:
А — неокрашенные клетки (лимфоциты); Б — связывание моноклональных антител СБ-ІСО80 с лимфоцитами; В — связывание пространственно стабилизированных иммунолипосом, меченных СБ, с лимфоцитами (СБ-ІСО80-8Ь); Г — связывание пространственно стабилизированных иммунолипосом, меченных СБ, с гранулоцитами (СБ-ІСО80-8Ь)
IC080, и процентом клеток, связавшихся с иммуноли-посомами, а также отсутствием реакции иммунолипо-сом с гранулоцитами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А. Ю., Тоневицкий А. Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. — М., 1997. — 212 с.
2. Abuchowski A., Kazo G. M., Verhoest C. R. et al. Cancer therapy with chemically modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene glycol-asparagi-nase conjugates // Cancer Biochem. Biphys. — 1984. — Vol. 7. — P. 175-186.
3. Allen T. M., Brandeis E., Hansen C. B. et al. A new strategy for attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells // Biochim. Biophys. Acta. — 1995. — Vol. 1237. — P. 99-108.
4. Aragnol D., Leserman L. D. Immune clearance of liposomes inhibited by an anti-Fc receptor antibody in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. — Vol. 83. — P. 2699-2703.
5. Bogdanov A. A., Klibanov A. L., Torchilin V. P. Protein immobilization on the surface of liposomes via carbodiimide activation in the presence of N-hydroxysul-fosuccinimide // FEBS Lett. — 1988. — Vol. 231, No. 2.
— P. 381-384.
6. Dufresne I., Desormeaux A., Bestman-Smith J. et al. Targeting lymph nodes with liposomes bearing anti-HLA-DR Fab’ fragments // Biochim. Biophys. Acta. — 1999. — Vol. 1421. — P. 284-294.
7. Enoch H. G., Strittmatter P. Formation and properties of 1000-angstrom-diameter, single-bilayer phospholipids vesicles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1979. — Vol. 76, No. 1. — P. 145-149.
8. Gange J. F., Desormeaux A., Perron S. et al. Targeted delivery of indinavir to HIV-1 primary reservoirs with immunoliposomes // Biochim. Biophys. Acta. — 2002. — Vol. 1558. — P. 198-210.
9. Greg T. Hermanson. Bioconjugate Techniques. — Academic Press, 1996 — 785 p.
Hansen C. B., Kao G. Y., Moase E. H. et al. Attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes: evaluation, comparison and optimization of coupling procedures // Biochim. Biophys. Acta. — 1995. — Vol. 1239. — P. 133-144.
10. Huwyler J., Wu D., Pardridge W. M. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 93. — P. 14164-14169.
11. Kirpotin D., Park J. W., Hong K. et al. Sterically stabilized anti-HER2 immunoliposomes: design and targeting to human breast cancer cells in vitro // Biochemestry — 1997. — Vol. 36. — P. 66-75.
12. Lasic D. D. Recent developments in medical
applications of liposomes: sterically stabilized
liposomes in cancer therapy and gene delivery in vivo // J. Control. Release. — 1997. — Vol. 48. — P. 203-222.
13. Lukyanov A. N., Elbayoumi T. A., Torchilin V. P. et al. Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anti-cancer antybody // J. Control. Release. — 2004. — Vol. 100. — P. 135-144.
14. Martin F. J., Papahadjopoulos D. Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to performed vesicles. An improved method for liposome targeting // J. Biol. Chem. — 1982. — Vol. 257. — P. 286-288.
15. Marujama K., Holmberg E., Kennel S. J. et al. Characterization of in vivo immunoliposome targeting to pulmonary endothelium // J. Pharm. Sci. — 1990. — Vol. 79. — P. 978-984.
16. Maruyama K., Takizawa T., Yuda T. et al. Targetability of novel immunoliposomes modified with amphipathic poly(ethylene glycol)s conjugated at their distal terminals to monoclonal antibodies // Biochim. Biophys. Acta. — 1995. — Vol. 1234. — P. 74-80.
17. Monfardini C., Veronece F. M. Stabilization of substances in circulation // Bioconjugate Chem. — 1998.
— Vol. 9 — P. 418-450.
18. Papahadjopoulos D., Allen T. M., Gabizon A. et al. Sterically stabilized liposomes: improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1991. — Vol. 88. — P. 11460-11464.
19. Schnyder A., Krahenbuhl S., Torok M. et al. Targeting of skeletal muscle in vitro using biotinylated immunoliposomes // Biochem. J. — 2004. — Vol. 377. — P. 61-67.
20. 1. Torchilin V. P., Levchenko T. S., Lukyanov A. N. et al. p-Nitrophenylcarbonyl-PEG-PE-liposomes: fast and simple attachment of specific ligands, including monoclonal antibodies, to distal ends of PEG chains via p-nitro-phenylcarbonyl groups // Biochem. Biophys. Acta. — 2001. — Vol. 1511. — P. 397-411.
21. Torchilin V. P., Weissig V. Liposomes. A practical approach. — Oxford University Press, 2003. — 424 p.
1. Woodle M. C., LasicD. D. Sterically stabilized liposomes // Biochem. Biophys. Acta. — 1992. — Vol. 1113.
— P. 171.
22. Zalipsky S., Seltzer R., Menon-Rudolph S. Evaluation of a new reagent for covalent attachment of polyethylene glycol to proteins // Biotech. Appl. Biochem.
— 1992. — Vol. 15. — P. 100-114.
23. Zelphati O., Degols G., Loughrey H. et al. Inhibition of HIV-1 replication in cultured cells with phos-phorylated dideoxyuridine derivatives encapsulated in immunoliposomes // Antiviral Res. — 1993. — Vol. 21. — P. 181-185.
24. Zelphati O., Zon G., Leserman L. D. Inhibition of HIV-1 replication in cultured cells with antisense oligonucleotides encapsulated in immunoliposomes // Antisense Res. Dev. — 1993. — Vol. 3. — P. 323-338.
