CC BY
59
Ш1
kill
Математическое моделирование
1 и информационные
технологии
>
М.В. СПРИНДЖУК,
Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, г. Минск, Беларусь, sprindzuk@yahoo.com В.А. КОВАЛЕВ,
Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси
А.П. КОНЧИЦ,
Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси
Ю.Е. ДЕМИДЧИК,
РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им Н.Н. Александрова, п. Лесной, Минский р-н, Беларусь
М.В. ФРИДМАН,
РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им Н.Н. Александрова
A. Л. БОГУШ,
Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси
B. В. ЛЯХОВСКИЙ,
Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси
АНГИОГЕНЕЗ: ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕНОМЕНА И ВОПРОСЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ
УДК 616-006
Спринджук М.В, Ковалев В.А., Кончиц А.П., Демидчик Ю.Е., Фридман М.В., Богуш А.Л., Ляховский B.B. Ангиогенез: программное обеспечение для исследования феномена и вопросы количественной оценки гистологических изображений (Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им Н.Н. Александрова)
Аннотация: В статье рассматриваются вопросы изучения ангиогенеза с применением программного обеспечения. Авторы обсуждают принципы цифровой гистопатологии и сообщают начальный опыт своих исследований. Ключевые слова: ангиогенез, обработка изображений, цифровая патология, рак щитовидной железы/, лимфатические капилляры, метастазирование
UDC 616-006
чг
Sprindzuk M.V, Kovalev V.A., Konchic A,P., Demidchik U.E., Fridman E.V., Bogush A.L., Liachovskij V.V. Angiogenesis: software packages for the investigation of the phenomenon and quantitative assessment of histological images (United Institute of Informatics Problems Belarus National Academy of Sciences)
Abstract: Angiogenesis is the development of capillaries from the existing vasculature. In a brief review authors describe the concepts of neovascularization and the opportunities of the digital pathology: application of the image processing software packages. The major focuses of the manuscript are the descriptors of angiogenic microvascular network and an ideas on how to evaluate and calculate neoplasm angiogenesis.
Keywords: Angiogenesis, image analysis, software, microvessel density, neoplasm vascularization
Определение и классификация ангиогенеза
□ пухоли нужны сосуды как каналы доставки питательных веществ. Глобально и фундаментально зарождение, развитие, течение и исход роста опухоли обусловливаются взаимодействием факторов, указанных на рис. 1.
© М.В. Спринджук, В.А. Ковалев, А.П. Кончиц, Ю.Е. Демидчик, М.В. Фридман, А.Л. Богуш, В.В. Ляховский, 2010 г.
38
Математическое моделирование
www.idmz.nu
голо, №3
Рис. 1. Фундаментальные причины зарождения, развития и исхода
опухолевого процесса
Определение васкулогенеза и ангиогенеза (А.) до сих пор неоднозначно. Несколько авторов понимают под васкулогенезом все аспекты развития кровеносных сосудов в эмбрионе независимо от того, каким путем они образуются. Такая ситуация соответствует классическому определению и пониманию данного термина. Тем не менее, все большее число исследователей упоминают термин «васкулогенез» в более узком значении, относя к данному понятию исключительно формирование эндотелиальной ткани de novo из мезенхимальных предшественников. Противоположно процесс образования новых сосудов из уже существующего и функционирующего эндотелия назван А. от греческого сосуд — angeon. Много исследований показало, что это основа для неоваскуляризации у зрелого взрослого организма, однако существование других вновь образующихся предшественников клеток эндотелия не представляется возможным. Выделяется первичный и вторичный А.. Первичный А. (который часто считается синонимом васкулогенеза) — возникновение сосудов в организме «низших» животных или в телах зародышей «высших»
животных там, где их не было до этого. Вторичный А. — происхождение новых сосудов от сосудов, уже имеющихся в определенном месте в организме. В таком случае применим термин «прорастание», «врастание» сосудов, тогда как новообразование сосудов у эмбрионов позволяет говорить об их возникновении, так они изначально развиваются из островков и/или тяжей ангиобластов. Для первичного А. правило — «Omnis endothelium ex mesenchima», а для вторичного — «Omnis endothelium ex endothelium». Полная классификация по В.В. Куприянову [1] и соавт. (1993) представлена на рис. 2. Развитие А. — сложное, многогранное, основные процессы патогенеза злокачественных опухолей, в которых А. принимает участие, изображены на рис. 3.
Антиангиогенная активность исследуется в разнообразных субстанциях, недавние исследования показывают некоторые доказательства такого эффекта у китайских трав. Очевидно, что если удастся разработать эффективное малотоксичное лекарство от опухолей, это не только поможет лечить заболевания человека и домашних млекпопитающих,
■ ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ 39 ■
1 и информационные
технологии
Математическое моделирование
Рис. 2. Классификация ангиогенеза [1]
но и принесет компании-производителю огромный доход. Наблюдается рост публикаций, сообщающих результаты применения различных антиангиогенных медикаментов. Наиболее применяемым препаратом для лечения рака яичников является Bevicizumab, моноклональное антитело, мишень действия которого — фактор роста эндотелия сосудов. Сообщается, что 17% пациентов, которые
уже подвергались лечению различными средствами, положительно отвечают на такое лечение. Тем не менее, гипертензия, тромбоз и перфорация кишечника — это осложнения, которые ассоциируются с этим медикаментом.
На микроскопическом препарате А. выглядит как отдельные прокрашенные иммунореактивом сосуды (CD31, CD34, CD105 и т.п.) или как разветвленная сеть трубчатых струк-
40 ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ ■
Математическое моделирование
www.idmz.nu
голо, №3
Рис. 4. Схема компьютер-ассистированной диагностики рака по гистологическим препаратам опухолей. Текст с сокращениями переведен из [3]
тур. На сегодняшний день существуют десятки пакетов коммерческого дорогостоящего программного обеспечения для анализа изображений и так называемой «цифровой патологии» (digital pathology), но единицы из них приспособлены для процессинга изображений микропрепаратов А.
Принципы анализа гистологических изображений и опыт анализа изображений гистологического препарата ангиогенеза
Cigdem Demir и Bulent Yener (2005) [3] предлагают классифицировать типы свойств изображений гистопатологического препарата следующим образом (рис. 4):
1) морфологические;
2) текстурные;
3) фрактальные;
4) топологические;
5) основанные на интенсивности изображений.
Морфологические признаки предоставляют информацию о размерах и форме клетки. Примеры: радиус, периметр, компактность (квадрат периметра/площадь, гладкость гра-
ниц, наибольшая ось сечения, симметрия, вогнутость. Текстура — это пакет взаимосвязанных пикселов, которые повторяются на изображении. Текстурные (структурные) признаки предоставляют информацию о вариации интенсивности поверхности путем получения таких свойств, как гладкость, шероховатость и регулярность. Фрактал — это объект, обладающий таким свойством, как внутреннее единство схожести (подобия), то есть выглядит одинаковым на разных увеличениях. При фрактальном анализе измеряется степень самоподобия. Основные свойства этого подхода — это фрактальный размер и лакунарность. Топологические свойства предоставляют информацию о структуре ткани путем вычисления пространственного распределения (взаимоотношения) клеток.
Свойства, основанные на интенсивности изображений, получаются от анализа цветовой гистограммы рисунка. Они не предоставляют информацию о пространственном распределении пикселов. Пример такого анализа — определение оптической плотности пиксела путем конвертирования значения уровня серого в соответствующее значение
■ ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ ■ ■■■ ■ !5 ■■ ■ ■ ■■■ ■■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■■ ■■ ■ ■
1 и информационные
технологии
Математическое моделирование
-Ф
> оптической плотности. Могут определяться значения пикселов отдельного цветового канала или взаимосвязь между значениями пикселов различных каналов [3].
Наиболее распространенное свойство изображений А. для его изучения в тканях различной локализации и, в частности, РЯ, на котором сосредоточена настоящая статья, — плотность микрососудов [4, 5] можно отнести к морфологическим структурным свойствам сосудов.
Несмотря на недостатки плотности микрососудов как маркера А. и его коррелятивной оценки как прогностического метода, надежной замены этого параметра на сегодняшний день нет.
Плотность микрососудов подсчитывается как число сосудов на определенной площади изображения. Сосуд определяется как видимый на микропрепарате просвет, окружаемый окрашенными эндотелиальными клетками.
Проблемой оценки плотности микрососудов является определение точек максимальной васкуляризации, в которых подсчитываются сосуды. Как правило, эти участки изображения (3-5 регионов) выбираются патологом, и этот факт накладывает отпечаток субъективизма на этот селективный процесс. Однако уже существуют методы определения точек максимальной васкуляризации и площади эндотелия с помощью специального программного обеспечения, но сообщений о сравнительных исследованиях мануального и ком-пьютер-ассистированных методов, по нашим данным, крайне мало [6, 7]. Вероятно, ком-пьютер-ассистированный подсчет общего числа пикселов, отображающих прокрашенные клетки эндотелия на всей площади исследуемого микропрепарата или даже их серии, а не только в точке максимальной васкуляризации, может оказаться более статистически достоверным методом оценки степени активности А., чем существующие. В настоящее время считается, что такие данные, как площадь микрососудов, их периметр и плотность,
являются равноценными источниками, характеризующими А. количественно [8].
Заметим, что проведенные исследования коррелятивного значения плотности микрососудов весьма неоднородные как по составу пациентов, так и по применяемым маркерам и ряду других свойств [4, 5]. Этот факт делает затруднительным формулирование достоверных выводов о плотности микрососудов как предсказательном факторе вообще. Интересно, что в ряде случаев и ситуаций низкое значение плотности микрососудов может быть неблагоприятным предсказательным фактором клинического течения опухолевого процесса [9]. У сравнительно старших пациентов может наблюдаться более низкое значение плотности микрососудов рака яичников, причем являясь неблагоприятным прогностическим признаком [10].
Применение различных панэндотелиальных клеточных маркеров может повлиять на результат определения плотности микрососудов. При адекватном применении антиген антифактора коагуляции VIII остается наиболее специфичным маркером эндотелия, обеспечивающим очень хороший контраст между микрососудами и другими компонентами ткани. Маркер CD31 является более чувствительным и подходящим маркером для окраски срезов препаратов на парафине, он кросс-реагирует с плазмацитами. Такое осложнение может значительно затруднить подсчет микрососудов в опухолях, в которых преобладает воспалительное плазмоклеточное фоновое окружение. Другим недостатком CD31-окраски является частая потеря антигена при применении фиксирующих растворов, содержащих уксусную кислоту. При применении анти-СD31-антител области с преобладанием воспалительного инфильтрата на малом увеличении могут быть ошибочно приняты за точку, имеющую максимальную васкуляризацию (vascular hot spot). Наличие таких CD31-клеточных инфильтратов иногда делает затруднительной диагностику микрососудов,
42 ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ ■
Математическое моделирование
www.idmz.nu
голо, №3
особенно разрастаний одной клетки (single cell sprouts). Применение CD34 — это приемлемая альтернатива и наиболее часто воспроизводимая во многих лабораториях методика высвечивания эндотелиальных клеток. Однако CD34 прокрашивает периваскуляр-ные стромальные клетки, и было замечено, что они могут окрашивать широкий спектр стромальных новообразований. Заслуживает внимание факт, что ни один из рассматриваемых маркеров не способен различать между покоящимися и активированными/пролифери-рующими клетками эндотелия. Два антитела, называемые E-9 и CD 105 (эндоглин), как считают исследователи, проявляют специфичность в ракурсе прокрашивания пролиферирующего эндотелия [11].
CD 105, гипоксией-индуцибельный протеин [12, 13], ассоциируемый с пролиферацией, выборочно предпочтительно экспрессируется на активированных эндотелиальных клетках, участвующих в неоангиогенезе, особенно в опухолях, и не обнаруживается или слабо выражен на сосудах нормальных тканей.
Tie-2/Tek, эндотелий-специфический рецептор тирозинкиназы [14-17] и рецепторы VEGF (vascular endothelial growth factor — фактор роста эндотелия сосудов) также идентифицируют стромальные сосуды.
Хотя области точек максимальной васкуляризации — нередкая находка при исследовании внутренних срезов опухоли, такие участки обычно преобладают в краевых регионах опухоли [11].
Интересный парадокс — это низкая плотность микрососудов в тканях целого ряда опухолей по сравнению с аналогичными нормальными тканями. Это может объясняться низкой потребностью опухоли в кислороде. Такая ситуация подчеркивает количественный характер такого признака, как плотность микрососудов, ведь сосудов может быть мало, а их качественные свойства (например, активность) могут быть выражены значительно ярче, чем в большом количестве мелких микрососудов. Таким
образом, появились идеи о поиске объектов изображений, которые могли бы характеризовать А. в большей степени в ракурсе качества активности. Так, Международный консенсус патологов предложил анализировать на изображениях А. количество перицитов и фракции клеток эндотелия, которые подверглись апоптозу и, наоборот, нет [18].
Фрактальный анализ нашел применение для оценки активности А. в органах, отличных от яичников человека, однако этот метод подвергается серьезной критике ученых [19-21]. Имеются единичные сообщения о применении оценки цветовой интенсивности изображений А., но широкого применения этот метод пока не получил [22]. Что касается топологических свойств А., нам удалось найти только 1 литературный источник о топологии гетерогенной природы внеклеточного матрикса при опухолевом А. [23]. Когда вычисляется плотность микрососудов (кровеносных или лимфатических), отдельный объект, прокрашенный, например, маркером CD34, регистрируется как один сосуд. Считается, что по своей природе иммунохимическое окрашивание сосудов не является идеальным для диагностических целей, так как при такой окраске прилегающие сосуды и даже группа сосудов могут быть распознаны как один объект (Goddard и соавт., 2002) [24, 25].
После бинаризации изображений плотность микрососудов оценивается путем подсчета общего числа белых пикселей (либо другого цвета — см. рис. 5) на определенном поле. Такие показатели, как среднее число концевых точек капилляров (vessel end points), узловых точек разветвления на каждом изображении (vessel branch points/nodes), средняя общая длина сосудов для данного изображения в пикселах, вычисляются после ске-летонизации изображений ^mano и соавт., Japan, 2007) [26]. Полученные числовые данные можно коррелировать с другими параметрами (рис. 6) и использовать как предсказательный фактор.
■ ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ 43 ■
1 и информационные
технологии
Математическое моделирование
Рис. 5. Изображения папиллярного рака щитовидной железы с окраской D2-40 до (слева) и после (справа) обработки программой А.П. Кончица (Гомель, Беларусь, 2010)
80 п
70-
+
+
60-
50-
■jir Метастазы (у)
О Возраст • Размер опухоли + Число лимфоузлов
40-
30-
20-
10-
0-
+
++
+ + • + +
+ + + • +
*•+ •* в® ®в в в в
*1 %• • • ☆
☆ §г ☆ ☆ ☆ • ☆
1 1 1 1 > 20 40 1 1 1 60 00 _ о о -о 1 1 1 1 1 120 140 160
Плотность лимфатических узлов
Рис. 6. Матрикс корреляции параметров, полученных при исследовании 18 пациентов, страдающих папиллярным раком щитовидной железы
Объектом измерения А. программы AngioQuant [27] (программного обеспечения, бесплатно доступного для научно-исследовательских целей) является сеть соединенных трубчатых (тубулярных) структур капилляров. Это программное обеспечение позволяет определять длину и размеры этих тубулярных комплексов так же, как и число соединений (точек ветвления) в самом комплексе (Antti Niemisto, Finland, 2005) [7]. Исследователи, разработавшие это программное обеспечение, пришли к выводу, что распределение длин тубулярных комплексов в экспериментальном А. подчиняется закону степени (power law). Другие бесплатные программные
пакеты: Image J [28], ImageLab [29], Cell Profiler [30], Cell analyst [31], AQuaL [32].
Заключение и выводы
В кратком обзоре современной литературы мы осветили вопросы цифровой патологии и количественной оценки А.
Начальные данные показали отсутствие линейной коррелятивной связи между рядом клинико-патологических параметров и плотностью лимфатических капилляров. Мы планируем большое исследование в будущем, которое прояснит важные для понимания механизмов метастазирования ассоциации взаимосвязи данных.
44 ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ ■
Математическое моделирование
www.idmz.nu
голо, №3
ЛИТЕРАТУРА
1. Kupryianov V.V., Mironov V.A., Mironov A.A., Gurina O.Y. Angiogenesis: origin, growth and development of the blood vessels. — Moscow: «Kvartet», 1993. — 240 p.
2. Cooke R., ebrary Inc.: Dr. Folkman's war angiogenesis and the struggle to defeat cancer. Edited by New York, Random House, 2001, p. pp. xiv, 366 p.
3. Demir C., Yener B. Automated cancer diagnosis based on histopathological images: a systematic survey//Rensselaer Polytechnic Institute, Tech. Rep. — 2005.
4. Lavalle G., Bertagnolli A., Tavares W., Silva M., Cassali G. COX-2 expression in canine mammary carcinomas: correlation with angiogenesis (or microvessel density) and overall survival//Vet Pathol. — 2009.
5. Tan X.J., Lang J.H., Lou W.Z, Shen K., Xu X.Y. Prognostic value of microvessel density and angiogenesis-related molecules in epithelial ovarian cancer//Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. — 2008. — V. 30. — № 4. — P. 274-278.
6. Leme M.B., Waitzberg A.F., Artigiani Neto R., Linhares M.M., Matos D. Assessment of angiogenesis expression and its relationship with prognosis of colorectal cancer by conventional and computer-assisted histopathological image analysis//Acta Cir Bras.
— 2006. — V. 21. — № 6. — P. 392-397.
7. Niemisto A, Dunmire V., Yli-Harja O., Zhang W., Shmulevich I. Robust quantification of in vitro angiogenesis through image analysis//IEEE Trans Med Imaging. — 2005. — V. 24. — № 4. — P. 549-553.
8. StewartM., Murray J.C. Angiogenesis protocols. — Totowa, N.J.: Humana Press, 2009. — № XI. — 358 p.
9. Marion-Audibert A.M., Bare! C., Gouysse G., Dumortier J, Pilleul F., Pourreyron C., Hervieu V., Poncet G., Lombard-Bohas C., Chayvialle JA, Partensky C., Scoazec J.Y. Low microvessel density is an unfavorable histoprognostic factor in pancreatic endocrine tumors//Gastroenterology. — 2003. — V. 125. — № 4. — P. 1094-1104.
10. Chan J.K., Loizzi V., Magistris A., Lin F., Rutgers J., Osann K., Disaia P.J, Berman M.L. Differences in prognostic molecular markers between women over and under 45 years of age with advanced ovarian cancer//Clin. Cancer Res. — 2004. — V. 10. — № 24.
— P. 8538-8543.
11. Ribatti D., ebrary Inc.: History of research on tumor angiogenesis. Edited by Dordrecht, Springer Netherlands, 2009, p. pp. ix, 125 p.
12. Zhang D., Feng X.Y, Henning T.D., Wen L, Lu W.Y., Pan H., Wu X, Zou L.G. MR imaging of tumor angiogenesis using sterically stabilized Gd-DTPA liposomes targeted to CD105//Eur. J. Radiol. — 2009. — V. 70. — № 1. — P. 180-189.
13. Li S.L., Gao D.L., Zhao Z.H., Liu Z.W., Zhao Q.M., Yu JX., Chen K.S., Zhang Y.H. Correlation of matrix metalloproteinase suppressor genes RECK, VEGF, and CD105 with angiogenesis and biological behavior in esophageal squamous cell carcinoma// World J. Gastroenterol. — 2007. — V. 13. — № 45. — P. 6076-6081.
14. Ribatti D. The paracrine role of Tie-2-expressing monocytes in tumor angiogenesis// Stem Cells Dev. — 2009. — V. 18. — № 5. — P. 703-706.
15. Li X.H., Wang X.S., Han C.B., Zheng H.C., Yang X.H. Roles of angiopoietin-2, Tie-2 and hypoxia-inducible factor 1alpha in angiogenesis of glioma//Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. — 2008. — V. 37. — № 3. — P. 188-189.
■ ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ 45 ■
1 и информационные
технологии
Математическое моделирование
16. Gotsch F, Romero R, Kusanovic J.P., Chaiworapongsa T., Dombrowski M, Erez O, Than N.G., Mazaki-ToviS., MittalP., EspinozaJ., Hassan S.S. Preeclampsia and small-for-gestational age are associated with decreased concentrations of a factor involved in angiogenesis: soluble Tie-2//J. Matern Fetal Neonatal. Med. — 2008. — V. 21. — № 6. — P. 389-402.
17. Chen J.X., Stinnett A. Disruption of Ang-1/Tie-2 signaling contributes to the impaired myocardial vascular maturation and angiogenesis in type II diabetic mice // Arte-rioscler Thromb Vasc Biol. — 2008. — V. 28. — № 9. — P. 1606-1613.
18. Vermeulen P.B., Gasparini G., Fox S.B., Colpaert C., Marson L.P., Gion M., Beli-en J.A., de Waal R.M., Van Marck E., Magnani E., Weidner N., Harris A.L., Dirix L.Y. Second international consensus on the methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid human tumours//Eur. J. Cancer. — 2002. — V. 38. — № 12. — P. 1564-1579.
19. Weyn B., Tjalma W.A., Vermeylen P., van Daele A., Van Marck E., Jacob W. Determination of tumour prognosis based on angiogenesis-related vascular patterns measured by fractal and syntactic structure analysis//Clin. Oncol. (R Coll Radiol). — 2004. — V. 16. — № 4. — P. 307-316.
20. Parsons-Wingerter P., Lwai B., Yang M.C., Elliott K.E., Milaninia A., Redlitz A., Clark J.I., Sage E.H. A novel assay of angiogenesis in the quail chorioallantoic membrane: stimulation by bFGF and inhibition by angiostatin according to fractal dimension and grid intersection//Microvasc. Res. — 1998. — V. 55. — № 3. — P. 201-214.
21. Kirchner L.M, Schmidt S.P., Gruber B.S. Quantitation of angiogenesis in the chick chorioallantoic membrane model using fractal analysis//Microvasc. Res. — 1996. — V. 51. — № 1. — P. 2-14.
22. Choi H.J, Choi I.H., Cho N.H., Choi H.K. Color image analysis for quantifying renal tumor angiogenesis//Anal. Quant Cytol. Histol. — 2005. — V. 27. — № 1. — P. 43-51.
23. Amyot F., Small A., Boukari H., Camphausen K., Gandjbakhche A. Topology of the heterogeneous nature of the extracellular matrix on stochastic modeling of tumor-induced angiogenesis//Microvasc. Res. — 2009. — V. 77. — № 2. — P. 87-95.
24. Goddard J.C., Sutton C.D., Furness P.N., Kockelbergh R.C., O'Byrne K.J A computer image analysis system for microvessel density measurement in solid tumours// Angiogenesis. — 2002. — V. 5. — № 1-2. — P. 15-20.
25. Goddard J.C., Sutton C.D., Furness P.N., O'Byrne K.J, Kockelbergh R.C. Microvessel density at presentation predicts subsequent muscle invasion in superficial bladder cancer//Clin. Cancer Res. — 2003. — V. 9. — № 7. — P. 2583-2586.
26. Amano M., Suzuki M., Andoh S., Monzen H., Terai K., Williams B., Song C.W., Mayo K.H., Hasegawa T, Dings R.P., Griffin R.J. Antiangiogenesis therapy using a novel angiogenesis inhibitor, anginex, following radiation causes tumor growth delay// Int. J. Clin. Oncol. — 2007. — V. 12. — № 1. — P. 42-47.
27. http://www.cs.tut.fi/sgn/csb/angioquant/.
28. http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html.
29. http://www.aptrio.com/Education/Science/image-lab-366.html.
30. http://www.cellprofiler.org/examples.htm.
31. http://www.fileheap.com/download-cellanalyst-from-assaysoft-36949.html.
32. Boettcher M, Biol D., Gloe T., D P., Wit C.D., D P. Semiautomatic Quantification of Angiogenesis//Journal of Surgical Research. — 2009.
46 ■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■■ ■ ■ ■■■ ■ ■ ■ ■ ■
