CC BY
42
УДК: 616.147.3-005.4-092.9-08
АНГИОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ СИЛДЕНАФИЛА В КОМБИНАЦИИ С ПЕНТОКСИФИЛЛИНОМ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ
© 2018 А. С. Белоус 1, Е. В. Трубникова 2
1 старший научный сотрудник НИЛ «Генетика», канд. мед. наук e-mail: a.s.belous@mail.ru 2 заведующая НИЛ «Генетика», докт. биол. наук, доцент e-mail: tr_e@list.ru
Курский государственный университет
Экспериментальная работа проведена на крысах линии Wistar. Ишемию моделировали на мышцах голени крыс. Коррекцию ишемии мышц проводили внутрижелудочным введением пентоксифиллина в дозе 60 мг/кг, силденафила в дозе 2,2 мг/кг ежедневно в течение 28 дней и комбинацией силденафила в дозе 0,22 мг/кг и пентоксифиллина в дозе 30 мг/кг в течение 7 дней. Результаты оценивали на 21-е и 28-е сутки. Уровень микроциркуляции выражался в перфузионных единицах. Коррекция ишемии мышц комбинацией силденафила и пентоксифиллина малыми дозами в течение 7 дней стимулирует ангиогенез и улучшает кровообращение в дистальных отделах конечностей соразмерно средним терапевтическим дозам силденафила в течение 28 дней.
Ключевые слова: эксперимент, хроническая ишемия, нижняя конечность, варденафил, пентоксифиллин.
К сожалению, результаты лечения хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) по сей день оставляют желать лучшего: эффект наблюдается лишь у 45% пациентов, до 20% пациентов погибают и у 35% выполняются «большие» ампутации [Dormandy et al. 1989]. В лечении ХОЗАНК приоритет, безусловно, принадлежит хирургическим методам [Giuffrida et al. 1993]. Однако реконструктивно-восстановительные операции, по самым оптимистическим оценкам, возможны не более чем у 75% пациентов с критической ишемией нижних конечностей [Покровский, Зотиков 1996]. Кроме того, большинство пациентов с ХОЗАНК имеют сочетанные поражения нескольких сосудистых бассейнов, а больные пожилого и старческого возраста - зачастую 6-8 сопутствующих заболеваний, что значительно увеличивает процент осложнений и летальность в послеоперационном периоде [Дибиров 2001].
Ввиду этого особое значение приобретает консервативное лечение ХОЗАНК. Согласно рекомендациям Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов, все пациенты независимо от степени ишемии подлежат консервативному лечению [Багдасарян, Зудин 2009].
В настоящее время существует несколько терапевтических подходов к лечению больных с хроническими облитерирующими заболеваниями нижних конечностей, каждое из которых имеет свои преимущества и недостатки. Поиск оптимального метода консервативного ведения больных с хронической критической ишемией нижних конечностей остается до сих пор важной и не до конца решенной задачей.
Одним из основных факторов в патогенезе и клинике атеросклероза, считается нарушение структуры и функции эндотелия [Белоус 2014]. Оксид азота - мощный вазодилататор, который синтезируется в эндотелиоцитах из L-аргинина под действием конститутивного фермента эндотелиальной NO синтазы (eNOS) [Гудырев и соавт.
2014; Desouza et al. 2002]. В настоящее время признано, что уменьшение синтеза и биодоступности оксида азота является главным механизмом, ответственным за инициирование и дальнейшее развитие эндотелиальной дисфункции при различных сердечно-сосудистых заболеваниях [Корокина и соавт. 2009].
В настоящее время получены результаты, позволяющие констатировать коррекцию эндотелиальной дисфункции силденафилом и тадалафилом, возникающую при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота [Покровская и соавт. 2009].
Силденафил является селективным конкурентным ингибитором фосфодиэстеразы 5-го типа (ИФДЭ 5), который препятствует разрушению циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), усиливает сосудорасширяющий эффект оксида азота (NO) [Верткин; Ballard et al. 1998]. Возможность ИФДЭ 5-го типа влиять на эндотелий сосудов показана в ряде экспериментальных и плацебо-контролируемых исследований у больных сахарным диабетом и добровольцах [Desouza et al. 2002; Gori et al. 2005; Gross 2005].
Целью настоящего исследования явилось изучение фармакологической эффективности силденафила в комбинации с пентоксифиллином в терапии хронической ишемии нижних конечностей.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проводились на крысах линии «Wistar» массой 230-260 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета. Животных распределяли по группам (не менее 20 крыс в группе) путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.
Экспериментальные животные были представлены следующими группами:
1) интактные животные (n=20);
2) ложнооперированные животные (n=20);
3) моделирование ишемии мышц голени (n=20), контрольная группа;
4) моделирование ишемии мышц голени+пентосифиллин (n=20), группа сравнения;
5) моделирование ишемии мышц голени+сиденафил (n=20), опытная группа;
6) моделирование ишемии мышц голени+сиденафил в комбинации с пентосифиллином (n=20), опытная группа.
Ложнооперированная группа формировалась животными, которым под наркозом в условиях антисептики разрезали кожу вдоль бедра по внутренней поверхности, выделяли сосудисто-нервный пучок бедра и затем рану ушивали непрерывным швом.
Хроническую ишемию конечности моделировали под наркозом, фиксировав животное в положении «на спине». На внутренней поверхности бедра тщательно выстригали шерсть, место операции обрабатывали 70% раствором спирта и осуществляли разрез кожи вдоль бедра по внутренней поверхности. Выделив элементы сосудисто-нервного пучка, отделяли артерию от вены и нерва, затем наложив лигатуру у места ее начала до отхождения a. saphena (под паховой связкой), которая является аналогом глубокой бедренной артерии человека [Гамбарян 1995]. Перевязывали и пересекали a. saphena. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (передняя и задняя большеберцовые артерии) и пересекали не перевязывая. Бедренную артерию пересекали на 3 мм ниже наложенной ранее лигатуры. Удаляли участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы передней и задней большеберцовых артерий. Ретроградного кровотечения не наблюдалось. Рана на бедре ушивалась непрерывным швом [Артюшкова и соавт. 2008].
Белоус А. С., Трубникова Е. В. Ангиогенный эффект силденафила в комбинации с пентоксифиллином при экспериментальной ишемии конечности
Учитывая результаты, полученные при анализе литературных данных, возможности компенсаторного восстановления регионарного кровообращения в применяемой нами модели, как наиболее информативные расценены 28-е сутки, 21-е рассматривались как промежуточные [Колесник и соавт. 2015].
Коррекцию ишемии мышц проводили у животных 4-й группы внутрижелудочным введением пентоксифиллина в дозе 60 мг/кг ежедневно в течение 28 дней, 5-й группы - силденафила (сиалис, Eli Lilly) в дозе 2,2 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 28 дней, 6-й группы - силденафила (сиалис, Eli Lilly) в дозе 0,22 мг/кг в комбинации с пентоксифиллином в дозе 30 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 7 дней.
Дозы препаратов пересчитаны по общепринятой формуле межвидового переноса доз по Freireich M. et al. и Улановой И.П. и др.
Уровень микроциркуляции в мышцах голени определяли с помощью оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144 на 21-е и 28-е сутки. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производилась с помощью программы AcqKnowledge версии 3.8.1, значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ). На 21-е и 28-е сутки производился вывод 50% (n=10) животных из каждой группы. Уложив наркотизированное животное на правый бок, иссекали участок кожи на переднелатеральной поверхности левой голени, обнажали мышцы. Датчик устанавливали строго перпендикулярно к поверхности мышцы, исключая возникновение воздушной прослойки и пересыхание мышцы. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: середина мышцы, точки на 3-4 мм выше, ниже, латеральнее и медиальнее от первой. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 секунд в каждой точке. Из полученных пяти значений рассчитывали среднее, вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного. Из 10 полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования [Колесник 2012].
Забор исследуемой мышцы для морфологического исследования осуществляли по окончании процедуры ЛДФ. Для этого рассекали собственную фасцию голени, мышцу мобилизовали, отсекали от мест прикрепления, а затем фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина.
Для статистической оценки полученных данных использовали методы параметрической статистики. Значимость различий между группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента для зависимых выборок. Достоверными считали различия между сравниваемыми значениями с уровнем значимости 95% (р<0,05).
Результаты мсследования и их обсуждение
Среднее значение уровня микроциркуляции в интактной мышце голени крыс составляет 527±13 ПЕ. Полученный результат значимо не отличается от результатов, полученных другими авторами, использовавшими данную модель. При гистологическом исследовании миоциты образуют плотные пучки, в толще которых проходят полнокровные венулы и артериолы, содержащие единичные эритроциты. Просветы сосудов широкие, эндотелиальные клетки без патологических изменений.
В группе ложнооперированных животных среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах левой голени на всех сроках не имеет достоверных отличий от показателей в группе интактных животных (519±13 ПЕ на 21-е сутки,
р=0,66; 521±16 на 28-е сутки, р=0,77). При гистологическом исследовании отличий от строения интактных мышц также не выявлено.
В группе моделирования ишемии мышц голени уровень микроциркуляции на всех сроках достоверно ниже значений в интактной мышце (325±3 ПЕ на 21-е сутки, р<0,05; 371±2 ПЕ на 28-е сутки, р<0,05). На 21-е сутки ишемии пораженная мышца макроскопически выглядела набухшей с крупными участками серовато-коричневатого цвета. Гистологически крупные участки представляли собой очаги организующегося некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28-е сутки мышца выглядела гипотрофичной, а цвет мышцы приближался к нормальному. Гистологически участки резорбируемого некроза были значительно меньше, вблизи них встречались пучки атрофированных мышечных волокон. В микроциркуляторном русле наблюдались полнокровие и новообразование единичных капилляров.
В группе животных, пролеченных пентоксифиллином, отмечалось увеличение уровня микроциркуляции по сравнению с контрольной группой. Пентоксифиллин оказывает положительное влияние на неоангиогенез, но к 28-м суткам уровень микроциркуляции не достигает нормальных значений (353±5 ПЕ на 21-е сутки, р<0,05; 415±2 ПЕ на 28-е сутки, р<0,05)
Коррекция силденафилом способствовала достоверному повышению уровня регионарного кровотока в ишемизированных мышцах голени крыс по сравнению с 3-й группой на соответствующем сроке: 425 ± 4 ПЕ — на 21-е сутки (р <0,05) и 803 ± 10 ПЕ — на 28-е сутки (р <0,05). Уровень микроциркуляции в данной группе на 21-е сутки приближался к значению этого показателя в группе интактных животных, а на 28-е сутки значительно превосходил его. Макроскопически ишемизированные мышцы не отличались по общему виду и цвету от мышц интактных крыс. При микроскопии некротических изменений также не обнаружили, однако в некоторых участках встречали мелкие очаги атрофирующихся миоцитов с пролиферацией клеток
Коррекция комбинацией силденафила и пентоксифиллина достоверно повышала уровень регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс по сравнению с показателями контрольной группы на соответствующем сроке (422 ± 5 ПЕ на 21-е сутки, р<0,05; 811 ± 6 ПЕ на 28-е сутки, р<0,05).
Уровень микроциркуляции в 5-й и 6-й группах на 21-е сутки приближался к показателю в группе интактных животных, а на 28-е сутки значительно превосходил его. При морфологическом исследовании макроскопически мышцы ишемизированной голени в опытных группах на 21-е и 28-е сутки эксперимента не отличались по цвету и виду от мышц интактных крыс. При микроскопии некротические изменения в мышцах не обнаруживались. При всех видах изучаемых воздействий в мышцах ишемизированной голени отмечалось усиленное новообразование капилляров, более выраженное на 28-е сутки эксперимента.
Основным недостатком монокоррекции является ограниченная патогенетическая направленность, связанная лишь с эндотелий-зависимым вазодилатирующим эффектом на фоне приема силденафила. Механизм действия силденафила основан на блокаде гидролиза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), в результате чего концентрация цГМФ растет и происходит активация цГМФ-зависимой протеинкиназы с последующим фосфорилированием ионных каналов. Как следствие, снижается концентрация кальция в гладкомышечных сосудистых клетках, что приводит к их релаксации. Ингибиторы ФДЭ-5 способствуют развитию вазодилатации под действием эндогенного оксида азота (NO), который выделяется из нервных окончаний и эндотелиальных клеток, стимулируя синтез цГМФ с помощью фермента гуанилатциклазы. Расслабление гладкомышечных клеток приводит к
Белоус А. С., Трубникова Е. В. Ангиогенный эффект силденафила в комбинации с пентоксифиллином при экспериментальной ишемии конечности
расширению артерий, что обеспечивает необходимый приток артериальной крови к тканям. По исследованиям последних лет препараты данной группы путем влияния на метаболический путь оксида азота оказывают выраженный эндотелиопротективный эффект, способны активировать протеинкиназу G и АТФ-зависимые калиевые каналы.
В основе механизма действия пентоксифиллина (трентала) лежит накопление циклического аденозинмонофосфата в гладкой мускулатуре сосудистой стенки, форменных элементах крови и других тканях организма. Кроме того, препарат блокирует действие фермента фосфодиэстеразы. Комбинированная терапия силденафила с пентоксифиллином позволяет достичь следующие фармакологические эффекты: некоторое миотропное вазодилатирующее действие, нормализация эластичности эритроцитов, снижение агрегации тромбоцитов, снижение вязкости крови, снижение плазменных концентраций фибриногена, улучшение фибринолиза. Всвязи с этим предложенная нами доза пентоксифиллина в комбинации составила 30 мг/кг.
Монотерапия препаратом силденафил в дозе 2,2 мг/кг является менее безопасной с точки зрения возникновения побочных эффектов, а также фармакоэкономически не целесообразна. Тогда как предложенная нами доза силденафила составляет 0,22 мг/кг (опираясь на литературные данные, эффект влияния на неоангиогенез малыми дозами, то есть уменьшение их в 10 раз, позволяет достичь практически такого же уровня микроциркуляции).
Таким образом, вполне обоснованным является комбинированное применение при ишемии конечности силденафила и пентоксифиллина, которые действуют на разные звенья патогенеза. Такое неконкурентное взаимодействие позволяет достичь максимального физиологического ответа, обеспечить хороший реологический эффект в очаге ишемии и уменьшить дозу каждого из препаратов в предложенной нами комбинации, что, в свою очередь, увеличивает безопасность данной комбинации с точки зрения возникновения побочных эффектов, а также является фармакоэкономически более выгодным.
Вывод
Полученные результаты в группе животных, получавших силденафил в комбинации с пентоксифиллином, позволяют констатировать положительное влияние на неоангиогенез. Коррекция данной комбинацией способствовала достоверному повышению уровня регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс по сравнению с показателями в контрольной группе и групп с монокоррекцией на соответствующем сроке. Уровень микроциркуляции в данной группе на 21-е сутки приближался к показателю в группе интактных животных, а на 28-е сутки значительно превосходил его. Полученные данные подтверждают фармакологическую эффективность комбинации силденафила с пентоксифиллином. Предложенная схема коррекции позволяет достичь практически такого же уровня микроциркуляции, максимального физиологического ответа, обеспечить хороший реологический эффект в очаге ишемии и уменьшить дозу каждого из препаратов, а также уменьшить период приема препаратов до 7 дней.
Библиографический список
Артюшкова Е.Б., Пашков Д.В., Покровский М.В. и др. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте // Эксперим. и клинич. фармакология. 2008. Т. 71. № 3. С. 23-25.
Багдасарян А., Зудин А. Базисная терапия хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей // Врач. 2009. №5. С. 56-58.
Белоус А.С. Оценка коррекции морфологических изменений при моделировании эндотелиальной дисфункции сверхмалыми дозами антител к enosra 28-дневной модели l-Name индуцированного дефицита оксида азота // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. 2014. № 11-1 (182). С. 127-130.
Верткин А.Л. Клиническая фармакология ингибиторов ФДЭ 5: сравнительный анализ. URL: http://www.intensive.ru/php/content.php?group=2&id=963 (дата обращения: 13.08.2018)
Гамбарян П.П., Дукельская Н.М. Крыса. М., 1995. 254 с.
Гудырев О.С., Файтельсон А.В., Покровский М.В. и др. Протективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном остеопорозе // Курский научно-практический вестник Человек и его здоровье. 2011. № 2. С. 9-14.
Дибиров М.Д. Хроническая артериальная недостаточность в пожилом и старческом возрасте. URL: http://rusmedserv.com/article/Медицинская газета. 2001.
Покровская Т.Г., Чулюкова Т.Н., Покровский М.В. Эндотелиопротективные эффекты силденафила и силденафила при экспериментальном моделировании l-name-индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. 2009. № 4. С. 136-145.
Колесник И.М. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование. Новые возможности применения в хирургии. Saarbrucken: LAP LAMBERT Acfdemic Publishing, 2012. 123 c.
Колесник И.М., Лазаренко В.А., Покровский М.В. Влияние фармакологического прекондиционирования силденафилом и варденафилом на состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной скелетной мышце // Курский научно-практический вестник «Человек и здоровье». 2015. №1. С. 83-86.
Корокина Л.В., Колесник И.М., Покровский M..В. и др. Фармакологическая коррекция L-name индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином // Кубанский научный медицинский вестник. 2009. № 9 (114). С. 66-69.
Покровский А.В., Зотиков А.Е. Перспективы и действительность в лечении артеросклеротических поражений аорты. М.:ИПС, 1996. 189 с.
Ballard A.S., Gingell C.J., Tang K. et al. Effects of sildenafi l citrate on the relaxation of human corpus cavernosum tissue in vitro and on the activities of cyclic phosphodiesterase isozyme // J. Urol. 1998. V. 159. P. 164-171.
Desouza C., Akers D., Parulkar A. et al. Acute and prolonged effects of sildenafil on brachial artery flow mediated dilatation in type 2 diabetes // Diabetes Care. 2002. V. 25. № 8. Р. 336-339.
Dormandy J., Mahir M., Ascady G. et al. Fate of the patient with chronic leg ischemia // J.Cardiovasc.Surg. 1989; 30: 500-507.
Giuffrida G.F., Longhi F., De Monti M. et al. Ischaemia critica agli arti inferiori: patogenesi, clinica e terapia: Risultati della nostra esperienza su 337 casi // Minerva Cardioangiol. 1993; 41(6): 239-247.
Gori T., Sicuro S., Dragoni S. et al. Sildenafi l Prevents Endothelial Dysfunction Induced by Ischemia and Reperfusion via Opening of Adenosine Triphosphate-Sensitive Potassium Channels // A Human In Vivo Study Circulation. 2005. V. 111. P. 742-746.
Gross G. J. Sildenafi l and Endothelial Dysfunction in Humans // Circulation. 2005. V. 111. P. 721-723.13.
Jeremy J. Y., Ballard S. A., Naylor A. M. et al. Effects of sildenafi l, a type-5 cGMP phosphodiesterase inhibitor, and papaverine on cyclic GMP and cyclic AMP levels in the rabbit corpus cavernosum in vitro // Br. J. Urol. 1997. V. 79. P. 958-963.
