CC BY
60
УДК 581.1
М.В. Ефимова1, 2, А.К. Кравцов2, В.В. Кузнецов2
1Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск, Россия) 2Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва, Россия)
АНАЛИЗ ТРАНСКРИПЦИИ ПЛАСТИДНЫХ ГЕНОВ Hordeum vulgare В ТЕМНОТЕ
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 11-04-90806-моб_ст, 12-04-90716-моб_ст).
С помощью метода run-on транскрипции изучена транскрипция 16 пластид-ных генов в первых этиолированных листьях ячменя (Hordeum vulgare L.). Анализируемые гены относятся к функционально-различным группам генов пластома. Прежде всего это гены, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации фотосинтеза: гены фотосистем I, II, ген большой субъединицы РБФК, АТФ синтетазного комплекса - atp - и субъединица F НАДФН пластохи-ноноксидоредуктазы - ndhF. Среди генов «домашнего хозяйства» была изучена транскрипция гена, кодирующего ß субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S и 23S рибосомной РНК (rrn16 и rrn23); гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y). В результате проведенных исследований нами показана дифференциальная транскрипция пластидных генов.
Ключевые слова: ячмень; пластидные гены; run-on транскрипция; этиоляция.
Введение
Для реализации основной энергетической функции света растениям необходимо сформировать фотосинтетический аппарат. Особое внимание привлекает процесс регуляции транскрипции в связи с тем, что транскрипция является первым этапом экспрессии генов и от нее зависит не только количество индивидуальных мРНК, но и накопление белка, что прямо влияет на превращение этиопластов в хлоропласты и переход этиолированных растений к автотрофному питанию. Среди многочисленных методов исследования, позволяющих оценивать относительное содержание индивидуальных РНК в клетке, можно выделить метод микрочипов, ПЦР в реальном времени, нозерн- и дот-гибридизации. Единственный метод, демонстрирующий вклад процесса транскрипции в регуляцию содержания мРНК и позволяющий определить скорость транскрипции генов, - метод run-on транскрипции [1]. Данный метод основан на способности изолированных органелл в течение непродолжительного времени осуществлять транскрипцию генов. В нашем исследовании с помощью метода run-on транскрипции оценивалась транскрипция пластидных генов проростков ячменя.
Материалы и методики исследования
Для анализа экспрессии пластидного генома ячменя на уровне транскрипции начальным этапом является выделение хлоропластов. При выделении хлоропластов использовали ступенчатый градиент перкола (40 и 70%), который позволяет очистить хлоропласты от ядер и митохондрий и отделить интактные хлоропласты от разрушенных. Для дальнейшей работы брали 5х107 хлоропластов для каждого варианта.
Подсчет количества хлоропластов производили на микроскопе Micros MC 100 (Австрия) в камере Розенталя - Фукса. Синтез меченых транскрип-тов в хлоропластном лизате, ДНК-РНК гибридизацию и экспозицию нейлоновой мембраны с рентгеновской пленкой проводили согласно методике проведения run-on анализа [1-3].
После гибридизации радиоактивные сигналы отсканировали и оцифровали, используя Phosphorimager Typhoon Trio (сканер Typhoon TRIO+ Variable Mode Imager с пакетом программ Typhoon Scaner Control) и ImagerQuant TL Control Centre («GE Healthcare», США).
Результаты исследования и обсуждение
Нами проанализирована транскрипция 16 пластидных генов ячменя, относящихся к функционально-различным группам генов пластома. Прежде всего, это гены, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации фотосинтеза: гены фотосистемы I - psa (psaA и psaB), фотосистемы II -psb (psbA, psbD иpsbK), ген большой субъединицы РБФК (rbcL), АТФ синтетазного комплекса - atp (atpB) и субъединица F НАДФН пласто-хиноноксидоредуктазы - ndhF.
Среди генов «домашнего хозяйства» была изучена транскрипция гена, кодирующего ß субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S и 23S рибосомной РНК (rrnl6 и rrn23); гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y) и др. Подробное описание анализируемых генов приведено в статьях Kravtsov et al., Zubo et al. и Bork [4-6].
Радиоавтографы типичного опыта, полученные в ходе run-on эксперимента с пластидами из первых листьев этиолированного ячменя, и интенсивность транскрипции, выраженная в условных единицах, показаны на рис. 1, 2.
Радиоавтограмма результатов run-on транскрипции позволяет выделить три условные группы генов с высокой, средней и низкой транскрипционной активностью. Так, к группе генам с высокой транскрипционной активностью можно отнести гены, продукты которых выполняют не только первостепенную роль для реализации процесса фотосинтеза и кодируют белки фотосистемы II (psbA и psbD), большую субъединицу РБФК (rbcL) и АТФ-синтазу (atpB), но и гены «домашнего хозяйства, кодирующие рибосомный белок (rrn16) и транспортную РНК (trnE/trnY).
А
Б
ndhA ndhA petL petL rpl33 rpl33 rps16 rps16
rrn23 rrn23 atpB atpB trnE-Y trnE-Y rpoB rpoB
psbK psbK rbcL rbcL ndhF ndhF rrn16 rrn16
psaA psaA psaB psaB psbA psbA psbD psbD
1400
Рис. 1. Радиограмма результатов run-on транскрипции: А -радиограмма результатов run-on транскрипции; Б - схема нанесения на мембрану ДНК-зондов исследованных генов
S
S
X
с
S
а
о
X
а
х
х
X
о
X
0J
Ё
5
Рис. 2. Интенсивность транскрипции пластидных генов ячменя
В группу со средней транскрибционной активностью можно включить ген фотосистемы I раВ), ген ряЪК., кодирующий К-субъединицу (3,9 кДа) фотосистемы II, и гены рибосомных белков (ггп23 и грз16). Среди генов, проявляющих низкую транскрипционную активность, можно выделить гены, кодирующие F (гнЛИЩ и А (п<ЗИЛ) субъединицы НАДН-пластохиноноксидоредуктазы, ген L субъединицы цитохрома Ь^ (petL) и ген рибосомного белка Ь33 (гр133) (рис. 2). Транскрипционная активность двух генов этиолированных листьев ячменя - р8аЛ и гроВ - в темноте не проявлялась.
Заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований на этиолированных проростках ячменя нами показана дифференциальная транскрипция пластидных генов. Из 16 анализируемых генов наибольшая интенсивность транскрипции отмечена для генов, кодирующих белки фотосистемы II (psbA, psbD и psbK), большую субъединицу РБФК (rbcL), АТФ-синтазы (atpB), ри-босомные белки (rrn16, rrn23 и rps16) и гены транспортной РНК (tmE/tmY).
Литература
1. Зубо Я.О., Кузнецов В.В. Применение метода run-on транскрипции для изучения ре-
гуляции экспрессии пластидного генома // Физиология растений. 2008. Т. 55, № 1. С. 114-122.
2. Ефимова М.В., Кузнецов В.В., Кравцов А.К. и др. Особенности экспрессии пластидного
генома и развития растений Arabidopsis thaliana с нарушенным синтезом брассино-стероидов // Физиология растений. 2012. Т. 59, № 1. С. 32-39.
3. Зубо Я.О., Ямбуренко М.В., Кравцов А.К. и др. Отделенные от растений листья ячменя
как экспериментальная модель для изучения регуляции цитокинином транскрипции пластидных генов // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 609-618.
4. KravtsovA.K., Zubo Y.O., YamburenkoM.V etal. Cytokinin and abscisic acid control plastid
gene transcription during barley seedling de-etiolation // Plant Growth Regulation. 2011. Vol. 64. P. 173-183.
5. Zubo Y.O., YamburenkoM.V., Kusnetsov V.V., Börner T. Methyl jasmonate, gibberellic acid,
and auxin affect transcription and transcript accumulation of chloroplast genes in barley // J. Plant Physiology. 2011. Vol. 168, iss. 12. P. 1335-1344.
6. BockR. Structure, function, and inheritance of plastid genomes // Topics in Current Genetics.
Vol. 19. 2007. R. Bock (Ed.): Cell and Molecular Biology of Plastids. P. 29-65.
Поступила в редакцию 21.07.2011 г. Tomsk State University Journal of Biology. 2012. № 2 (18). P 166-170
Marina V. Efimova1, 2, Alexander K Kravtsov2, Viktor V. Kusnetsov2
1Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia
2Timiryazev Institute of Plant Physiology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
THE ANALYSES OF PLASTID GENE TRANSCRIPTION Hordeum vulgare IN DARKNESS
Experiments were performed with the leaves of barley plants (Hordeum vulgare
L.). The seeds were germinated in soil in the climate-controlled chamber in darkness
at 20-22°C.First true leaves detached from 6-day-old seedlings were used. The age was counted from the moment of seedling emergence above the soil surface. Plastid isolation and run-on transcription in plastid lysates were performed as described Zubo and Kusnetsov, 2008. Etioplasts were isolated from etiolated plants under dark
green light and purified in the discontinuous gradient of Percoll (40 and 70%). In vitro transcription was run for 10 min at 25°C in the lysates of 5 x 107 chloroplasts
in buffer. Fragments of the tested genes (1 ^g) were loaded on the nylon membrane Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biothech, England) in two replications. After their hybridization with 32P-labeled RNAs produced in the reaction of run-on transcription in vitro, radioactive signals were scanned using Phosphorimager Typhoon Trio+ (GE Healthcare, USA).
The rate transcription of 16 chloroplast gene was analyzed. First of all, genes, product which plays supreme role in photosynthesis realization - photosystem I - psa (psaA and psaB), photosystem II - psb (psbA, psbD and psbK), gene of large subunit of Rubisco (rbcL), ATP synthase complex - atp (atpB) and F subunit NADPH of plastochinon oxidoreductase - ndhF. Among «housekeeping» genes the transcription of gene, which code ß subunit of plastid bacterial-type RNA polymerase (rpoB), 16S and 23S rRNA genes (rrn16 and rrn23), also tRNA genes - Gly and Tir (trnE-Y) was investigated.
The results obtained showed that the rate of chloroplast gene transcription in the first barley leaves was significantly dispersed. The highest transcription was marked to genes, which coded protein of photosystem II (psbA, psbB and psbD), large subunit of Rubisco (rbcL), ATP-synthase (atpB), ribosomal proteins (rrn16, rrn23 and rps16), also tRNA genes (trnE/trnY).
Key words: barley; plastid gene; run-on transcription method; etiolation.
Received July 21, 2011
