CC BY
26
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов». К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
УДК 579.61 + 616.095
Болдырева Н.П.1, Ермоленко К.Д.2, Мартенс Э.А..2, Железова Л.И .2, Го Д.3, Суворов А.Н.1'4, Ермоленко Е.И.1'4
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОБИОТИКОВ И БАКТЕРИОЦИНОВ
В ОТНОШЕНИИ CAMPYLOBACTER SPP.5
1- СПбГУ, Санкт-Петербург, РФ; 2 - ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России, Санкт-Петербург, РФ; 3 - Институт агропродоволъственной науки и техники Шанъдунская академия сельскохозяйственных наук, Цзинанъ, Китай; 4 - ФГБНУ "Институт экспериментальной медицины ", Санкт-Петербург, РФ. Lermolenko1@yandex.ru
Резюме. Методом двухслойного агара была изучена антикампилобактерная активность пробиотических культур Enterococcus faecium L3 (Ламинолакт), Lactobacillus plantarum 8 R-A3 (Лактобактерин), смеси Lactobacillus acidophilus (Аципол) и Saccharomyces boulardii (Энтерол). Так же был проведен анализ ингибирующих эффектов химически синтезированных (Applied Biosystems 430-A, США) энтероцинов EntB, Enxa и EnxB, L50A, L50B, Ent P, EntA plantaricin NC8 а и nc8p против Campylobacter spp.. Капли антимикробных пептидов добавляли на поверхность газона 5 штаммов Campylobacter spp. (два штамма C. coli и три штамма C. jejunum) из коллекции бактериальных культур детского научно-клинического центра инфекционных болезней. Была показана высокая чувствительность Campylobacter spp. к воздейтсвию пробиотиков, содержащих лактобацилы и энтерококки, а также их метаболитам (в частности синтетическими бактериоцинами EnxB, L50A, L50B). Результаты исследования могут способствовать индивидуальному подбору пробиотических препаратов при лечении кампилобактериоза.
Ключевые слова: Enterococcus, Lactobacillus, кампилобактериоз, бактериоцины.
Summary.
N. Boldyreva, K. Ermolenko, E. Martens, L. Zhelezova' D. Guo, A. Suvorov, E. Ermolenko Antagonistic activity of probiotic and bacteriocins against
Campylobacter spp.
Anticampylobacter activity of probiotic cultures Enterococcus faecium L3
460
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
(Laminolact), Lactobacillus plantarum 8 R-A3 (Lactobacillus), mixtures of Lactobacillus acidophilus (Acipol) and Saccharomyces boulardii (Enterol) was studied by the method of double-layer agar. The inhibitory effects of chemically synthesized (Applied Biosystems 430-A, USA) enterocins EntB, Enxa and EnxB, L50A, L50B, Ent P, EntA plantaricin NC8 a and nc8p against Campylobacter spp were also analyzed.. Drops of antimicrobial peptides were added to the lawn surface of 5 strains of Campylobacter spp. (two strains of C. coli and three strains of C. jejunum) from the bacterial culture collection of the children's research and clinical center for infectious diseases. High sensitivity of Campylobacter spp has been shown. to vozdeytsviyu probiotics containing Lactobacillus and enterococci, as well as their metabolites (in particular synthetic bacteriocins EnxB, L50A, L50B).
The results of the study may contribute to the individual selection of probiotic drugs in treatment of campylobacteriosis.
Key words: Enterococcus, Lactobacillus, campylobacteriosis, bacteriocins.
Кампилобактерная инфекция является одной из наиболее распространенных причин развития гастроэнтерита у людей. В последнее десятилетие наблюдается существенное увеличение заболеваемости кампилобактериозом в Европе, Австралии и Северной Америке, а в Азии, Африке и Ближнем Востоке он стал эндемичным, особенно для детей младшего возраста [1].
Частое применение антибиотиков привело к увеличению частоты выявления штаммов Campylobacter spp., резистентных к воздействию данных препаратов [2, 3]. В качестве альтернативного варианта терапии нередко предлагаются пробиотики. Однако их использование для эрадикации кампилобактерной инфекции также не всегда оказывается одинаково эффективным. Нельзя исключить, что это связано с различной чувствительностью Campylobacter spp. к факторам, продуцируемыми пробиотическими культурами микроорганизмов. Целью настоящего исследования явился анализ антагонистической активности различных пробиотиков и бактериоцинов в отношении Campylobacter spp. в системе in vitro.
Материалы и методы
Для исследования антикампилобактерной активности были взяты следующие пробиотики: ламинолакт (Enterococcus faecium L3), лактобактерин (Lactobacillus plantarum 8 R-A3), аципол (смесь Lactobacillus acidophilus),
461
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России. бифиформ (Enterococcus faecium SF68 и Bifidobacterium bifidum) и энтерол
(Saccharomyces boulardii).
Антагонистическую активность оценивали с помощью метода двухслойного агара. В питательную среду (триптиказетново-соевый агар, Conda Pronadisa, Испания) добавляли пробиотические культуры в концентрации 7 и 5 lg КФЕ/мл. После застывания на поверхность нижнего слоя наносили второй слой той же питательной среды, не содержащей пробиотиков. Далее на поверхность верхнего слоя засевали культуры кампилобактерий в концентрации 6, 7 и 8 lg КФЕ/мл. Определяли минимальное количество пробиотических культур, ингибирующих рост Campylobacter spp. (КФЕ/мл).
Антагонистическая активность химически синтезированных (Applied Biosystems 430-A, США) бактериоцинов: EntB, Enxa и Enxp, L50A, L50B, Ent P, EntA плантарицин NC8a и NC8p (рисунок 1) в отношении Campylobacter spp. была определена капельным методом. Капли антимикробных пептидов в концентрации 500 мкг/мл и 50 мкг/мл были добавлены на поверхность только что засеянных культур Сampylobacter spp. (7 lg КФЕ/мл).
PeplENDHRMPNELNRPNNLSKGGAKCGAAIAGGL FGIPKGPLAWAAGLANVYSKCN- eatE
Pep2 SNDSLWYGVGQFMGKQAN CrTNHPVKHMIIPG YCLSKIL G
РерЗ IAPITV'AGLGYLVKDAWDESDQIISGrKKGWNGGRRK37 Ent
Pep4 MGALiKLYAKFG\\Tn'KKYYKQIMQFIGEGWA
Pep 5 MGAIAKLVTKFGWTLIKKrYKQIMQFIGQGWT
epfl ATRS Y GNGVYCNNSKC WVNWGE A KEN IAGIV
PepSTTESGKYYGNGVYCTKNKCTVBWAKATTCIA
PeplO S^TTS^TLGIKILWSA^TiHKKTIEKSFNKGFlH pLnatni irin 1 11 Pepll DLTT10^SSWGYYI^KKAKWNLKHPY\'QF plantaricin 2
Рисунок 1. Аминокислотная последовательность химически синтезированных бактериоцинов.
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
Пять клинических изолятов Campylobacter spp. (два штамма С. coli и три
штамма С. jejuni) были получены из коллекции бактериальных культур ФГБНУ «Детский научно-клинический центр инфекционный болезней».
Результаты
Исследование аникампилобактерного действия пробиотиков и их метаболитов проводили в два этапа. Сначала оценивали антагонистическую активность пробиотических культур, затем синтетических бактериоцинов, продуцируемых наиболее активными из них.
Исследование антагонистической активности пробиотических культур
Оценка «отсроченного антагонизма» пробиотических культур проводилась методом двухслойннного агара. При этом непосредственно пробиотики были добавлены в нижний слой агара с учетом количества (lg КФЕ/мл) пробиотических культур, входящих в их состав. Суммарное действие метаболитов, продуцируемых пробиотическими культурами, на чистые культуры 5 штаммов кампилобактерий представлены в таблице 1.
Показано, что ламинолакт, аципол, лактобактерин проявляли антагонистическую активность в отношении Campylobacter spp. в концентрациях 5 и 7 lg КФЕ/мл, входящих в их состав пробиотических культур. Энтерол не ингибировал рост всех штаммов кампилобактерий при добавлении в нижний слой агара культуры сахаромицетов в концентрации 5 lg КФЕ/мл, и посеве индикаторных культур в дозе 6-7 lg КФЕ/мл. Как видно из описания антикампилобактерной активности энтерола, для задержки роста кампилобактерий под влиянием метаболитов сахаромицетов (действовавших только в дозе 7 lg КФЕ/мл) важно было количественное соотношение антагониста и кампилобактерий.
Для более активно действующих культур молочнокислых бактерий доза антагониста также была важна и имела особенности для каждого пробиотика. Максимальное действие при концентрации 5 lg КФЕ/мл проявляли ламинолакт и бифиформ, которые ингибировали индикаторных культур во всех концентрациях. Аципол вне зависимости от дозы не действовал на три индикаторные культуры (С.соИ 1, C. jejuni 1 и C. jejuni 3 в количесве 8-7 lg КФЕ/мл). Лактобактерин был более активен, не подавлял размножение только культуры C. jejuni 3 в количестве 8 lg КФЕ/мл.
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
Исследование антикампилобактерной активности бактериоцинов
При исследовании действия 9 химически синтезированных бактериоцинов зоны задержки роста кампилобактерий были выявлены только в результате действия энтероцинов EnxB, L50A и L50B в концентрации 500 мкг/мл. При этом рост только двух штаммов Campylobacter spp. (С.jejuni 1 и ^jejuni 2), из 5 был ингибирован действием указанных бактериоцинов (рисунок 2).
Таблица 1
Ингибирование роста Campylobacter spp. пробиотиками.
Пробиотик Штаммы кампилобактерий Gcoli 1 С.coli 2 С. jejuni 1 С. jejuni 2 С. jejuni 3
Пробио-тические штаммы lg КФ Е/м л 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6
Бифиформ Bifidobacterium longum + Enterococcus faecium SF68 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Аципол Смесь Lactobacillus acidophilus 7 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1
5 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1
Лакто-бактерин Lactobacillus plantarum 8R-A3 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
Энтерол Sacharomyces boulardii 7 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1
5 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1
Ламинолакт Enterocccus faecium L3 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Без пробиотика Контроль 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Обозначения: 1 - наличие роста кампилобактерий, 0 - отсутствие роста.
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов». К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
entB
EotXalfa EntXbeta EntL501 EntL502 EntP EntA
plantaricin 1 plantaricin 2
Рисунок 2. Ингибирование роста Campylobacter spp. при добавлении бактериоцинов.
Обсуждение
В данной работе проведено пилотное исследование антикампилобактерной активности пробиотиков в системе in vitro. Выбранные условия эксперимента позволили выявить суммарную активность всех метаболитов, продуцируемых различными пробиотичекими культурами молочнокислых бактерий или грибами. Показано, что пробиотики ламинолакт (Enterococcus faecium L3), лактобактерин (Lactobacillus plantarum 8 R-A3) и аципол (смесь Lactobacillus acidophilus), в отличие от энтерола (Sacharomyces boulardii) могут существенно ингибировать рост кампилобактерий на питательной среде. Более активными оказались пробиотики ламинолакт и пробифор.
Антагонистическая активность пробиотических культур зависела от количественного соотношения культур пробиотиков и индикаторных культур. Было также отмечено, что некоторые штаммы Campylobacter sp. обладают устойчивостью к действию лактобацилл и энтерококков.
Ранее уже была обнаружена антикампилобактерная активность молочнокислых бактерий [4-8]. Однако природа их антагонистической активности в отношении Campylobacter spp. оставалась мало изученной. В качестве возможных метаболитов лактобацилл, ингибирующих рост
465
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России. рассматриваемых индикаторных культур, рассматриваются: перекись водорода,
органические кислоты и бактериоцины. [4, 6, 7, 8].
В ходе исследований [4] было показано, что перекись водорода, уксусная кислота и молочная кислота снижают количество C. jejuni в жидкой среде. Однако нейтрализация рН супернатантов культуры Lactobacillus sp. почти полностью нивелировала их ингибирование C. jejuni. Следовательно, ингибирующее действие лактобацилл в основном было связано с продукцией молочной кислоты.
В то же время обнаружено штаммоспецифическое действие лактобацилл на рост кампилобактерий, связанное с особенностями их бактериоцинов. Так, Lactobacillus acidophilus NCFM продуцировали лактацин B, который не обладал активностью в отношении грамотрицательных микроорганизмов, в том числе C. jejuni [4]. Согласно другим исследованиям [6, 9], 3 штамма Lactobacillus salivarius, SMXD51, MMS122 и MMS151, проявляли ингибирующее влияние по отношению к штаммам C. jejuni NCTC 11168 и 81-176 в результате продукции бактериоцинов. При добавлении бактериоцина штамма Lactobacillus curvatus DN317 так же отмечалось подавление роста C. jejuni [10]. Обращало на себя внимание, что Lactobacillus salivarius SMXD51 проявляли более сильную антагонистическую активность против четырех штаммов C. jejuni: 81-176, NCTC 11168, AC4700 и C94. Однако в тех же экспериментальных условиях антибактериальная активность не обнаружена в отношении штаммов C. jejuni C97ANSES640, AC4868, AC0858, AC2571, C276 и C1994. Эти результаты подтверждают возможность штаммоспецифического действия молочнокислых бактерий и формирования резистентности кампилобактерий к бактериоцинам (на примере Lactobacillus salivarius SMXD51 в отношении C. jejuni) [5].
Штаммы Enterococcus faecium также, как и штаммы лактобацилл способны продуцировать молочную кислоту, которая обладает антикампилобактерным эффектом. Это было подтверждено на примере штамма E. faecium THT, который проявлял ингибирующий эффект из-за продукции молочной кислоты [11]. Штаммоспецифическое действие E. faecium по отношению к Campylobacter spp. все же по большей могло быть связано со способностью продуцировать бактериоцины, к которым в то же время может формироваться устойчивость. Так, доказано антикампилобактерное действие энтероцинов класса IIa. Однако к одному из энтероцинов данного класса, энтероцину P, продуцируемому E. faecium P13, выявлена устойчивость Campylobacter spp. [13]. Это может быть
466
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России. связано с изменениями в клеточной стенке бактериальных клеток, которые
приводят к невозможности адсорбции, связывания, отделения, экспорта и
деградации бактериоцина [14]. Другие же бактериоцины, например, энтероцин E
50-52, продуцируемый E. faecium NRRL B-30746, обладают выраженным
антикампилобактерным эффектом ко всем исследованным кампилобактериям
[12].
В представленной работе впервые выявлена способность двухпептидных энтероцинов класса II (L50 A , L50B и EnxB) ингибировать рост Campylobacter spp. Нельзя исключить, что нанесение синтетических бактериоцинов на газон, содержащий достаточно высокую концентрацию кампилобактерий (7 lg КФЕ/мл), не позволило выявить существующую активность этих пептидов именно в данных условиях проведения эксперимента.
Тем более важным становится обнаружение данной активности у тех энтероцинов, которые могут продуцироваться использованными в эксперименте пробиотическими культурами энтерококков, входящих в состав бифиформа и ламинолакта [15].
Заключение
Высокая антикампилобактерная активность лактобацилл может быть связана с выработкой молочной кислоты, а у энтерококков - дополнительно со способностью продуцировать бактериоцины.
Все примеры, приведенные в данной статье, свидетельствуют о том, что для терапии кампилобактериоза необходим подбор пробиотиков. Одним из потенциальных средств достижения этой цели в практическом здравоохранении может служить разработанный нами метод двухслойного агара.
Не менее важными и перспективными могут быть оценка бактериоциногенности пробиотических штаммов и дальнейшая разработка антибактериальных препаратов на основе уже известных энтероцинов с антикампилобактерным эффектом.
Список литературы.
1. Kaakoush N. O., Castaño-Rodríguez N., Mitchell H. M., Man S. M. Global epidemiology of Campylobacter infection //Clinical microbiology reviews. - 2015. -Т. 28. - №. 3. - С. 687-720.
2. Ефимочкина Н. Р. и др. Антибиотикорезистентность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов //Вопросы питания. -
467
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов». К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
2017. - Т. 86. - №. 1. - C.17-27
3. Economou V., Gousia P. Agriculture and food animals as a source of antimicrobial-resistant bacteria //Infection and drug resistance. - 2015. - Т. 8. - С. 49.
4. Neal-McKinney J. M., Lu X., Duong T., Larson C. L., Call D. R., Shah D. H., Konkel M. E. Production of organic acids by probiotic lactobacilli can be used to reduce pathogen load in poultry //PloS one. - 2012. - Т. 7. - №. 9. - С. e 43928.
5. Saint-Cyr M. J., Haddad N., Taminiau B., Poezevara T., Quesne S., Amelot M., Daube G., Chemaly M., Dousset X, Guyard-Nicodème M. Use of the potential probiotic strain Lactobacillus salivarius SMXD51 to control Campylobacter jejuni in broilers //International journal of food microbiology. - 2017. - Т. 247. - С. 9-17.
6. Saint-Cyr M. J., Guyard-Nicodème M., Messaoudi S., Chemaly M., Cappelier J. M., Dousset X., Haddad N. Recent advances in screening of anti-Campylobacter activity in probiotics for use in poultry //Frontiers in microbiology. - 2016. - Т. 7. -С. 553.
7. Mohan V. The role of probiotics in the inhibition of Campylobacter jejuni colonization and virulence attenuation //European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. - 2015. - Т. 34. - №. 8. - С. 1503-1513.
8. Wang G., Zhao Y., Tian F., Jin X., Chen H., Liu X., Zhang Q., Chen Y., Zhang H., Chen W. Screening of adhesive lactobacilli with antagonistic activity against Campylobacter jejuni //Food Control. - 2014. - Т. 44. - С. 49-57.
9. Messaoudi S. Kergourlay G., Rossero A., Ferchichi M., Prévost H., Drider D., Manai M., Dousset, X. Identification of lactobacilli residing in chicken ceca with antagonism against Campylobacter //International Microbiology. - 2011. - Т. 14. -№. 2. - С. 103-110.
10. Zommiti M., Almohammed H., Ferchichi M. Purification and characterization of a novel anti-campylobacter bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus DN317 //Probiotics and antimicrobial proteins. - 2016. - Т. 8. - №. 4. - С. 191-201.
11. Dubois Dauphin R., R., Didderen I., Marcq C., Thewis A., Thonart P. In vitro antagonistic activity evaluation of lactic acid bacteria (LAB) combined with cellulase enzyme against Campylobacter jejuni growth in co-culture //Journal of microbiology and biotechnology. - 2011. - Т. 21. - №. 1. - С. 62-70.
12. Svetoch E. A., Stern N. J. Bacteriocins to control Campylobacter spp. in poultry—a review //Poultry science. - 2010. - Т. 89. - №. 8. - С. 1763-1768.
13. Nazef L., Belguesmia Y., Tani A., Prévost H., Drider D. Identification of lactic
468
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов». К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
acid bacteria from poultry feces: evidence on anti-Campylobacter and anti-Listeria activities //Poultry Science. - 2008. - Т. 87. - №. 2. - С. 329-334.
14. de Freire Bastos M. C., Coelho M. L. V., da Silva Santos O. C. Resistance to bacteriocins produced by Gram-positive bacteria //Microbiology. - 2015. - Т. 161. -№. 4. - С. 683-700.
15. A. Suvorov, E. Ermolenko, G. Alechina, A. Chernysh, A. Karaseva, F. Di Pierro Enterococcus as probiotics: what is the advantage?// Nutrafoods. -2019. - 1 1725. DOI 10.17470_NF-019-0003.
Ермоленко К.Д., Ермоленко К.Ю.
ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СРЕДИ АЛЬПИНСТСКИХ ГРУПП В КАВКАЗСКОМ РЕГИОНЕ
ФГБУ "Детский Научно-Клинический Центр Инфекционных заболеваний" ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия
Резюме.
В нашей стране происходит активное развитие системы туристических клубов и альпинистских лагерей. Несмотря на то, что травматизму в походе уделяется наиболее пристальное внимание, именно развитие инфекционной патологии часто оказывается не менее значимым по причине частой недооценки тяжести состояния руководителем группы, нерациональной эмпирической терапии и быстро прогрессирующего ухудшения самочувствия участника. Целью настоящего исследования явилось установить возможные факторы риска развития инфекционных осложнений в высокогорных туристических пеших походах выявить частоту развития инфекций и их нозологическую структуру. Результаты. В течение всего наблюдения острые инфекционные заболевания выявлялись у 7,7 - 15,8 % туристов в походах. В структуре заболеваемости инфекциями среди туристов доминировали острые инфекции верхних отделов респираторного тракта: острый ринофарингит, лакунарная ангина, острый простой бронхит. Несколько реже имели место острые кишечные инфекции: острые энтериты и гастроэнтериты.
Выводы. При планировании похода руководителем группы важно учитывать наличие у участников факторов риска развития инфекционной патологии, для недопуска до маршрута, своевременного назначение адекватного лечения или
