Анти-M uC-1 иммунолипосомальная конструкция доксорубицина для направленной доставки в опухоль Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ АНТИ-MUC-l ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНАЯ КОНСТРУКЦИЯ... 99

УДК 615.277.3.015.44:576.5 Д.В. Соколова, Е.В. Тазина, М.А. Кортава, П.К. Иванов, Е.В. Игнатьева, А .П. Полозкова,

ЕМ. Трещалина, НА. Оборотова, А.Ю. Барышников

АНТИ-MUC-! ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДОКСОРУБИЦИНА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ В ОПУХОЛЬ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контактная информация

Соколова Дарина Вадимовна, канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-10-65 e-mail: d.v.sokolova@gmail.com

Статья поступила 19.04.2011., подписана в печать 05.05.2011.

Резюме

Направленная доставка цитостатиков с помощью иммунолипосомальных транспортных систем - один из путей реализации таргетной стратегии в противоопухолевой химиотерапии. MUC-1 - антиген, экспрессируемый на поверхности наиболее распространенных злокачественных опухолей человека, является привлекательной мишенью для действия «адресных» противоопухолевых препаратов. Целью настоящей работы являлось получение и изучение специфической активности in vitro иммунолипосомальной конструкции противоопухолевого антибиотика доксору-бицина, обладающей избирательностью действия по отношению к опухолям, экспрессирующим MUC-1 антиген-мишень. Иммунолипосомы получали методом обращения фаз из фосфолипидов, ПЭГ-липида, холестерина, активированного п-нитрофенилкарбонил-ПЭГ липида и с последующей загрузкой доксорубицина против градиента сульфата аммония. Включение доксорубицина в везикулы составило 87-94 %, диаметр везикул 140 ± 5 нм. Выявлен высокий уровень антигенспецифичности и цитотоксической активности полученных конструкций.

Ключевые слова: доксорубицин, иммунолипосомальные конструкции, моноклональные антитела, антиген-мишень, культуры клеток опухолей человека.

D.V. Sokolova, E.V. Tazina, M.A. Kortava, P.K. Ivanov, E. V Ignatieva,

A.P. Polozkova, E.M. Treshalina, N.A. Oborotova, А.Yu. Baryshnikov ANTI-MUC-1 IMMUNOLIPOSOMAL CONSTRUCTION LOADED WITH DOXORUBICIN FOR THE DIRECTED DELIVERY IN A TUMOR

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

Abstract

The directed delivery anticancer drugs by immunoliposomal transport systems are one of the ways to realize the target strategies. The MUC-1 antigen expressed on the surface of the most common human cancer is one of the attractive targets for directed delivery of anticancer drugs. The purpose of present work was preparation anti-MUC-1 immunoliposomal construction loaded with doxorubicin and assessment their specific activity in vitro. Immunoliposomal constructions were prepared by reverse evaporation method using phospholipids, lipid-grafted PEG cholesterol and activated PNp-PEG3000 lipid with their subsequent loading by doxorubicin based on the formation of ammonium gradient between the internal and external aqueous phase of liposomes. The efficacy of doxorubicin encapsulation in immu-noliposomes was 87-94 % the diameter of vesicles was 140 ± 5 nm. The high level of аntigen specificity and cytotoxic activity of this construction was obtained.

Key words: doxorubicin, immunoliposomal construction, monoclonal antibodies, human tumor cell cultures, target antigen.

Введение

Побочные эффекты ряда цитостатиков связаны с низкой избирательностью тумороцидного действия из-за отсутствия специфичности доставки в опухоль. Для достижения избирательности актуальными в настоящее время являются два направления:

1) поиск новых лекарственных препаратов, избирательно связывающихся с опухолевыми клетками (мишень-ориентированные, таргетные препараты), активная доставка;

2) совершенствование ЛФ, обеспечивающее иммобилизацию лекарственного вещества по пути доставки к мишени и улучшение биодоступности за счет особенностей неоангиогенеза в опухоли, пассивная доставка.

Последнее реализовалось в липосомальных ЛФ [1-4; 11]. В частности, созданы ЛФ доксорубицина (Докс) - Doxil (ALZA Corporation, США), Caelyx (Schering-Plough, Бельгия), Myocet (Elan Corporation, США), Липодокс (ЗАО Биолек, Украина), дауноруби-цина - DaunoXome (Gilead Sciences, Inc., США), вин-кристина - VincaXome (Gilead Sciences, Inc., США), Marqibo (Inex Pharmaceuticals Corporation, Канада; En-zon Pharmaceuticals, Inc., США; Hana Biosciences, Inc., США), цисплатина - Lipoplatin (Regulon, Inc., США), Липоплат (ЗАО Биолек, Украина), оксалиплатина -Lipoxal (Regulon, Inc., США), митоксантрона —LEM (NeoPharm, Inc., США), которые в настоящее время интенсивно изучаются в эксперименте [5-7; 12]. Для осуществления стратегии направленного транспорта лекарственного агента активно изучаются ИК, направленные к опухолеассоциированным поверхностным антигенам или рецепторам на опухолевых клетках.

В качестве векторных лигандов лучшими признаны МКА, пептиды или факторы роста, которые избирательно связываются с соответствующей мишенью [13: 14]. Одной из привлекательных мишеней для направленной доставки противоопухолевых препаратов представляет собой муциноподобный антиген MUC-1. Экспрессия гликопротеина выявлена в малигнизированных тканях молочной, щитовидной и предстательной желез, яичников, толстой и прямой кишок, матки, легких, пищевода, желудка и почек. Гиперэкспрессия антигена, как правило, сопровождается плохим прогнозом, что может быть обусловлено антиадгезивным действием гликопротеина, облегчающим процесс метастазирова-ния. Данная работа посвящена получению и изучению специфической активности in vitro ИК Докс, направленной против MUC-1+ опухолей.

Материалы и методы

Препараты и реактивы

1) Доксорубицина гидрохлорид (ОАО ОНОПБ, РФ);

2) п-нитрофенилкарбонил-ПЭГ-липид 3000 (PNp-PEG3000-lipid), (УнифектГрупп, РФ);

3) 1,2-дистеароил-5П-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгли-коль)-2000] (DSPE-PEG-2000) аммониевая соль;

4) холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США);

5) фосфатидилхолин (EPC) (Lipoid, Германия);

6) аммоний сернокислый (х.ч.), натрия хлорид (х.ч.) (Химмед, РФ);

7) HEPES(N-2-гидрокси-этилпиперазин-N'-2-этан-сульфоновая кислота), (AppliChem, Германия);

8) Sephadex G-50 superfine (Amersham Biosciences, Швеция);

9) МКА ICO-25 (НПЦ «МедБиоСпектр», РФ).

Приборы и аппаратура

Испаритель ротационный Rotavapor R-200 (BÜCHI Labortechnik AG, Швейцария), наносайзер Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США), мини-экструдер Avanti MiniExtruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США), поликар-бонатные фильтры Whatman (Великобритания), спектрофотометр СФ-46 (ЛОМО, Россия), хроматографическая колонка C 10/20, детектор UVis-920, рекордер REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция), перистальтический насос Liposomat (Dianorm Geräte, Германия), рН-метр Sartorius PP-20 (Sartorius, Германия), весы Sartorius LA 1200 S (Sartorius AG, Германия), анализатор Униплан (ЗАО Пикон, Россия), проточный цитофлуориметр FACS Calibur (Becton Dickinson, США), спектрофотометр Carry 100 (Varian, Inc., Австралия).

Клеточные линии опухолей человека В работе использовали линии карциномы молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 из Коллекции опухолевых штаммов и культур клеток РОНЦ. Клеточные линии культивировали в полной питательной среде при 37 °С в атмосфере 5%-ного СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста.

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием компьютерной программы BioStat 2008 (v5.2.5.0), Microsoft Excel. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.

Получение ИК Докс

Для приготовления липосом использовали метод обращения фаз.

Точные навески фосфатидилхолина, холестерина, 1,2-дистеароил-5Я-глицеро-3-фосфоэтано-ламина-№[мет-окси(полиэтилен-гликоля)-2000] (DSPE-PEG-2000) аммониевой соли и п-нитрофе-нил-карбонил-ПЭГ-липида (PNp-PEG3000-lipid) в мольных соотношениях 7,0 : 4,0 : 0,15 : 0,05 растворяли в хлороформе.

Смесь упаривали в круглодонной колбе на роторном испарителе под вакуумом при температуре не выше 32±2 °С до образования липидной пленки, которую гидратировали 125 мМ раствором сульфата аммония.

Полученную дисперсию многослойных ли-посом экструдировали через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 400; 200 и 100 нм при помощи ручного мини-экструдера. Инкапсулирование Докс в ИК осуществляли по принципу активной загрузки [10] с одновременной конъюгацией МКА ICO-25, добавленных исходя из мольного соотношения белок/pNP-PEG3000-lipid 1:40.

Весовое соотношение препарат : липиды составило 0,16 : 1,0. Очистку дисперсий от невклю-чившегося в везикулы препарата и не присоединившихся МКА проводили методом гель-фильтрации. Анализ среднего диаметра везикул и оценка их распределения по размерам проведена методом корреляционной спектроскопии светорассеяния.

Определение белка, связанного с поверхностью пустых пэгилированных ИК, очищенных от несвязавшихся МКА, проводили по общепринятому методу с использованием медного комплекса бицин-хониновой кислоты. Количественное содержание Докс в ИК определяли методом спектрофотометрии с использованием РСО Докс при X = 252 нм.

Исследование специфической активности

ИК Докс in vitro

Специфичность связывания с клетками-мишенями. Использовали метод непрямой РИФ. Анализ результатов реакции проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur с использованием программного обеспечения CELL Quest. В каждой пробе анализировали не менее 5000 событий.

Цитотоксическая активность (МТТ-тест). Для оценки способности ИК, загруженных Докс, избирательно доставлять лекарственный препарат к клеткам-мишеням исследуемые образцы инкубировали с клетками 1 ч при 4 °C.

После этого клетки отмывали и оставляли в СО2-инкубаторе при 37 °C и 5 %-ном содержании СО2 на 71 ч. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях.

Результаты и обсуждение

Разработка технологии получения

стерически стабилизированной ИК Докс

Технология включает получение больших многослойных и малых однослойных липосом; инкапсулирование препарата в везикулы с одновременной конъюгацией молекул векторных лигандов, очистку иммунолипосом от невключившегося препарата и несвязавшихся МКА и определение основных параметров полученных ИК, как то: размер везикул, включение препарата и количество МКА, связанных с липосомой.

Нами предложено молярное соотношение компонентов 7:4:0,15:0,05. В табл. 1 представлены значения концентрации липидов, использованных для получения модели многослойных липосом и их мольные соотношения.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ АНТИ-МиС-1 ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНАЯКОНСТРУКЦИЯ... 101

Таблица 1

Липидный состав больших многослойных липосом

Липид Молярная масса, г/моль Концентрация, г/мл Мольный %

Фосфатидилхолин 760,09 47,4 62,5

Холестерин 386,7 13,34 35,7

0БРЕ-РЕС2000 2805 3,73 1,3

рЫР-РЕС3000-^ 3850 1,67 0,44

Таблица 2

Содержание доксорубицина в различных фракциях

Образец О * ^ср О ** ^ср Докс

т РСО, мг Содержание в образце Эффективность включения препарата в везикулы, %

Исходная дисперсия липосом с Докс

1 0,624 0,63 0,7 X = 0,691 мг/мл Ах = 0,002 89,5-91,0

2 0,623

3 0,62

Исходная дисперсия ИК Докс

1 0,623 0,63 0,7 X = 0,695 мг/мл Ах = 0,002 92,0-94,9

2 0,627

3 0,628

I фракция липосом Докс

1 0,474 0,630 0,7 X = 0,622 мг Ах = 0,005 89,5-91,0

2 0,490

3 0,497

I фракция ИК Докс

1 0,505 0,630 0,7 X = 0,649 мг Ах = 0,005 92,0-94,9

2 0,507

3 0,486

* Среднее значение оптической плотности образца; ** оптическая плотность РСО Докс.

Таблица 3

Концентрации лекарственных форм, использованные в исследовании цитотоксического действия ИК Докс____

Лекарственная форма Стоковые Стах в лунке, мкг/мл Шаг разведения

С*, мг/мл объем, мл

Липосомальный Докс 0,2 2,0 0,018 2

ИК Докс 0,2 2,0 0,018 2

Докс 0,2 2,0 0,018 2

* Концентрация препарата

Дисперсию больших многослойных липосом получали гидратацией липидной пленки 125 мМ раствором (ЫН4)2ЗО4. Для получения малых однослойных липосом с узким распределением по размерам, соответствующим диаметру пор фильтра, выбран метод экструзии. Загрузку препарата в ИК проводили с использованием ионного градиента сульфата аммония, который стабилен во времени, не требует изменения рН внешней среды и универсален для липосом различного состава независимо от метода получения. Встраивание в состав везикул п-нитрофенилового эфира pNP-PEG3000-lipid позволило эффективно в одну стадию конъюгировать молекулы МКА. Использование в составе конъюгата PEG3000 предотвратило экранирование молекул МКА цепями DSPE-PEG-2000, также входящего в состав везикул. Очистку ИК от невключенного Докс и не связавшихся МКА проводили методом гель-фильтрации, основанном на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой. Регистрировали четкое разделение на 2 пика, соответствующие чистой фракции ИК с ИК Докс и буферу, состоящему из 10 мМ HEPES и 145 мМ ЫаС1 (рис. 1). Сошедшие фракции собирали в стерильные флаконы и подвергали спекторофо-тометрическому анализу. Средний размер полученных ИК составил 140+5 нм (рис. 2).

Оценку эффективности включения Докс в везикулы проводили путем определения содержа-

ния препарата в исходной дисперсии, внесенной в колонку, а также в первых фракциях, полученных на выходе из колонки. Результаты анализа представлены в табл. 2.

Среднее количество белка во всей очищенной фракции пустых ИК составило 0,292 мг. Известно, что одну липосому диаметром 100 нм составляют 100 тыс. молекул липидов [8; 9], тогда на липосому диаметром 140 нм приходится 140 тыс. молекул липидов.

Если учесть, что количество липидов в препарате составило, в среднем, 9,48 мг, а Мм IgG1 составляет 146 тыс. Da, то, зная соотношение фосфолипидов и белка в полученном препарате, можно вычислить число молекул антител на одну липосо-му по формуле:

N = ----А

М , где

N - число молекул,

т - масса вещества, взятого согласно методике приготовления ИК,

М - Мм.

Таким образом, в среднем на одну ИК приходилось ~23 молекулы конъюгированных антител.

Исследование специфической активности

ИК Докс in vitro

Специфичность связывания с клетками-мишенями. Для снижения неспецифического связывания липосом с клетками инкубацию с везикулами проводили при +4 °С. На рис. ЗА представлено распределение неокрашенных клеток линии SKOV3. При использовании МКА к MUC-1 - антигену в популяции выявлено 98% клеток-мишеней (рис. ЗБ). При инкубации с липосомальной формой Докс специфическое связывание не отмечали (рис. ЗВ), тогда как пустые липосомы связывались с 95% клеток (Рис. ЗГ). После инкубации клеток с ИК без последующей инкубации с F(ab)2, меченными FITC, в канале FL2 за счет аутофлуоресценции Докс регистрировали 98% связывание с клетками (рис. ЗД). Специфическое связывание ИК с инкапсулированным препаратом, выявляемое как за счет аутофлуоресценции препарата, так и за счет метки FITC F(ab)2 фрагментов, составило 97 + 2% (рис. ЗЕ).

Оценка цитотоксической активности ИК Докс. Использовали очищенные ИК с Докс, липосо-мальную форму, препарат в традиционной ЛФ, а также пустые ИК и нативные МКА ICO-25, так как они сами по себе могут оказывать цитотоксическое действие. Разведения пустых ИК и МКА готовили, исходя из концентрации липидов и МКА в ИК Докс. Каждый препарат исследовали в 5 концентрациях (табл. З). По результатам теста строили кривые выживаемости клеток и определяли значения IC50. На рис. 4 представлены результаты МТТ-теста на клетках линии SKOV3.

Как видно из рисунка, МКА ICO-25, используемые в качестве направляющего вектора в ИК в исследованном диапазоне концентраций не проявляют цитотоксического действия, а Докс в ИК был цитотоксичным соизмеримо с традиционной ЛФ: выживаемость клеток при концентрации Докс 18 мкг/мл составила 45,8 + 5,5% и 49,9 + 12%, для 7,5 мкг/мл - 60,6 + З,05% и 66,8 + 5,2З% соответственно (различия недостоверны).

Для липосомального Докс в изученных концентрациях IC50 не достижима.

Таким образом, получена иммунолипосо-мальная конструкция Докс с высокой степенью включения действующего вещества и выраженной специфической активностью in vitro.

Заключение

В результате проведенного исследования разработана технология получения стерически стабилизированной анти-MUC-l иммунолипосомаль-ной конструкции доксорубицина с размером частиц 140+5 нм и высокой степенью загрузки препарата (до 94 %).

Полученная конструкция характеризуется выраженной специфической активностью в отношении антиген-положительных клеток in vitro -эффективность связывания с мишенью составила 97 + З%. Иммунолипосомальный доксорубицин достоверно (p<0,05) более цитотоксичен по сравнению с липосомальной формой препарата.

Diam. |nm| > Solid Particle

Рис. 1. Хроматограмма очистки ИК с инкапсу- Рис. 2. Распределение ИК Докс по размерам, полу-

лированным Докс (скорость движения бумаги в ченное на наносайзере Nicomp 380 Submicron Parti-

рекордере 1 мм/мин., элюент - 0,15 М NaCl). I cle Sizer.

- фракция очищенных ИК с инкапсулированным Докс; II - буфер HEPES с NaCl.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ АНТИ-МиС-1 ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНАЯКОНСТРУКЦИЯ... 103

1 А

А

0° 101 ^ 103 м н>н

г

м

1<у «Г 1(Г КГ

М-н

&

с

о.

Б

!

! : лй

■ 1 "■ Ап ЩЯ1- - *ГнН| 1 1 ИНН Ч 1 иц

¡Р

10'

н>р

ат-н

Ь

'Ъ.

' д ч

о

"1 в ь-*

&

ат-н

*1141

I»1 .¿2 1 (Г

ЯП-Н

Рис. 3. Анализ специфического связывания ИК с клетками линии SKOV3 методом проточной цитофлуориметрии:

А: неокрашенные клетки;

Б: клетки, инкубированные с МКА ИКО-25;

В: клетки, инкубированные с липосомальным Докс;

Г: клетки, инкубированные с пустыми ИК;

Д: клетки, инкубированные с ИК Докс без обработки F(ab)2 МТС;

Е: клетки, инкубированные с ИК Докс и F(ab)2, меченными FITC.

Рис. 4. Цитотоксический эффект Докс в различных формах в отношении клеток SKOV3.

Литература

1. Баллюзек Ф.В., Куркаев А.С, Сенте Л. Нанотехнологии для медицины // ООО «Сезам-Принт». -2008. - С. 44-56.

2. Барсуков ЛИ. Липосомы // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 10. - С. 2-9.

3. Барышников А.Ю., Степанова Е.В., Личиницер М.Р. Оценка ангиогенеза опухолей человека // Успехи современной биологии. - 2000. - Т. 120, № 6. - С. 599-604.

4. Давыдов МИ. Экспериментальная онкология на рубеже веков / Под ред. М.И. Давыдова, А.Ю. Барышникова. - М.: Изд. группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2003. - 552 с.

5. Оборотова НА. Липосомальные лекарственные формы противоопухолевых препаратов // Химикофармацевтический журнал. - 2001. - Т. 35, №4. - С. 32-8.

6. Шалимов С А, Литвиненко А А, Дудниченко А .С. Использование липосомальной формы антибиотиков антрациклинового ряда в лечении экспериментальных форм опухолевых процессов // Украинский химиотерапевтический журнал. - 2004. - Т. 19, № 1-2. - С. 65-8.

7. Шубина ДА., Ганьшина И.П. Применение Келикса в онкологической практике // Фарматека (Онкология). - 2006. - № 18. - С. 25-33.

8. Цибулькина ЕА. Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени: Автореф. дис. канд. хим. наук: 03.00.23., 03.00.04. - 2008. - 24 с.

9. Enoch H.G., Strittmatter P. Formation and properties of 1000-angstrem-diameter, single bilayer phospholipids vesicles // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1979. - 76(1). - P. 145-9.

10. Haran G, Cohen R, Bar L.K. et al. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposome produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1993. - 1151(2). - P. 201-15.

11. Hobbs S.K., Monsky F, Yuan F. et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironmemt // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1998. - 95. - P. 4607-12.

12. Martin F, Boulikas T. The challenge of liposomes in gene therapy // Gene Ther. Mol. Biol. - 1998. - 1. - P. 173-214.

13. Mastrobattista E. Koning G.A., Storm G. et al. Immunoliposomes for the targeted delivery of antitumor drugs // Adv. Drug Deliv. - 1999. - 40. - P. 103-27.

14. Park Y.S. Tumor-directed targeting of liposomes // Bioscience Reports. - 2002. - 22. - P. 267-81.

НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН