АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ПРОФИЛАКТИКИ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА НА АЛЛОРЕАКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК ДОНОРА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ДЕПЛЕЦИЕЙ α/βTCR/CD19+ ЛИМФОЦИТОВ У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.155

АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ПРОФИЛАКТИКИ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ-ПРОТИВ-ХОЗЯИНА НА АЛЛОРЕАКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК ДОНОРА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ДЕПЛЕЦИЕЙ a/ßTCR/CD19+ ЛИМФОЦИТОВ У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

© 2019 В.В. Захарова1, Ж.Б. Шеховцова1, О.А. Шрагина1, Е.В. Райкина1, М.А. Илюшина1, Я.О. Музалевский1, А.Г. Кочетов2, 3 4, Л.Н. Шелихова1, М.А. Масчан1

1ФГБУ НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва 2ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва 3ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», Москва 4АНО ДПО «Институт лабораторной медицины», Москва

Одной из первых популяций лимфоцитов, восстанавливающейся после аллогенной трансплантации гемо-поэтических стволовых клеток (ГСК) является популяция естественных киллерных клеток (NK клетки). Молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (Human Leukocyte Antigen, HLA) служат лигандами для семейства KIR (killer cell immunoglobulinlike-receptors, KIRs) рецепторов NK клеток, а NK-аллореактивность, в свою очередь, основывается как на KIR-HLA несоответствии между донором и реципиентом, так и на KIR генотипе донора. Выводы большого количества современных исследований указывают на зависимость эффективности развития реакции трансплантат-против-лейкоза от множества факторов, среди которых KIR генотип донора и проведение профилактики реакции трансплантат-против-хозяина (РТПХ).

Целью данного исследования являлось изучение влияния KIR генотипа NK клеток доноров на риск развития рецидива и выживаемость в выборке пациентов с острыми лейкозами и с одинаковым видом профилактики РТПХ после проведения им HLA -гаплоидентичной родственной и HLA -идентичной неродственной аллогенной трансплантации ГСК.

Материалы и методы. В исследование включено 47 пациентов (медиана возраста 9 лет) с острым миелоб-ластным лейкозом (ОМЛ) (n = 34) и острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) (n = 13), которым была проведена первая аллогенная неродственная (n = 20) или гаплоидентичная (n = 27) трансплантация ГСК с деплецией a/ß Т-лимфоцитов в качестве процессинга трансплантата. Все пациенты на момент трансплантации ГСК находились в полной клинико-гематологической ремиссии, в качестве источника ГСК использовались стимулированные гранулоцитарным колониестимулирующим фактором стволовые клетки периферической крови.

Результаты, полученные в данной работе, согласуются со множеством ретроспективных исследований по всему миру: лишь небольшая часть этих исследований обнаружила благоприятный эффект потенциальной NK аллореактивности донора, в то время как подавляющее большинство исследований продемонстрировало либо отсутствие эффекта, либо его отрицательный вклад в исходы трансплантации ГСК. При анализе влияния отдельных KIR генов донора на эффективность трансплантации ГСК у пациентов с ОМЛ и ОЛЛ, статистически значимых различий не обнаружено. При оценке риска развития рецидива, общей и безрецидивной выживаемости пациентов в зависимости от KIR B-контента, а также присутствия Cenß-мотива (гены KIR2DS2 и K1R2DL2), отмечался тренд в сторону снижения риска рецидива и повышения выживаемости у пациентов c наилучшим («best») В-контентом и присутствием CenB-мотива, однако без статистической значимости. При HLA-гаплоидентичной трансплантации ГСК потенциальная NK аллореактивность доноров, предсказанная по модели «рецептор-лиганд», не оказала влияния на риск развития рецидива и выживаемость пациентов. При применении модели «лиганд-лиганд» наблюдалась тенденция к снижению риска возникновения рецидива и повышению безрецидивной выживаемости пациентов в случае потенциальной NK аллореактивности донора, однако без ста-

тистической значимости. Выявленные в исследовании тенденции позволяют предположить важность результатов KIR типирования при подборе донора для аллогенной трансплантации ГСК.

Ключевые слова: иммуноглобулинподобные рецепторы киллерных клеток, KIR типирование, HLA типиро-вание, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток.

Введение. Естественные киллерные клетки (NK) являются популяцией лимфоцитов, имеющей поверхностный клеточный фенотип CD3-, CD56+ и составляют примерно 5-25 процентов мононуклеарной фракции периферической крови здорового человека [1, 2]. NK клетки имеют много общего в развитии, морфологии, механизме уничтожения чужеродного и продукции цитокинов с CD8+ цитотоксическими Т лимфоцитами [3]. По сравнению с Т и В лимфоцитами, NK клетки крупнее и содержат цитолитические гранулы (гранзимы и перфо-рин), а также осуществляют секрецию интерферона-гамма и некоторых цитокинов. Фундаментальной функцией NK клеток является защита от инфекций и опухолевых трансформаций без предварительной сенсибилизации, и, следовательно, NK клетки являются компонентом врожденного иммунитета [4, 5]. На основании уровня экспрессии молекулы CD56, в периферической крови человека выделяют две субпопуляции NK клеток [6]. Более 90 процентов составляет субпопуляция CD56dim, клетки которой экспрессируют высокий уровень CD16 и иммуноглобулиноподобных рецепторов NK клеток (KIR), являются наиболее дифференцированными и зрелыми и обладают высокой цитотоксической активностью [1, 7]. Оставшиеся 10 процентов приходятся на субпопуляцию CD56bright (с фенотипом CD16-, KIR+/-), которая является предшественником субпопуляции CD56dim и характеризуется высокой продукцей провоспалительных цитокинов [8]. Клетки субпопуляции CD56brignt преобладают в лимфатических узлах и взаимодействуют с дендритными клетками [9, 10]. NK клетки имеют высоко специфичную и сложную систему рецепторов для распознавания клеток-мишеней, которая интегрирует сигналы от множества активирующих и ингибирующих рецепторов, что регулирует цитотоксическую активность и секрецию цитокинов [11]. В отличии от Т и В лимфоцитов, которым требуется соматическая рекомбинация ДНК на ранних этапах дифферен-цировки для достижения разнообразия и специфичности репертуара рецепторов, NK клетки экспрессируют множество различных семейств рецепторов (KIR, KLR, LILR и NRC) с активирующими и ингибирующими функциями [12].

По сравнению с другими семействами рецепторов NK клеток, KIR рецепторы играют ключевую роль в регуляции развития и функционирования NK клеток [13]. Ингибирующие KIR рецепторы, которые экспрессирует NK клетка распознают собственные HLA молекулы 1 класса на поверхности других клеток, и таким образом исключается повреждение здоровых тканей. Эта толерантность NK клеток к собственным неповрежденным тканям организма приобретается в процессе так называемого «обучения» и «лицензирования», при котором в ходе созревания NK клетки, ее KIR рецепторы взаимодействуют с молекулами HLA I класса. Однако, при вирусной инфекции или опухолевой трансформации клетки, экспрессия молекул HLA I класса изменяется, что приводит к преобладанию сигналов от активирующих KIR рецепторов на NK клетках и запуску механизмов уничтожения поврежденных клеток (рис. 1). Это уникальное свойство NK клеток было описано как «missing self» гипотеза или гипотеза «отсутствия своего» [14].

Рис. 1. Взаимодействие NK-клетки со здоровыми и поврежденными тканями

NK клетки являются первой популяцией лимфоцитов, которая восстанавливается после аллогенной трансплантации ГСК и могут оказывать сильный эффект трансплантат-против-лейкоза, основанный на их аллореактивности. Для характеристики влияния взаимодействия NK клеток и их лигандов на исходы аллогенной трансплантации ГСК были предложены три модели.

1. Модель «лиганд-лиганд» основана на особенностях функционирования рецепторов NK клеток и предполагает, что если у реципиента отсутствуют как минимум один или более KIR лигандов (аллели HLA I класса групп C1, C2 или Bw4), которые имеются у донора, то донорские NK клетки будут аллореактивны по отношению к пациенту (потенциальная аллореак-тивность в направлении трансплантат-против-лейкоза). Данная модель была подтверждена экспериментальными исследованиями на мышах в университете Перуджи [15]. Отсутствие лигандов у реципиента необходимо, но недостаточно для формирования потенциально алло-реактивных клонов NK клеток. Необходимо также присутствие у донора гена, кодирующего ингибирующий рецептор к отсутствующему у реципиента лиганду. Поскольку популяцион-ное исследование показало, что ингибирующие KIR гены присутствуют у 95 % людей, предположение о наличии соответствующего KIR рецептора у донора будет корректно на 95 % [16, 17]. Соответственно, определение KIR генотипа донора повысит точность исследования. Данная модель не применима для трансплантаций, где донор и реципиент являются HLA-идентичными. Однако, для неродственных с несовпадением по HLA-B или HLA-C и для гап-лоидентичных аллогенных трансплантаций ГСК данная модель применима [18].

2. Модель «рецептор-лиганд» не принимает во внимание KIR лиганды донора, поэтому применима для любого вида аллогенной трансплантации ГСК. По этой модели аллореактив-ность достигается в случае наличия у донора KIR рецептора, к которому нет лиганда у реципиента. Эта модель основана на предположении, подтвержденном исследованием экспрессии KIR рецепторов на поверхности NK клеток методом проточной цитометрии в ранний пост-

трансплантационный период. В первые 90 дней после трансплантации ГСК вновь развивающиеся NK клетки, экспрессирующие ингибирующие KIR рецепторы, временно могут быть ал-лореактивными к клеткам реципиента, не несущих соответствующие лиганды. В этот период такие аллореактивные клоны NK клеток могут оказывать такой же эффект, как и в предыдущей модели. В последующем, когда костный мозг восстанавливается и NK клетки проходят «обучение» и «лицензирование», аллореактивные клоны больше не образуются [16]. Частный случай данной модели - «missing ligand» («отсутсвие лиганда») - менее точная модель, в которой предполагается, на основании популяционного исследования, что у большинства доноров есть все ингибирующие KIR гены, поэтому при отсутствии хотя бы одного из лигандов у пациента (C1, C2 или Bw4), считается что донор потенциально аллореактивен [18].

3. Модель, анализирующая влияние отдельных KIR генов, а также общего количества KIR генов донора, без учета HLA антигенов реципиента и донора. Эта модель наименее изучена, предполагается, что чем выше количество KIR рецепторов на NK клетке донора, тем больше вероятность, что различие между KIR лигандами донора и реципиента будет определяться NK клетками [19].

Данные модели схематично представлены на рисунке 2.

Модель «лиганд-лигацд» Совместимость

ВМС1 С2

Донор I _

Реципиент |

Донор | | | Реципиент | | |

Донор Реципиент

Несовместимость

В\у4С1 С2 Донор | | | Реципиент ___

Модель «рецептор-лиганд» Совместимость

Модель, анализирующая влияние KIR jснов донора

ЛокусКИ*

1 Л V

В Г

Рис. 2. Модели NK аллореактивности

В настоящем исследовании, на основании трех вышеописанных моделей, произведен анализ влияния ЫК аллореактивности доноров на риск развития рецидива, общую и безрецидивную выживаемость у пациентов с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) и острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), которые впервые получили гаплоидентичную и неродственную аллогенные трансплантации ГСК с использованием селективного удаления (де-плеции) ар Т лимфоцитов из трансплантата. Учитывая, что ЫК клетки являются первой популяцией, которая восстанавливается после трансплантации ГСК, и иммунносупрессивная терапия может влиять на скорость ее восстановления, была сформирована выборка пациентов с одинаковой профилактикой РТПХ (бортезомиб на +2 и +5 дни), чтобы все пациенты находились в равных условиях после трансплантации ГСК. Одни из наиболее весомых ре-

зультатов о благоприятном влиянии NK клеток на исходы трансплантации ГСК были получены на модели гаплоидентичной трансплантации с использованием CD34+ селекции как метода обработки трансплантата и отсутствии профилактики РТПХ [15]. Деплеция а/р Т лимфоцитов, в свою очередь, является новым методом процессинга, в результате которого в трансплантате помимо гемопоэтических стволовых клеток сохраняется большое количество эффекторов врожденного иммунитета (главным образом, зрелых NK и у/5 Т клеток), что сопряжено с низким риском отторжения и развития РТПХ [20, 21, 22, 23]. В данной работе NK аллореактивность была изучена в контексте аллогенной трансплантации ГСК с деплецией ар Т лимфоцитов и применения у всех пациентов одинаковой профилактики развития РТПХ.

Материалы и методы

Пациенты и доноры. В исследование были включены 47 пациентов с диагнозами ОМЛ (п = 34) и ОЛЛ (п = 13), которые находились в полной клинико-гематологической ремиссии и впервые получили аллогенную трансплантацию ГСК с деплецией а/р Т лимфоцитов в качестве процессинга трансплантата от Д^^-идентичных неродственных (п = 20) и HLA-гаплоидентичных родственных (п = 27) доноров на базе ФГБУ НМИЦ ДГОИ им. Дм. Рогаче-ва в период с марта 2014 по июнь 2016 года. Характеристика пациентов и доноров отражена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика пациентов

Всего Число пациентов, N (%)

47

Диагноз

ОЛЛ 13 (27,7)

ОМЛ 34 (72,3)

Медиана возраста на момент трансплантации, годы 9 (диапазон 1-20)

Пол пациентов

женский 16 (34,0)

мужской 31 (66,0)

Статус заболевания на момент трансплантации

Полная клинико-гематологическая ремиссия 47 (100,0)

Тип донора

HLA -гаплоидентичный родственный 27 (57,4)

Полностью HLA -идентичный неродственный (10/10) 14 (29,8)

Неполностью HLA -идентичный неродственный (9/10, 8/10) 6 (12,8)

Режим кондиционирования

Основанный на тотальном облучении тела (TBI/Flu/Mel Thio) 6 (12,8)

Основанный на треосульфане (Treo/Flu/Mel) 41 (87,2)

Текущий статус

Живы в полной ремиссии 33 (70,2)

Рецидив 10 (21,3)

Смерть, не связанная с рецидивом 4 (8,5)

Медиана наблюдения, годы 1,46 (диапазон 0,06-2,85)

HLA типирование пациентов и доноров. Всем пациентам и их донорам было проведено HLA типирование по пяти основным локусам HLA-A, -B-, C, -DRB1,-DQB1. Геномная ДНК, как для HLA типирования, так и для KIR типирования, была выделена из периферической крови с помощью набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия). HLA типирование выполнялось с помощью полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами PCR-SSP (Olerup SSP AB, Stockholm, Sweden), секвенированиия по Сэнгеру, Sequence-Based Typing (Invitrogen, USA), высокопроизводительного секвениро-вания следующего поколения, NGS (NGSgo, GenDx, The Netherlands). Разнообразие методик типирования связано с внедрением в работу лаборатории новых современных методов HLA-типирования в период проведения данного исследования. Для всех аллелей первого класса HLA-A *и HLA-B* были установлены эквивалентные им серологические группы Bw4 или Bw6 согласно текущим данным HLA Dictionary, а аллели HLA-C* были отнесены к группе С1 или С2 согласно современной классификации [24].

KIR типирование доноров. KIR типирование образцов доноров проводилось с помощью наборов Olerup SSP KIR Genotyping kit (Olerup SSP AB, Stockholm, Sweden). Оценка продукта ПЦР происходила с помощью электрофореза на 1 % агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. Вывод о наличии или отсутствии специфических KIR генов (2DL1, 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5A, 2DL5B, 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS4, 3DL1, 3DL2, 3DL3, 3DS1, 2DP1 и 3DP1) производился на основании результатов электрофореза - присутствия или отсутствия продукта полимеразной цепной реакции соответствующего молекулярного веса. KIR генотипы доноров были распределены на группы - А или/и В - согласно геномной организации KIR локуса [25]. Распределение доноров на группы в соответствии с их KIR B-контентом («neutral», «betten», «best») проводилось с помощью KIR B-content group калькулятора [26]. Под B-контентом подразумевается количество центромерных и теломерных мотивов, содержащих гены, определяющие KIR B гаплотип. Выделяют три В-контента: нейтральный («neutral») - донор, в гаплотипе которого полностью отсутствует B-мотивы или присутствует только один, неважно в какой части (TelB или CenB); лучший («better») - донор, в гаплотипе которого присутствует один или более B-мотив, но не в центромерной части (не CenBB, без гомозиготности в центромерной части по В-мотиву); наилучший («best») - донор, в гаплоти-пе которого присутствует один или более B-мотив и именно в центромерной части (с CenBB) [27]. Аллореактивность донора оценивалась по трем ранее описанным моделям аллореактивности NK клеток.

Кондиционирование и трансплантация. Все пациенты, вошедшие в исследование, получили миелоаблативное кондиционирование. В таблице 1 представлена информация о составе кондиционирования, серотерапии и проведенной профилактике РТПХ.

Источником трансплантата являлись мобилизованные гранулоцитарным колониестиму-лирующим фактором (Г-КСФ) стволовые клетки периферической крови (ПСК), полученные в ходе процедуры афереза мононуклеаров. Собранные ПСК прошли процедуру деплеции а/р Т лимфоцитов с помощью CliniMACS системы (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Германия). Медиана количества CD34 позитивных клеток на кг массы тела пациента в трансплантате составила 7,45* 106 (диапазон 4,2-17* 106).

Для профилактики развития РТПХ всем пациентам была проведена посттрансплантационная иммуносупрессивная терапия, которая включала бортезомиб 1,3 мг/м2 (на 2 и 5 дни после трансплантации ГСК).

Статистический анализ данных. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения XLSTAT, Addinsoft, 2015. Риск рецидива основного заболевания оценивался с момента проведения трансплантации до даты последней консультации для выживших пациентов с помощью кумулятивной оценки частоты событий (cumulative incidence), конкурирующим риском при этом была трансплантат-ассоциированная смерть. Общая и безрецидивная выживаемости рассчитывались с помощью метода Каплана-Майера. Безрецидивную выживаемость определяли от даты трансплантации ГСК до даты констатации рецидива заболевания, либо, в случае сохранения ремиссии, до даты последней консультации. Общую выживаемость - от даты проведения трансплантации ГСК до даты смерти пациента от любой причины, либо до даты последней консультации для выживших пациентов. Для сравнения функций выживаемости использовался log-rank критерий, для сравнения кумулятивных рисков - критерий Грея (gray test). Различия считались статистически значимыми приp-value < 0,05.

Таблица 2

Информация о составе кондиционирования, серотерапии и проведенной профилактике РТПХ

Кондиционирование Число пациентов

Треосульфан/флударабин 41

тиотепа 8

мельфалан 33

ТВ/флударабин 6

вепезид 6

Серотерапия 47

Тимоглобулин 45

Без серотерапии 2

Посттрансплантационная профилактика РТПХ 47

Бортезомиб на -5 -2 +2 +5 дни 47

Результаты

Частоты KIR генов и гаплотипов у доноров. На рисунке 3 изображены частоты встречаемости конкретных KIR генов у доноров. Три гена (2DL4, 3DL2, 3DL3) и один псевдоген (3DP1), как и ожидалось, были обнаружены у всех доноров, поскольку они являются «структурными» и присутствуют всегда. Наиболее часто встречающимся активирующим KIR геном оказался 2DS4, обнаруженный у 43 доноров (91,5 %), а самым частым ингибирующим -3DL1 (91,5 %, 43 доноров). Гены 2DS1, 3DS1 и 2DL5A, находящиеся в теломерной части, обычно наследуются совместно и были обнаружены у 16 донора (34 %), что определяло присутствие у таких доноров теломерного мотива TelB. Гены 2DS2 и 2DL2, обнаруженные у 24 доноров (51 %), также наследуются совместно и определяют центромерный мотив CenB.

Медианы активирующих, ингибирующих и общего количества KIR генов у доноров составили 2 (диапазон 1-6), 6 (диапазон 5-9) и 9 (диапазон 7-15) соответственно. Шестнадцать доноров (34 %) имели KIR гаплотип A и 31 (66 %) KIR гаплотип B.

Рис. 3. Частоты активирующих и ингибирующих KIR генов у доноров

Три описанные модели NK аллореактивности были использованы для определения влияния потенциальной донорской аллореактивности на риск развития рецидива и выживаемость у пациента. Учитывая предыдущие публикации, модели «лиганд-лиганд» и «рецептор-лиганд» были применены для пациентов, получивших гаплоидентичную трансплантацию ГСК (n = 27). Тринадцать доноров (48 %) были потенциально аллореактивены по модели «лиганд-лиганд», 17 доноров (63 %) - по модели «рецептор-лиганд». Модели «рецептор-лиганд» и оценка влияния количества KIR генов были использованы для всей группы пациентов. По модели «рецептор-лиганд» потенциальной аллореактивностью обладал 31 донор (66 %). Дополнительно был проанализирован KIR B-контент донора. Тридцать доноров (64 %) имели нейтральный В-контент, 8 доноров (17 %) - лучший и 9 доноров (19 %) - наилучший. Для группы пациентов с неродственной трансплантацией ГСК модель «рецептор-лиганд» не использовалась из-за небольшого количества пациентов в данной группе и наличия неполностью HLA-идентичных доноров (30 % данной группы).

Результаты по всей группе пациентов. К моменту проведения анализа медиана времени наблюдения выживших пациентов после трансплантации ГСК составила 1,6 года (минимум - 200 дней, максимум - 2,9 лет).

Приживление нейтрофильного ростка у всех пациентов зафиксировано на 9-25 сутки (медиана 13 суток) после трансплантации ГСК.

Кумулятивный риск развития рецидива для всей когорты пациентов через полтора года после трансплантации ГСК составил 0,21 (95 % ДИ 0,12-0,37) (рис. 4). Безрецидивная выживаемость всех пациентов после проведения трансплантации ГСК с деплецией aß Т лимфоцитов составила 0,71 (9 5% ДИ 0,57-0,84); общая выживаемость - 0,79 (95 % ДИ 0,67-0,91) (рис. 5).

Рис. 4. Кумулятивный риск развития рецидива после трансплантации ГСК во всей группе пациентов (п = 47)

Рис. 5. Общая выживаемость во всей группе пациентов после трансплантации ГСК (п = 47)

При анализе рисков развития рецидива, общей и безрецидивной выживаемости в общей группе пациентов в зависимости от таких факторов как несоответствие KIR донора и HLA пациента по модели «рецептор-лиганд», количество активирующих, ингибирующих и общее число KIR генов, статистически значимых различий при однофакторном анализе не обнаружено (табл. 3).

Таблица 3

Кумулятивный риск рецидива, безрецидивная и общая выживаемость для всей группы пациентов

Группа пациентов ТУ =47 2081/ЗВ81/201.5А отсутствуют присутствуют ювтоы отсутствуют присутствуют К1К 5-контент «АГен/га/» «ЛеШг» Количество активирующих КШ генов < медианы > медианы Количество ннгнбируюшнх КШ генов < медианы > медианы Общее количество КШ генов < медианы > медианы

% 95 % ДГ1 Р % 95 % ДИ Р % 95 %ДИ Р % 95 % ДИ Р % 95 % ДИ Р % 95 % ДН Р

Кумулятивный риск рецидива 32.1 16.2—63.7 0.6 1 39,6 17,6-88.7 0.40 34.6 18.1-66.0 0.26 32,8 10.8-99.9 0.76 0 0 0,35 30,5 11.1-83,7 0.72

27,5 8.6-87,9

17,2 6.2-47.9 19.6 8.2-47.1 0 0 25,0 13.3^17,3 30.2 16.3-55.7 26.7 13.6-52,5

Безрецнднвная выживаемость 64.3 41.8—86,7 0.5 8 51,7 19.1-84,4 0.44 58.8 35,7-81.8 0.46 60.9 23.6-98,3 0.61 66.7 13,3-100 0.88 64.8 33.4-96.2 0.40

60.0 24.4-95.6

67.0 45.1—88.9 72.1 52.8-91,3 88.9 68.4-100 65,3 47,7-82.9 63.0 43.9-82.2 61.8 41.8-81.8

Общая выживаемость 80.6 61.9-99,3 0.0 9 66.3 45.3-87,2 0.12 73.0 51.9-94.1 0.39 80,2 60.0-100 0.80 66.7 13,3-100 0,71 79.8 62.1-97.6 0.69

60.0 24.4-95.6

64.3 40.6-88.1 81.5 60.2-100 88.9 68.4-100 69.8 48.6-91.0 72.5 54.7-90.4 67,7 42.7-92.7

При анализе влияния KIR В-контента донора на эффективность трансплантации ГСК выявлена тенденция к снижению риска развития рецидива с худшими результатами в группе пациентов с нейтральным В-контентом («neutral») (n = 30) - 0,35 (95 % ДИ 0,18-0,66) по сравнению с пациентами с лучшим («better») B-контентом (n = 8) - 0,28 (95 % ДИ 0,09-0,88), и с наилучшим («best») B-контентом (n = 9) - 0 (95 % ДИ 0,00-0,00) р = 0,264 (рис. 6). Аналогичный тренд обнаружен при оценке риска развития рецидива в зависимости от присутствия CenВ-мотива (гены KIR2DS2 и KIR2DL2) (табл. 3).

Рис. 6. Риск развития рецидива у пациентов, получивших гаплоидентичную трансплантацию ГСК, в зависимости от KIR В-контента донора

При анализе общей выживаемости пациентов в зависимости от KIR B-контента донора отмечалась тенденция в сторону улучшения выживаемости пациентов, чьи доноры имели наилучший («best») B-контент (n = 9) - 0,89 (95 % ДИ 0,68-1,00) по сравнению с пациентами, чьи доноры были с лучшим («better») B-контентом (n = 8) - 0,60 (95 % ДИ 0,24-0,96) и нейтральным («neutral») (n = 24) - 0,73 (95 % ДИ 0,52-0,94), р = 0,392, однако различие также не достигло статистической значимости.

При сравнении общей и безрецидивной выживаемости пациентов в зависимости от присутствия CenВ-мотива (гены KIR2DS2 и KIR2DL2), отмечался тренд в сторону повышения выживаемости у пациентов c присутствием CenB-мотива (данные приведены для общей выживаемости): (n = 24) - 0,82 (95 % ДИ 0,60-1,00) против 0,66 (95 % ДИ 0,45-0,87) при его отсутствии (n = 23), однако без статистической значимости (р = 0,122) (рис. 7).

Десять (21 %) из 47 пациентов умерли после трансплантации ГСК с TURaP+ деплецией. Кумулятивная вероятность смертности, ассоциированной с процедурой трансплантации ГСК, составила 0,09 (95 % ДИ 0,03-0,22) (рис. 8). Медиана смертности, ассоциированной с трансплантацией ГСК, составила 0,21 года от трансплантации ГСК (0,06-0,24 года). Причинами смерти были тяжелые бактериальные и вирусные инфекции.

Рис. 7. Общая выживаемость пациентов, получивших гаплоидентичную трансплантацию ГСК, в зависимости

от присутствия СепВ мотива

Рис. 8. Кумулятивная вероятность ассоциированной с трансплантацией ГСК смерти во всей группе пациентов (п = 47)

Результаты по моделям «лиганд-лиганд» и «рецептор-лиганд»в группе пациентов с гаплоидентичной трансплантацией ГСК. При трансплантации ГСК от ИЬЛ-гаплоидентичных доноров потенциальная ЫК аллореактивность доноров, предсказанная по модели «рецептор-лиганд», не оказала влияния на риск развития рецидива и выживаемость пациентов. При анализе по модели «лиганд-лиганд» наблюдалась тенденция к сниже-

нию риска рецидива и увеличению безрецидивной выживаемости пациентов в случае потенциальной NK аллореактивности донора однако без статистической значимости: (n = 14) 0,14 (95 % ДИ 0,04-0,51) против 0,08 (95 % ДИ 0,01-0,59), (n = 13) для риска рецидива (p = 0,562) и (n = 13) - 0,85 (95 % ДИ 0,65-1,00) против 0,71 (95 % ДИ 0,48-0,95), (n = 14) для безрецидивной выживаемости (p = 0,403).

Обсуждение. Совместимость донора и реципиента по HLA-антигенам всегда являлась самым важным критерием, который учитывается при проведении аллогенной трансплантации ГСК. Появление метода селективной деплеции ар Т лимфоцитов дало возможность успешно проводить трансплантации ГСК от неполностью совместимых доноров (в том числе от гаплоидентичных), при этом риск отторжения трансплантата и развития РТПХ существенно снижается благодаря сохранению в трансплантате NK клеток. С учетом установленной ведущей роли KIR рецепторов в функционировании NK клеток и противоречивых данных о возможном влиянии KIR генотипа донора на эффективность различных типов трансплантаций ГСК, в данном исследовании проведена оценка NK аллореактивности донора в условиях неродственной и гаплоидентичной трансплантации ГСК с деплецией а/р Т лимфоцитов в группе детей с острыми лейкозами. Во избежание отсутствия влияния дополнительных факторов на иммунную реконституцию в посттрансплантационный период, сформирована «чистая» выборка пациентов, получавших одинаковую профилактику РТПХ.

В данной работе не было получено достоверных результатов значимости KIR генотипа донора, хотя прослеживались тенденции к снижению риска развития рецидива и увеличению общей и безрецидивной выживаемости пациентов, донор которых имел KIR В генотип (гены KIR2DS2 и KIR2DL2).

Также не было получено значимого влияния NK аллореактивности донора, предсказанной по модели «лиганд-лиганд» и «рецептор-лиганд», на риск развития рецидива и выживаемость пациентов в группе пациентов, получивших гаплоидентичную трансплантацию ГСК и одинаковую профилактику РТПХ.

Впервые феномен NK аллорективности в трансплантации ГСК был показан Rugerri et. al. в 2002 году. Пациенты с диагнозом ОМЛ, которым была проведена HLA-гаплоидентичная трансплантация ГСК от потенциально NK аллореактивного донора имели 60 %-ю пятилетнюю выживаемость по сравнению с 5 %-й у реципиентов с донором без таковой. У реципиента наблюдалось существенное снижение риска рецидива, отторжения трансплантата и развития РТПХ в случае трансплантации ГСК от потенциально аллореактивного донора. Подобный эффект подтвержден экспериментами на мышах, в которых было продемонстрировано, что донорские аллореактивные NK клетки уничтожают Т-лимфоциты реципиента, что препятствует отторжению трансплантата. В тоже время, аллореактивные NK клетки донора элиминируют и антиген-представляющие клетки (АПК) реципиента, и остаточные лейкеми-ческие клетки, что в свою очередь подавляет развитие острой РТПХ и снижает риск рецидива соответственно [15]. Однако, подобного эффекта не было показано для реципиентов с ОЛЛ, что объяснялось возможной неспособностью NK клеток уничтожать лейкемические клетки при ОЛЛ из-за дефицита экспрессии на них молекул межклеточного взаимодействия (ICAM-1) [28].

После публикации результатов Rugerri et. al. множество трансплантационных центров по всему миру провели свои подобные ретроспективные исследования, которые редко демон-

стрировали достоверные результаты положительного влияния донорской аллореактивности, но, что удивительно, в большинстве случаев был получен полностью противоположный ожидаемому результат - негативный в контексте трансплантации ГСК эффект ЫК-аллореактивных доноров. Полученное разнообразие результатов можно объяснить отличием, главным образом, в трансплантационных протоколах [18]. Использовавшаяся при про-цессинге трансплантата позитивная селекция СП34-позитивной фракции (Я^егп et а1.) давала возможность отказаться от фармакологической иммунносупрессии в посттраснплантаци-онный период. Такие условия позволяют ЫК клеткам донора интенсивно восстанавливаться в первые недели после трансплантации, причем в отсутствие Т лимфоцитов [15]. Таким образом, аллореактивность ЫК клеток донора максимально реализуется, вероятно, в условиях отсутствия профилактики РТПХ и конкуренции Т-лимфоцитов за гомеостатические цитокины. Однако для СП34+ селекции характерна более поздняя иммунная реконституция и присутствие риска первичной недостаточности трансплантата. В данном исследовании в качестве метода подготовки трансплантата использовалась деплеция а/р Т лимфоцитов, для которого характерно сохранение в трансплантате некоторого количества зрелых донорских ЫК клеток, однако их антитиволейкемические эффекты могут в меньшей степени зависеть от ЫК аллор-еактивности, чем у незрелых КК клеток, регенерирующих после трансплантации ГСК с СП34+ селекцией. Также, до конца непонятно, может ли имеющееся количество донорских ЫК клеток в трансплантате оказаться достаточным для лизиса АПК, Т лимфоцитов реципиента и остаточных лейкемических клеток, а с другой стороны, могут ли вновь развивающиеся ЫК клетки оказывать аллореактивный эффект у реципиента. Для предотвращения развития острой РТПХ аллореактивные ЫК клетки должны успеть уничтожить АПК реципиента до того, как начнется их взаимодействие с донорскими Т-лимфоцитами, то есть это должно произойти практически сразу после трансплантации ГСК и, кажется, маловероятным то, что за такой короткий срок вновь развивающиеся ЫК клетки достигнут достаточного для этого количества, особенно при проведении посттрансплантационной иммунносупрессивной терапии [18]. До сих пор открытым остается вопрос о скорости формирования и времени циркулирования донорских аллореактивных клонов ЫК клеток. Посттрансплантационный мониторинг за экспрессией рецепторного фенотипа ЫК клеток вносит некоторую определенность, но опубликованные результаты довольно неоднозначны. Некоторые исследования показали, что в ранний посттрансплантационный период, ЫК клетка имеет несущественную экспрессию К1Я рецепторов, что возможно указывает на низкий потенциал аллореактивности [29, 30]. В тоже время, Rugerri et. а1. детектировали аллореактивные клоны у большинства исследуемых пациентов (п = 24, гаплоидентичная трансплантация ГСК) до 90 дней посттрансплантационного периода. К 4-7 месяцам после трансплантации ГСК количество таких алло-реактивных ЫК клеток постепенно снижалось, а через год не определялось ни у одного из исследуемых. Эти данные позволяют предположить, что «обучение» ЫК клеток в первые несколько месяцев после трансплантации ГСК происходит под влиянием ИЬЛ антигенов донора, но в конечном итоге фенотип приобретается под влиянием ИЬЛ антигенов реципиента [31]. В некоторых других исследованиях обнаруживались аллореактивные ЫК клоны, циркулирующие иногда до 5 лет [32, 33].

Заключение. Проведённое исследование показало существенное преобладание доноров с нейтральным КШ В контентом (64 %), и соответственно очень малое количество доноров с

наилучшим B контентом (19 %), что, вероятно, могло сказаться на отсутствии статистической значимости влияния NK аллореактивности на исходы трансплантации ГСК. Однако выявленные в исследовании тенденции позволяют предположить важность результатов KIR ти-пирования при подборе донора для аллогенной трансплантации ГСК.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Caligiuri M. Human Natural killer cells. Blood. 2008; 112: 461-469.

2 Vivier E. et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 2011; 331:44-49

3 Colucci F. et al. What does it take to make a natural killer? Nature Reviews Immunology. 2003; 3:413-425.

4 Lee S. et al. Keeping NK cells in highly regulated antiviral warfare. Trends in Immunology. 2007; 28:252-259.

5 Smyth M. et al. New aspects of natural-killer-cell surveillance and therapy of cancer. Nature Reviews Cancer; 2:850-861

6 Cooper M. et.al. Human Natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset. 2001. Blood; 97:3146-3151.

7 Freud A. et al. Human Natural killer cell development. Nature Reviews Immunology. 2006; 214:56-72.

8 Jacobs R. et al. CD56bright cells differ in their KIR repertoire and cytotoxic features from CD56dim NK cells. European Journal of Immunology. 2001; 31:3121-3127.

9 Fehniger T. et al. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity. Blood. 2003; 101:3052-3057.

10 Cooper M. et al. NK cell and DC interactions. Trends in Immunology. 2004; 25:47-52.

11 Lanier L. et al. Natural killer cell receptor signaling. Current opinion in Immunology. 2003; 15:308-314.

12 McQueen KL., Parham P. Variable receptors controlling activation and inhibition of NK cells. Current opinion in Immunology. 2002;14:615-21.

13 Long E. et al. Inhibition of natural killer cell activation signals by killer cell immunoglobulin-like receptors (CD158). Nature Reviews Immunology. 2001; 181:223-233.

14 Ljunggren HG., Karre K. In search of the «missing self»: MHC molecules and NK cell recognition. Immunology today. 1990;11:237-44.

15 Rugerri L., Capanni M., Casucci M., Volpi I., et al. Role of natural killer cell alloreactivity in HLA-mismatched hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 1999;94:333-39

16 Uhrberg M., Valiante NM., Shum BP., et al. Human diversity in killer cell inhibitory receptor genes. Immunity. 1997;7:753-63.

17 Witt CS., Dewing CB., Sayer DC., et al. Population frequencies and putative haplotypes of the killer cell immunoglobulin-like receptor sequences and evidence for recombination. Transplantation. 1999;68:1784-89.

18 Mehra NK., Kaur G., McCluskey J., et al. The HLA complex in Biology and Medicine: A Resource Book. 2010; 31: 526-27.

19 Savani B.N., Mielke S., Adams S., Uribe M. et al. Rapid natural killer cell recovery determines outcome after T-cell-depleted HLA-identical stem cell transplantation in patients with myeloid leukemias but not with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2007;21:2145-52

20 Maschan M., Shelikhova L., Ilushina M. et al. TCR-alpha/beta and CD19 depletion and threosulfan-based conditioning regimen in unrelated and haploidentical transplantation in children with acute myeloid leukemia. Bone Marrow Transplant 2016;51(5):668-74

21 Balashov D., Shcherbina A., Maschan M. et al. Single-center experience of unrelated and haploidentical stem cell transplantation with TCR-alpha/beta and CD19 depletion in children with primary immunodeficiency syndromes. Biol Blood Marrow Transplant. 2015;21(11):1955-62

22 Laberko A., Bogoyavlenskaya A., Shelikhova L. et al. Risk Factors and the Clinical impact of Cytomegalovirus and Epstein-Barr Virus infections in Pediatric Recipients of TCR-alpha/beta Г and CD19-Depleted Grafts. Biol Blood Marrow Transplant. 2017;23(3):483-490.

23 Balashov D., Laberko A., Shcherbina A. et al. A Conditioning Regimen with Plerixafor is Safe and Improves the Outcome of TCR-alpha/beta and CD19+-Cell-Depleted Stem Cell Transplantation in Patients with Wiskott-Aldrich Syndrome. Biol Blood Marrow Transplant. 2018.

24 http://hla.alleles.org/dictionary/index.html

25 Biassoni R., Vanni I., Ugolotti E. Killer Immunoglobulin-like Receptors and Their Ligands. Histocompatibility book. 2012. 6: 97-99.

26 http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir

27 Cooley S., Weisdorf DJ., Guethlein LA. et al. Donor selection for natural killer receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 2010;116:2411-19.

28 Oevermann L., Sebastian U. Michaelis, Markus Mezger, Peter Lang, et al. KIR B haplotype donors confer a reduced risk for relapse after haploidentical transplantation in children with ALL. Blood. 2014; 124:2744-47.

29 Shilling H.G., McQueen K.L., Cheng N.W. et al. Reconstitution of NK cell receptor repertoire following HLA-matched hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2003; 101:3730-40.

30 Pende D., Marcenaro S., Falco M., et al. Anti-leukemia activity of alloreactive NK cells in KIR ligand-mismatched haploidentical HSCT for pediatric patients: Evaluation of the functional role of activating KIR and re-definition of inhibitory KIR specificity. Blood. 2008; 113:3119-29.

31 Rugerri L., Mancusi A., Capanni M. et al. Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia: Challenging its predictive value. Blood. 2007; 110:433-40.

32 Locatelli F., Pende D., Maccario R. et al. Haploidentical hematopoietic stem cell transplantation for the treatment of high-risk leukemias: How NK cells make the difference. Clin Immunol. 2009; 133(2):171-8.

33 Triplett B., Handgretinger R., Pui C.H., et al. KIR-incompatible hematopoietic-cell transplantation for poor prognosis infant acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2006; 107:1238-39.

Рукопись получена: 12 февраля 2019 г.

Принята к публикации: 14 февраля 2019 г.