международная научно-практическая конференция , t „Молоко 2050: наукоемкие РЕШЕНИЯ
Научная статья
УДК 637.12.04/.07
DOI: 10.52653/PPI.2022.3.3.014
Анализ углеводного состава низколактозного молока методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Ииколай Анатольевич Жижин
внии молочной промышленности, москва, n_zhizhin@vnimi.org
Аннотация. Молоко и продукты его переработки являются важным аспектом сбалансированного питания человека. Однако проблема непереносимости лактозы связанная с недостаточной выработкой фермента лактазы, актуальна во всем мире. По этой спрос на низколактозную продукцию достаточно постоянен, что в свою очередь приводит к расширению ее ассортимента. В настоящее время рынок молочной продукции, прошедшей технологический процесс ферментативного расщепления лактозы ежегодно наращивает темпы роста. Основным способом, применяемым для получения молока и молочной продукции с пониженным содержанием лактозы или полным ее отсутствием является внесение фермента р-галактозидазы. Внесение ферментных препаратов в пищевую продукцию требует тщательного расчета, поскольку как недостаток, так и избыточное содержание р-галактозидазы в продукте может приводить к нежелательным последствиям. Избыток содержания фермента лактазы согласно литературным данным влияет на процесс протекания протеолизаи как следствие влияет на сроки хранения низколактозной продукции. В то время как недостаток приведет к неполному гидролизу и повышению остаточного содержания лактозы в продукте. В связи с этим также актуально совершенствование методик для подтверждения «статуса» низколактозной продукции. Одним из наиболее широко используемых методов для количественной оценки углеводов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В данной статье рассмотрены два хро-матографических подхода для анализа углеводного состава молока с использованием катионообменной и аминофазной колонок, а также проведен их сравнительный анализ. Основываясь на полученных экспериментальных данных было выявлено, что использование хроматографической колонки с аминопропильной фазой позволяет разделять моно- и дисахариды молока и молочной продукции с более высоким разрешением (а>1), чем на катионообменной колонке. Также время проведения анализа с применением аминофазной колонки было сокращено с 30 до 15 мин. На основе выработанного подхода проведена проверка робастности, использованной хроматографической методики. Показана возможность использования данной методики для количественной оценки моно- и дисахаридов молока и молочной продукции с концентрацией определяемых компонентов менее 0,1 %.
Ключевые слова: низколактозное молоко, ВЭЖХ, углеводный состав
Для цитирования: Жижин Н. А. Анализ углеводного состава низколактозного молока методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Пищевая промышленность. 2022. № 3. С. 60-63.
Original article
Analysis of the carbohydrate composition of low-lactose milk by highperformance liquid chromatography
Nikolay A. Zhizhin
All-Russian Dairy Research Institute, Moscow, n_zhizhin@vnimi.org
Abstract. Milk and its products are an important aspect of a balanced human diet. However, the problem of lactose intolerance associated with insufficient production of the lactase enzyme is relevant throughout the world. Therefore, the demand for low-lactose products is quite constant, which in turn leads to the expansion of its range. Currently, the market for dairy products that have undergone the technological process of enzymatic breakdown of lactose annually increases its growth rate. The main method used to obtain milk and dairy products with a reduced content of lactose or its complete absence is the introduction of the enzyme p-galactosidase. The introduction of enzyme preparations into food products requires careful calculation, since both a deficiency and an excess of p-galactosidase in a product can lead to undesirable consequences. An excess of the lactase enzyme content, according to the literature data, affects the process of proteolysis and, as a result, affects the shelf life of low-lactose products. While a deficiency will lead to incomplete hydrolysis and an increase in the residual lactose content in the product. In this regard, it is also important to improve methods for confirming the "status" of low-lactose products. One of the most widely used methods for quantifying carbohydrates is high performance liquid chromatography (HPLC). In this article, two chromatographic approaches for the analysis of the carbohydrate composition of milk using cation exchange and amino-phase columns are considered, and their comparative analysis is carried out. Based on the experimental data obtained, it was found that the use of a chromatographic column with an aminopropyl phase makes it possible to separate mono- and disaccharides of milk and dairy products with a higher resolution (а>1) than on a cation-exchange column. In addition, the time of analysis using an aminophase column was reduced from 30 to 15 minutes. Based on the developed approach, the robustness of the chromatographic technique used was tested. The possibility of using this technique for the quantitative assessment of mono- and disaccharides of milk and dairy products with the concentration of the determined components of less than 0.1 % is shown.
Keywords: low-lactose milk, HPLC, carbohydrate composition
For citation: Zhizhin N. A. Analysis of the carbohydrate composition of low-lactose milk by high-performance liquid chromatography // Food processing industry. 2022;(3):60-63 (In Russ.).
Автор, ответственный за переписку: Николай Анатольевич Жижин, n_zhizhin@vnimi.org
Corresponding author: Nikolay A. Zhizhin, n_zhizhin@vnimi.org
© Жижин Н. А., 2022
60
3/2022 пищевая промышленность issn 0235-2486
МОЛОКО 2050: НАУКОЕМКИЕ РЕШЕНИЯ^
_BHI
AND TECHNOLOGY
Введение. Молочные продукты являются частью сбалансированного питания человека. Однако их употребление может быть связано с проблемой, которая, по некоторым оценкам, затрагивает около 70 % взрослого населения - непереносимость лактозы.
Непереносимость лактозы наиболее часто связана с недостаточным количеством фермента лактазы, которая в норме содержится в ворсинках двенадцатиперстной кишки и расщепляет дисахарид лактозу на две ее составляющие - глюкозу и галактозу. В случае когда фермент лактаза вырабатывается в недостаточном количестве или не вырабатывается совсем, расщепление молочного сахара не происходит, что приводит к накоплению лактозы в толстом кишечнике. Далее она начинает ферментироваться микрофлорой кишечника, что приводит к различным негативным кишечным проявлениям [1, 2].
Медицинский подход к решению данной проблемы направлен на диетическое питание, исключающее продукты, содержащие лактозу. Тем не менее полный отказ от молочных продуктов нецелесообразен, так как они обеспечивают организм человека высокоусвояемыми формами кальция и сбалансированным белком [3].
Для удовлетворения потребностей людей с лактазной недостаточностью в настоящее время разработаны линейки молочной продукции с пониженным содержанием лактозы или полным ее отсутствием. Это достигается за счет внесения экзогенной лактазы (р-галактозидазы) в молоко с целью предварительного расщепления лактозы на глюкозу и галактозу. Продукция, произведенная по данной технологии, пользуется спросом не только в России, но и по всему миру [4, 5].
Распространение низколактозной молочной продукции и ее широкий ассортимент требуют наличия методов оценки степени гидролиза лактозы для подтверждения «статуса», заявленного производителем. В том числе следует отметить, что расщепление лактозы меняет пищевую ценность молочной продукции за счет изменения углеводного состава - это необходимо учитывать при употреблении низколактозной продукции - и требует методической базы для ее количественной оценки [6, 7].
Цель работы - рассмотрение возможности количественной оценки содержания
моно- и дисахаридов в низколактоз-ной молочной продукции посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для этого были использованы два варианта ВЭЖХ с использованием катионообменной и аминофазной хроматографической колонки. Проведена их сравнительная оценка для выявления наиболее подходящего хроматографиче-ского пути с целью анализа состава углеводов молочной продукции, прошедшей технологический процесс ферментативного расщепления лактозы.
Материалы и методы. В качестве объектов исследования были использованы молоко сырое, молоко стерилизованное
и коммерческие образцы низколактозного молока.
Для анализа использовались стандарты лактозы, глюкозы, галактозы и лактулозы степени чистоты для ВЭЖХ-анализа.
Хроматографическое исследование проводили посредством жидкостного хроматографа «Маэстро» (Интерлаб, Россия), оснащенного системой подачи элюента, термостатом и рефрактометрическим детектором. Разделение моно- и дисахаридов проводили посредством двух вариантов хроматографических колонок: катионообменной Repro-Gel Са+, 9 мкм, 250*8 мм, в качестве подвижной фазы использовалась деионизированная вода температура
Время, мин
Рис. 2. Хроматографическое разделение смеси углеводов на аминофазной колонке ZORBAX Carbohydrate. 1 - глюкоза, 2 - галактоза, 3 - лактулоза, 4 - лактоза
Молоко 2050: наукоемкие решения
техника и технология
термостата 85 °С и колонки с привитой аминофазой ZORBAX Carbohydrate 4,6*250 мм, 5 микрон, подвижная фаза ацетони-трил/вода в соотношении 75/25, температура термостата 40 °С.
Пробоподготовку осуществляли посредством экстракции углеводов водой с последующим удалением белковой и жировой фракции посредством реактивов Карреза 1 и 2. Перед хроматографическим анализом пробы фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм.
Интерпретацию результатов и количественный расчет проводили в программном обеспечении хроматографа Clarity Interlab.
результаты и их обсуждение. Для
проведения сравнительной оценки двух хроматографических подходов анализа углеводного состава была приготовлена смесь моно- и дисахаридов, состоящая из глюкозы, галактозы, лактозы и лактулозы с концентрацией каждого вещества г/%. Данная смесь была использована для анализа посредством катионообменной и аминофазной колонок (рис. 1, 2).
При проведении оценки эффективности хроматографических колонок было установлено, что при использовании катионообменной колонки время анализа составило 30 мин, в то же время наблюдается неполное разделение пиков лактозы и лактулозы, что в свою очередь приведет к увеличению ошибки количественного расчета содержания лактозы на реальных образцах.
На хроматографической колонке с привитой аминофазой полное разделение смеси углеводов было достигнуто за 15 мин, что вдвое ускоряет процесс анализа. Также коэффициент селективности для всех анализируемых веществ составил а>1, что указывает на пригодность условий хроматографирования для анализа моно- и дисахаридов в молочной продукции. В связи с этим дальнейшие измерения были проведены на амнопропильной колонке ZORBAX Carbohydrate 4,6*250 мм, 5 микрон.
Для установления робастности предложенной методики был проведен хромато-графический анализ углеводного состава молока сырого и образца стерилизованного питьевого молока (рис. 3, 4).
Полученные данные подтверждают работоспособность хроматографической методики, в том числе и предложенный способ пробоподготовки. Это, в част-
Время, мин
Рис. 4. Хроматограмма углеводного состава стерилизованного молока. 1 - лактулоза, 2 - лактоза
62
3/2022 пищевая промышленность issn 0235-2486
МОЛОКО 2050: НАУКОЕМКИЕ РЕШЕНИЯ^
_BHI
AND TECHNOLOGY
ности, отражается в возможности разделения структурных изомеров лактозы и лактулозы. Методику можно использовать для количественного расчета содержания лактулозы в молочной продукции, прошедшей термическую обработку.
Далее были исследованы десять коммерческих образцов низколактозного молока. Общее содержание углеводов в данных образцах варьировалось в пределах от 4,697 до 4,788 г/100 г. Пример хроматограммы представлен на рис. 5.
Во всех исследованных образцах содержание лактозы было на уровне нижнего предела обнаружения метода <0,1 %, что позволяет отнести эти продукты к группе низколактозной молочной продукции.
Заключение. Сравнительная оценка двух хроматографических подходов для анализа углеводов с использованием ка-тионообменной и аминофазной колонок показала преимущество использования колонок с привитой аминопропильной фазой. Что выражалось в ускорении времени анализа с 30 до 15 мин, а также в лучшем разделении аналитов. Коэффициент селективности для всех анализируемых веществ составил а>1.
Предложенная методика позволяет разделять и количественно рассчитывать основные моно- и дисахариды молока и молочной продукции за один анализ.
Использование данной хроматографи-ческой методики также позволяет разделять структурные изомеры лактозу и лактулозу, что можно использовать для оценки тепловой нагрузки на молоко.
Список источников
1. Абатуров Е. А., Никулина А. А., Пе-тенко Л. Л. Лактазная недостаточность у детей // Международный журнал педиатрии, акушерства и гинекологии. 2015. Т. 7. № 2. С. 51-63.
2. Facioni M. S., Raspini B., Pivari F., Dogliotti E., Cena H. Nutritional management of lactose intolerance: The importance of diet and food labelling. Journal of Translational Medicine. 2020. No. 18. P. 1-9. Doi: 10.1186/ S12967-020-02429-2
3. Мухина Ю. Г., Шумилов П. В., Дубровская М. И. Лактазная недостаточность у детей: опыт применения фермента лактаза // Вопросы практической педиатрии. 2010. Т. 5. № 5. С. 77-84.
4. Milknews - новости молочного рынка [Электронный ресурс]. https://mi1knews.ru/ interviu i blogi/bezlaktoznoe molokovkusvill. html. 28.02.2021
5. Dekker P. J., Koenders D., Bruins M. J. Lactose-free dairy products: Market developments, production, nutrition and health benefits. Nutrients. 2019. No. 11. P. 551. Doi: 10.3390/nu11030551
6. Юрова Е. А. Разработка современных методов анализа для идентификации молока и молочной продукции // Молочная река. 2019. № 2. С. 22-25.
7. Юрова Е. А., Кобзева Т. В., Полякова О. С. Разработка методик измерений на основе высокоэффективных методов анализа // Переработка молока. 2016. № 5. С. 6-9.
References
1. Abaturov E. A., Nikulina A. A., Petenko L. L. Lactase deficiency in children // Mezhdunarodnyj zhurnal pediatrii, akusherstva i ginekologii = International journal of obstetrics and gynecology. 2015;7(2):51-63 (In Russ.).
2. Facioni M. S., Raspini B., Pivari F., Dogliotti E., Cena H. Nutritional management of lactose intolerance: The importance of diet and food labelling. Journal of Translational Medicine. 2020;(18):1-9. Doi: 10.1186/ s12967-020-02429-2
3. Muhina Yu. G., Shumilov P. V., Dubrovs-kaya M. I. Lactase deficiency in children: experience with the enzyme lactase. Voprosy prakticheskoj pediatrii = Questions of practical pediatrics. 2010;5(5):77-84 (In Russ.).
4. Milknews (Electronic resource]. https:// milknews.ru/interviu i blogi/bezlaktoznoe molokovkusvill. html. 28.02.2021.
5. Dekker P. J., Koenders D., Bruins M. J. Lactose-free dairy products: Market developments, production, nutrition and health benefits. Nutrients. 2019;(11):551. Doi: 10.3390/nu11030551
6. Yurova E. A. Development of modern methods of analysis for the identification of milk and dairy products. Molochnaya reka = Dairy River. 2019;(2):22-25 (In Russ.).
7. Yurova E. A., Kobzeva T. V., Polyakova 0. S. Development of measurement techniques based on highly efficient methods of analysis. Pererabotka moloka = Milk processing. 2016;(5): 6-9 (In Russ.).
Информация об авторе
Жижин Николай Анатольевич, канд. техн. наук
ВНИИ молочной промышленности, 115093, Москва, ул. Люсиновская, д. 35, n_zhizhin@vnimi.org
Информация об авторе
Nikolay A. Zhizhin, Candidate of Technical Sciences
All-Russian Dairy Research Institute, 35, Lyusinovskaya str., Moscow,
115093, n_zhizhin@vnimi.org
Статья поступила в редакцию 20.01.2022; одобрена после рецензирования 24.01.2022; принята к публикации 26.01.2022. The article was submitted 20.01.2022; approved after reviewing 24.01.2022; accepted for publication 26.01.2022.