CC BY-ND
14
•Ш, IM (277)
ЗНиСО
35
УДК 579.843.1:575.25:612.017.4:002.5/6
АНАЛИЗ ВНУТРИВИДОВОЙ КОНКУРЕНЦИИ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE
С ПОМОЩЬЮ INDEL-МАРКЕРОВ
С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников, Л.К. Лысова, С.В.Титова
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
При анализе коллекции из 16 штаммов был отобран INDEL-маркер «VC2429» позволяющий дискриминировать токсигенные и атоксигенные штаммы Vibrio cholerae. Атоксигенные штаммы образовывали амплификат размером 100 п.о., в то время как токсигенные формировали амплификат размером 84 п.о. Изученные 13 ctх+^Л+-штаммов по устойчивости к инги-бирующей активности атоксигенного штамма разделились на две группы: подавляемые и штаммы, способные сосуществовать со штаммом-антагонистом. На наш взгляд, наибольшую опасность при попадании в водоемы представляют штаммы второй группы, способные противостоять ингибирующей активности ctх^срЛ--штамма. Ключевые слова: холерный вибрион, конкуренция, типирование, INDEL.
S.O. Vodopyanov, A.S. Vodopyanov, I.P. Oleynikov, L.K. Lysova, S.V. Titova □ THE ANALYSIS OF INTRASPECFIC COMPETITION OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS BY MEANS OF INDEL-MARKERS □ Rostov-on-Don Anti-Plague Scientific Research Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
In the course of analysis of a collection including 16 Vibrio cholerae strains an INDEL-marker «VC2429» had been selected which allowed to discriminate between toxigenic and non-toxigenic strains. Non-toxigenic strains yielded 100 bp amplicon while toxigenic formed 84 bp amplicon. The 13 ctx+tcpA+ toxigenic strains studied were divided into two groups according to their resistance to inhibitory activity of a non-toxigenic strain - suppressible and able to co-exist with the antagonist strain. The strains of the second group, resistant to the inhibitory activity of ctx-tcpA- strains, are likely to represent particular danger when they contaminate water reservoirs. Key words: Vibrio cholera, intraspecfic competition, genotyping, INDEL.
Эпидемиологический надзор за холерой, реализуемый в Российской Федерации, включает систему мер, направленных на своевременное выявление завозных и местных случаев холеры [1]. Эта задача осуществляется путем слежения за циркуляцией холерных вибрионов в объектах окружающей среды путем целенаправленного исследования воды поверхностных водоемов. За последние десятилетия на территории Российской Федерации в пробах воды поверхностных водоемов регулярно обнаруживают аток-сигенные штаммы холерных вибрионов, что указывает на их стабильное сохранение в окружающей среде [2-5]. Выделение токсиген-ных культур из воды и от людей носит единичный и спорадический характер, причем практически все случаи являются завозными [4, 5]. Значимость атоксигенных штаммов холерных вибрионов, циркулирующих в поверхностных водоемах, не установлена. Высказано предположение о возможности горизонтального обмена генетической информацией [6], что может приводить к появлению новых форм возбудителя. Практически не исследована их возможная роль во внутривидовой конкуренции, приводящей к последующему исчезновению ток-сигенных штаммов из воды водоемов. На настоящее время имеются лишь единичные работы такого плана, например, описан результат изучения взаимодействия вибрионов, основанный на анализе совместной инкубации штаммов, различающихся по чувствительности к антибиотикам [7].
Вместе с тем проведение полномасштабной работы по оценке внутривидовой конкуренции между токсигенными и атоксигенными штаммами Vibrio cholerae невозможно без простых и
точных методов, способных уверенно дифференцировать в смеси различные штаммы. Один из таких перспективных подходов базируется на недавно разработанном методе молекулярного типирования на основе INDEL-маркеров, которые представляют собой вставки-делеции (insertions/deletions) коротких фрагментов ДНК [8]. Использование для этой цели метода VNTR-ти-пирования [4, 5] на наш взгляд не вполне уместно, поскольку для каждого штамма вибрионов характерна уникальная VNTR-формула, что требует специального подбора праймеров для каждой изучаемой пары праймеров.
Цель исследования - разработка способа быстрого определения внутривидовой ингиби-рующей активности холерных вибрионов на основе INDEL-маркеров.
Материалы и методы. В работе использовали 13 ctx tcpA -штаммов, выделенных на территории Российской Ф едерации в период 20002012 годов и три ctxtcpA-штамма вибиронов изолированных при проведении мониторинга на холеру из воды открытых водоемов в 2014 г. Штаммы хранили в лиофильном состоянии.
Для анализа внутривидовой конкурентной активности культуры изучаемых штаммов в соотношении 1 : 1 смешивали во флаконе со стерильной водопроводно4й водой до конечной концентрации каждого 104 и инкубировали при 25 °С. В указанные интервалы времени (сразу на этапе внесения в среду культивирования, пятые и десятые сутки) отбирали пробы, проводили два пассажа через 1 %-ю пептонную воду в течение 3 ч при 37 °С. Для анализа отбирали 0,5 мл пробы, которые исследовали в ПЦР.
Для генотипирования штаммов холерного вибриона использовали INDEL-маркер, нахо-
36
ЗНиСО
лпрель IM (277)
дящийся в промоторной области гена VC2429, кодирующего цинк-связывающий белок. Для выявления использовали авторские праймеры (5'-3') atgtatttttggttcgcaacatt и ctcaagatatcgcctttgatttg.
Культивирование на питательных средах, выделение ДНК, постановку ПЦР и учет результатов проводили по методикам, описанными ранее [4, 5].
Соотношение ДНК ctx tcpA - и ctx tcpA -штаммов определяли в ПЦР со специфическими праймерами к INDEL-локусу VC2429 по интенсивности полос амплификатов на элек-трофореграмме. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с помощью программы GeneExpert (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия).
Результаты исследования. При анализе INDEL-маркеров, входящих в состав базы данных «Гены, позволяющие дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы Vibrio cholerae и проводить внутривидовое типирова-ние» [8], на подобраной коллекции штаммов для последующего анализа был отобран INDEL-маркер «VC2429», позволяющий быстро и однозначно дифференцировать токсиген-ные и атоксигенные штаммы холерного вибриона с использованием одной пары прайме-ров. Так три ctx tcpA -штамма образовывали амплификат размером 100 п.о., в то время как все 13 ctx tcpA -штаммов из-за делеции участка в 16 нуклеотидов формировали амплификат размером 84 п.о., что позволяет легко дифференцировать делеционный вариант с помощью ПЦР с одной парой праймеров и последующего электрофореза в полиакриамидном геле.
При постановки ПЦР со смесью ДНК ctxtcpA-и ctx tcpA -штаммов в различном соотношении было установлено, что амплификация успешно проходит с обеих матриц (с делецией и без нее), а различие в молекулярной массе ампли-конов позволяет надежно детектировать даже минорное количество аллеля INDEL-ген. Практически стабильно выявлялось присутствие даже 10 % минорного аллеля в смеси ДНК двух
штаммов. Таким образом, разработанный метод ПЦР с праймерами к ШОБЬ-маркеру «УС2429» позволял в одной пробирке определять относительное соотношение в смеси каждого из двух изучаемых с1х1срЛ - и Лх 1;срЛ -штаммов.
Разработав несложный метод определения соотношения Лх^срЛ- и Лх 1;срА -штаммов в ПЦР с одной парой праймеров, мы приступили к изучению феномена внутривидовой конкуренции. В первой серии экспериментов мы установили, что три исследованных Лх^срЛ-штамма Р-19645, Р-19666 и Р-19670, выделенные из воды поверхностных водоемов России в 2014 г., обладают различной ингибирующей активностью в отношении токсигенных штаммов. Процесс занимал от пяти до десяти дней. Наибольшей ингибирующей активностью обладал штамм Р-19670, выделенный в августе 2014 г. из реки Неман. Этот штамм был отобран для дальнейших экспериментов.
В следующей серии экспериментов в парных опытах определяли взаимодействие с1хТсрЛ-штам-ма Р-19670 с 13 с1х+1;срЛ+-штаммами. Для дополнительного контроля подавления размножения вибрионов после инкубации в исследуемый интервал времени с помощью ПЦР анализировали не только саму водопроводную воду, но и пеп-тонную воду после двух последовательных пассажей через пять и десять суток совместного инкубирования (табл. 1). Изученные сх 1срЛ -штаммы по устойчивости к ингибирующей активности атоксигенного штамма разделились на две группы: подавляемые Лх-штаммом при совместной инкубации и штаммы резистентные, т. е. сохраняющие свое количество на уровне штамма-антагониста.
В первую группу «подавляемых» сх 1;срЛ -штаммов вошло восемь культур, при этом три штамма были выделены из воды, а пять - от человека. Группа «устойчивых» штаммов была представлена пятью штаммами (четыре выделены от человека и один - из воды). Таким образом, особой связи между устойчивостью к внутривидовой конкуренции и источником выделения штамма вибрионов не обнаружено.
Таблица 1. Распределение с1х+1срЛ+-штаммов V. cholerae по устойчивости к ингибирующему воздействию с1х"ЧсрЛ--штаммом при совместной инкубации
Группа с1х+-штаммов Штамм Год выделения Источник выделения
Подавляемые с1х-штаммом при совместной инкубации 18252 2000 сточная вода
18588 2003 речная вода
18826 2005 клинический
18847 2005 речная вода
18899 2006 клинический
19188 2010 клинический
19187/2 2010 клинический
19241 (301) 2011 морская вода
Устойчивые к воздействию с!х-штамма при совместной инкубации 18368 2001 речная вода
18746 2004 клинический
19191 2010 клинический
18895 2005 клинический
6878 2012 клинический
•Ш, IM (277)
ЗНиСО
37
Рис.
М1420 Индия 2002 Т— 1_-3226-Москва-2010
ЕЛ 4 7-Китай-2009
р 19188а-Масква-2010 I 19137-Москва-2010 .
18899-М уг~.......
3546-06-С ША-Индня-200В 3500-05-С ША-Ин ди я-2005 СР1038-Эимбабве-2009 J 2010Е!_-1 749-Камерун-2010 I 2009У-1085-США-Индия-2009 П- 2009У-1131-США-Индия-2009 18826-Тверь-2005 —^ 1 З01-Таганрог-2011 81с-Р?оа1о¥-2014 РСЗ-023-Бангладеш-2010 МНСС-ОЮЕ-Бангладеш-2010 N Н С С-006С-Б а н г ла деш-2 010 ЕОС-020-Бангладеш-2010 СР1048-Б а н гла де ш-2 010 19191а-Москва-2010^£. НС-23А1-Гаити-2010 1736-Гаита-2010 6878-М осква-2012 НС-38А1-Гаити-2010~ 3265-М осква-2014
_[\lep-21113-Непал-2003
I Nep-21106-Непал-2003 18369-Ростов-2001 18368-Ростов-2001 18367-Ростов-2001 . Е М -1626-Б а н гла де ш-2 010
_П Е0с-022-Бангладеш-2010
I- СР 1042-Таила н д-2010 СР 1033-М ехико-2000 АС-7404-Банглэдеш-1991 I 18588-Р остов-2003 г И471-Ашай-2011 —| 18252 Ростов 2000
I 5879 I— 16961 I— 1ЕС224
1— ЕМ-1727-Бангладеш-2011
Обозначения: «—» штамм подавляется клетками с1х-1;срА--штамма Р-19670,
* штамм резистентен к внутривидовой ингибирующей активности
1. Фрагмент дендрограммы распределения штаммов V. ско1вгав по анализу результатов полногеномных сиквенов на основе единичных нуклеотидных замен в 1 700 открытых рамках считывания
4:
М
При анализе дендрограммы, построенной с помощью программы «GeneExpert» на основании единичных нуклеотидных замен в 1 700 открытых рамках считывания 43 штаммов Vibrio cholerae, обнаружено, что три «резистентных» штамма (отмечены звездочкой) сгруппированы в одной области, при этом штаммы 19191 и 6879 относятся к группе «гаитянских» штаммов, вызвавших эпидемию на о. Гаити. При этом «подавляемые» штаммы сгруппированы в других участках дендрограммы. Этот факт заслуживает дальнейшего изучения и на наш взгляд может указывать на существование каких-то групп генов, обусловливающих «резистентный» или «подавляемый» генотип вибрионов.
Тонкая природа механизма внутривидовой ингибирующей активности токсигенных и аток-сигенных вибрионов на данный момент неясна.
Возможно, это событие является частью общебиологической закономерности конкуренции -взаимодействия близкородственных микроорганизмов, стремящихся получить один и тот же пищевой субстрат. Нельзя исключить и возможность продукции конкурирующими штаммами метаболитов или вибриоцинов, подавляющих развитие другой популяции [9, 10]. С другой стороны, у холерных вибрионов «убийство соседей» может происходить при помощи «секреторной системы типа VI» (Т688) - молекулярного комплекса, составленного из белков вирусного происхождения, при помощи которого вибрионы-убийцы разрушают оболочку клеток-реципиентов и вводят в них токсичные вещества [11].
Выводы. Таким образом, на основании проделанной работы обнаружена гетерогенность
30
ЗНиСО
•Ш, IM (277)
о1х+1орЛ+-штаммов холерного вибриона по способности планктонной формы конкурировать с ctxtopA-штаммом. Способность токсигенных штаммов вибрионов противостоять внутривидовой конкуренции может иметь большое биологическое значение, при этом, на наш взгляд, наибольшую опасность при попадании в водоемы представляют штаммы первой группы, способные противостоять ингибирующей активности otxtopA-штамма. Разработанный несложный метод оценки внутривидовой конкурентной активности в ПЦР с одной парой праймеров также может быть использован для изучения возможного взаимодействия вибрионов в составе биопленок. Задача облегчается тем, что в последнее время разработан удобный лабораторный метод моделирования формирования биопленок холерными вибрионами [12].
ЛИТЕРАТУРА
1. Москвитина Э.А. Современные тенденции в развитии седьмой пандемии холеры / Э.А. Москвитина // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. № 1. С. 22-26.
2. Онищенко Г.Г. и др. Холера в начале XXI века / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. № 3. С. 44-48.
3. Москвитина Э.А. и др. Эпидемиологические особенности холеры на современном этапе седьмой пандемии / Э.А. Москвитина, А.Б. Мазрухо, О.А. Арешина [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014. Т. 19. № 4. С. 44-49.
4. Ежова М.И. и др. Холерные вибрионы O1 серогруппы, выделенные из водных объектов Ростова-на-Дону в ходе мониторинга в 2008-2012 гг. / М.И. Ежова, В. Д. Кругли-ков, А.С. Водопьянов [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2013. № 4. С. 56-59.
5. ВодопьяновА.С. и др. VNTR-генотипирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных из объектов внешней среды на территории Российской Федерации в 2012 году / А.С. Водопьянов, А.Б. Мазрухо, С.О. Водопьянов [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. № 2, С. 46-51.
6. Borgeaud S. et al. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer / S. Borgeaud, L.C. Metzger, T. Scrignari, M. Blokesch // Science. 2015. Vol. 347 (6217) P. 63-67.
7. Paul K. et al. Competitive Growth Advantage of Nontoxi-genic Mutants in the Stationary Phase in Archival Cultures of Pathogenic Vibrio cholerae Strains / K. Paul, A. Ghosh, N. Sengupta, R. Chowdhury // Infection and immunity. 2004. Vol. 72, № 9. Р. 5478-5482.
8. Водопьянов А.С. и др. Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2014620308. Гены, позволяющие дифференцировать токсигенные и не-токсигенные штаммы Vibrio cholerae и проводить внутривидовое типирование / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников. 2014.
9. Одум Ю. Экология: Т1-2. / Пер. с англ. М.: Мир, 1986. Т. 1. 326 с. Т. 2. 376 с.
10. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / Под ред А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2004. 272 с.
11. Basler M. et al. Type VI secretion requires a dynamic contractile phage tail-like structure / M. Basler, M. Pilhofer, G.P. Henderson [et al.] // Nature. 2012. Vol. 483(7388). P. 182-186.
12. Решение о выдаче патента на изобретение от 25.05.2015 по заявке № 2014121905/10(035478) Способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов. Авторы Титова С.В., Кушнарева Е.В.
Контактная информация:
Водопьянов Алексей Сергеевич, тел.: +7 (863) 240-22-66, e-mail: [email protected]
Contact information:
Vodopyanov Alexey, р^эм: +7 (863) 240-22-66,
e-mail: [email protected]
+ -
