CC BY
32
https://russjcardiol.elpub.ru doi:10.15829/1560-4071-2020-4132
ISSN 1560-4071 (print) ISSN 2618-7620 (online)
Анализ транскриптома скелетной мускулатуры выявил влияние физических тренировок на молекулярные механизмы регуляции роста и метаболизма мышечной ткани у пациентов с хронической сердечной недостаточностью
Иванова О. А.1,2, Игнатьева Е. В.1, Лелявина Т. А.1, Костарева А. А.1,3, Сергушичев А. А.2, Дмитриева Р. И.1
Галенко В. Л.1, Комарова М. Ю.1, Борцова М.А.1, Ситникова М. Ю.1,
Цель. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) сопровождается истощением скелетной мускулатуры и непереносимостью физических нагрузок. Целью настоящего проекта было исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе терапевтического эффекта персонализированных физических тренировок у пациентов сХСН.
Материал и методы. Секвенирование РНК, полученной из биоптатов мышц скелетной мускулатуры до и после двенадцатинедельного курса тренировок, было использовано для выявления изменений экспрессии генов и сигнальных путей, индуцированных программой физической реабилитации пациентов с ХСН. Результаты. Мы показали, что персонализированные физические тренировки у пациентов с ХСН стимулируют активацию молекулярных путей, контролирующих дифференцировку и функционирование скелетной мусулатуры: коммитирование клеток-предшественников мышечной ткани; механизмы, регулирующие высвобождение кальция и чувствительность сократительного аппарата миофибрилл, электрическую возбудимость мышечной мембраны, генерацию протонного градиента синаптических везикул, поддержание электрохимических градиентов ионов Na+/K+. Также анализ дифференциально экспрессирующихся генов выявил повышение экспрессии транскрипционных факторов MyoD и MEF2, ответственных за дифференцировку стволовых клеток мышц, и саркомерных генов MYOM1, MYOM2, MYH7. Наряду с этим наблюдалась активация экспрессии гена секретируемого сигнального белка CYR61, кандидата на роль прогностического биомаркера для пациентов с ХСН. Заключение. Наши данные показывают, что благоприятный эффект персонализированных аэробных физических тренировок у больных с ХСН зависит, по крайней мере, частично, от улучшения физиологических и биохимических показателей скелетной мускулатуры.
Ключевые слова: сердечная недостаточность, физические тренировки, истощение скелетной мускулатуры, РНК-секвенирование, сигнальные пути, экспрессия генов.
Отношения и деятельность. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 16-15-10178.
1ФГБУ НМИЦ им. В. А. Алмазова Минздрава России, Санкт Петербург, Россия;
^Университет ИТМО, Санкт Петербург, Россия; 3Department of Women's and
Children's Health, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.
Иванова О. А. — м.н.с., группа клеточной биологии, Институт Молекулярной Биологии и Генетики, ORCID: 0000-0002-6163-2162, Игнатьева Е. В. — м.н.с., лаборатория молекулярной кардиологии, Институт Молекулярной Биологии и Генетики, ORCID: 0000-0002-1423-6562, Лелявина Т.А. — в.н.с., НИО сердечной недостаточности, ORCID: 0000-0001-6796-4064, Галенко В. Л. — м.н.с., НИО сердечной недостаточности, ORCID: 0000-0002-0503-167X, Комарова М. Ю. — м.н.с., группа клеточной биологии, Институт Молекулярной Биологии и Генетики, ORCID: 0000-0002-7520-090X, Борцова М. А. — зав. кардиологическим отделением № 8, ORCID: 0000-0002-9694-7850, Ситникова М. Ю. — профессор кафедры внутренних болезней, зав. НИО сердечной недостаточности, ORCID: 0000-0002-0139-5177, Костарева А. А. — директор, Институт Молекулярной Биологии и Генетики, ORCID: 0000-0002-9349-6257, Сергушичев А. А. — доцент факультета информационных технологий и программирования, ORCID: 0000-0003-1159-7220, Дмитриева Р. И.* — в.н.с., руководитель группы клеточной биологии, Институт Молекулярной Биологии и Генетики, ORCID: 0000-0002-3073-7914.
*Автор, ответственный за переписку (Corresponding author): renata.i.dmitrieva@gmail.com
АП — анаэробный порог, MAPK — митоген-активированные протеинкиназы, СК — стволовые клетки, СН — сердечная недостаточность, ХСН — хроническая сердечная недостаточность, VO2 — поглощение кислорода.
Рукопись получена 30.09.2020 Рецензия получена 15.10.2020 Принята к публикации 15.10.2020
Для цитирования: Иванова О. А., Игнатьева Е. В., Лелявина Т.А., Галенко В. Л., Комарова М. Ю., Борцова М. А., Ситникова М. Ю., Костарева А.А., Сергушичев А. А., Дмитриева Р. И. Анализ транскриптома скелетной мускулатуры выявил влияние физических тренировок на молекулярные механизмы регуляции роста и метаболизма мышечной ткани у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Российский кардиологический журнал. 2020;25(10):4132. doi:10.15829/1560-4071-2020-4132
Transcriptome analysis of skeletal muscles revealed the effect of exercise on the molecular mechanisms regulating muscle growth and metabolism in patients with heart failure
Ivanova O. A.1,2, Ignatieva E. V.1, Lelyavina T.A.1, Galenko V. L.1, Komarova M. Yu.1, Bortsova M. A.1, Sitnikova M. Yu.1, Kostareva A. A.1,3, Sergushichev A. A.2, Dmitrieva R. I.1
Aim. Heart failure (HF) is accompanied by skeletal muscle atrophy and exercise intolerance. The aim was to study the molecular mechanisms underlying the therapeutic effect of personalized exercise in patients with HF. Material and methods. RNA sequencing obtained from skeletal muscle biopsies before and after a 12-week exercise course was used to identify changes in gene expression and signaling pathways induced by the physical rehabilitation program for patients with HF.
Results. We have shown that personalized exercise program in patients with HF stimulates the activation of molecular pathways regulating the differentiation and functioning of skeletal muscles: commitment of muscle progenitor cells; mechanisms regulating the calcium release and sensitivity of myofibrillar contraction, electrical excitability of the muscle membrane, synaptic vesicle proton gradient creation, maintenance of electrochemical gradients of Na+/K+. Also, the analysis of differentially expressed genes revealed an increase in the expression
of transcription factors MyoD and MEF2, which are responsible for the differentiation of muscle stem cells, and sarcomeric genes MYOM1, MYOM2, MYH7. Along with this, we observed activation of the CYR61 expression — a potential prognostic biomarker for HF patients.
Conclusion. Our data show that the beneficial effect of personalized aerobic exercise in patients with HF depends, at least in part, on an improvement in the physiological and biochemical parameters of skeletal muscle.
Key words: heart failure, exercise, skeletal muscle atrophy, RNA sequencing, signaling pathways, gene expression.
Relationships and Activities. This work was supported by the Russian Science Foundation (grant № 16-15-10178).
'Almazov National Medical Research Center, St. Petersburg, Russia; 2ITMO University, St. Petersburg, Russia; 3Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.
Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) является одним из наиболее жизнеугрожающих состояний у сердечно-сосудистых пациентов в мире. При ХСН функциональные и метаболические изменения выявляются не только в сердечной мышце, но и в ткани скелетной мускулатуры: гипоксия, системное воспаление, окидативный стресс, нарушение клеточных механизмов окисления жирных кислот ими-тохондриальная дисфункция являются факторами, способствующими ХСН-индуцированному повреждению мышечной ткани. Патологические изменения скелетной мускулатуры включают развитие мышечной атрофии, развитие инсулинорезистентности, нарушение регуляции липидного обмена и патологическое замещение мышечной ткани на фиброзную и жировую. Все эти факторы приводят к развитию саркопении, снижению качества жизни и ухудшению прогноза у пациентов с ХСН [1]. Разработка эффективных профилактических и терапевтических стратегий борьбы с саркопенией у пациентов с ХСН остается нерешенной проблемой. В настоящее время программы аэробных физических тренировок признаны эффективной и безопасной терапевтической тактикой профилактики развития саркопении у пациентов с ХСН и внесены в практические рекомендации по диагностике и лечению сердечной недостаточности (СН) [2].
Обычно спортивные тренировки стимулируют увеличение массы скелетной мускулатуры за счет активации сателлитных клеток и реализации их потенциала миогенной дифференцировки. Недавно мы показали, что в мышечной ткани пациентов с ХСН хронически активирована программа регенерации мышечной ткани, которая не завершается формированием "взрослой", функциональной мышечной ткани; такое состояние является патологическим и было описано ранее для разных типов мышечных дистрофий [3]. Однако в стандартизированных условиях in vitro резидентные стволовые клетки (СК) скелетной мускулатуры пациентов с ХСН активно диф-
Ivanova O. A. ORCID: 0000-0002-6163-2162, Ignatieva E. V. ORCID: 0000-00021423-6562, Lelyavina T. A. ORCID: 0000-0001-6796-4064, Galenko V. L. ORCID: 0000-0002-0503-167X, Komarova M.Yu. ORCID: 0000-0002-7520-090X, Bortso-va M.A. ORCID: 0000-0002-9694-7850, Sitnikova M.Yu. ORCID: 0000-0002-01395177 Kostareva A. A. ORCID: 0000-0002-9349-6257, Sergushichev A. A. ORCID: 0000-0003-1159-7220, Dmitrieva R. I.* ORCID: 0000-0002-3073-7914.
Corresponding author: renata.i.dmitrieva@gmail.com
Received: 30.09.2020 Revision Received: 1510.2020 Accepted: 1510.2020
For citation: Ivanova O.A., Ignatieva E. V., Lelyavina T.A., Galenko V. L., Komarova M. Yu., Bortsova M. A., Sitnikova M. Yu., Kostareva A.A., Sergushichev A.A., Dmitrieva R. I. Transcriptome analysis of skeletal muscles revealed the effect of exercise on the molecular mechanisms regulating muscle growth and metabolism in patients with heart failure. Russian Journal of Cardiology. 2020;25(10):4132. (In Russ.) doi:10.15829/1560-4071-2020-4132
ференцировались в миотрубки, демонстрируя сохран-нось регенеративного потенциала мышечной ткани при ХСН [3]. Таким образом, мы пришли к заключению, что активация резидентной СК у пациентов с ХСН возможна, и правильно подобранная программа физической реабилитации может способствовать активации регенераторного потенциала СК скелетной мускулатуры, восстановлению мышечной ткани и росту, препятствовать развитию саркопении и увеличивать толерантность к физическим нагрузкам.
Очевидно, что важной задачей при назначении терапевтической тренировочной программы является определение оптимальной/персонализированной интенсивности физических нагрузок для каждого пациента. В качестве параметров толерантности к физической нагрузке рассматривают анаэробный, или лактатный, порог (АП) и пиковое поглощение кислорода (У02); эти же параметры известны как показатели тяжести и прогноза ХСН [4]. АП определяется как интенсивность упражнений до достижения точки перегиба, при которой концентрация лак-тата в крови начинает нарастать быстрее, чем мышцы могут его утилизировать; таким образом, АП дает представление о том, как мышцы используют доступный кислород, являясь более информативным показателем общей работоспособности по сравнению с пиковым У02 [5]. Ранее было показано, что назначение индивидуальной программы аэробных упражнений, основанной на определении АП, приводит к лучшему терапевтическому результату (пик У02, фракция выброса левого желудочка, толерантность к физической нагрузке), чем назначение аэробных тренировок на основе оценки пика У02 [6-8]. Также, наряду с клиническим ответом, гистологический анализ выявил уменьшение толщины как мышечных волокон, так и эндомизия после курса физических упражнений, что указывает на стабилизацию системы механотрансдукции скелетной мускулатуры пациентов в ответ на 12-нед. курс персонализированной программы физической реабилитации пациен-
5№ 40
* ц
я
е
10 №
Персонализированные тренировки №
_ I -'Л£ I
№
гь
АЛ
» А
К
N.
■ щ •
ж л А
А А л V *
Г х
Л л
Терапевтический эффект
40'
Контроль 12 недель
30
о* 30' >
ю
Т
Контроль 12 недель
© о - К
о а
т
Контроль 6 недель
V
Гистологические изменения скелетной мускулатуры пациентов
Контроль 12 недель
Контроль 12 недель
Рис. 1. Обобщенные результаты комплексного ответа пациентов на персонализированную программу физической реабилитации. Адаптировано из [9]. Примечание: индивидуальная программа тренировок определялась как рабочая нагрузка на уровне АП или близком к нему (^Г1). Биопсии мышц у 8 пациентов были взяты до и после 12 нед. тренировки: гистологический анализ использовался для оценки морфологии мышц. Верхняя панель: большинство пациентов продемонстрировали положительный клинический ответ входе выполнения программы физической реабилитации: пик VO2, фракция выброса левого желудочка, скорость ходьбы на уровне АП. Нижняя панель: изменения диаметра мышечного волокна и толщины эндомизия в ответ на программу физической реабилитации.
Сокращение: ФВ ЛЖ — фракция выброса левого желудочка, АП — анаэробный порог.
тов [9]. Результаты предшествующих исследований обобщены на рисунке 1.
Целью этого исследования было оценить влияние персонализированных физических тренировок на молекулярные механизмы регуляции роста и метаболизма мышечной ткани у пациентов с ХСН.
Материал и методы
Исследование одобрено Комитетом по этике Национального медицинского исследовательского центра им. В. А. Алмазова (№ 54/14.03.2016) и проводи-
лось в соответствии с действующими стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Все пациенты, участвующие в программе, до включения в исследование подписали одобренное Советом по институциональному обзору заявление об информированном согласии.
Протокол лечебной физкультуры. Индивидуальная программа физической реабилитации больных ХСН включала 1 ч ходьбы с интенсивностью нагрузки 90% на уровне АП (оценивалась как скорость, км/ч) не менее 4-5 раз в нед.; больные должны были вести
Таблица 1
Исходные характеристики пациентов, которыми были предоставлены образцы биопсии
Доноры HF1 HF2 HF3 HF4 HF5 HF6
Возраст, лет 56 48 63 61 56 62
ИМТ, кг/м2 2707 26,46 24,1 32,87 26,77 23,32
ФВ ЛЖ, % 25 20 11 24 28 40
VO2 пик (мл/кг/мин) 16,2 13,6 173 11 131 22,5
Этиология заболевания (ДКМ/ИБС) ДКМ ДКМ ИБС ИБС ИБС ИБС
Примечание: все пациенты находились на стабильных индивидуально подобранных режимах медикаментозной терапии, включающих ингибиторы ангио-тензинпревращающего фермента или антагонисты рецепторов ангиотензина II, диуретики, бета-блокаторы; не имели сопутствующих заболеваний (хроническая обструктивная болезнь легких, ИБС, фибрилляция предсердий, анемия).
Сокращения: ДКМ — дилатационная кардиомиопатия, ИБС — ишемическая болезнь сердца, ИМТ — индекс массы тела, ФВ ЛЖ — фракция выброса левого желудочка, VO2— поглощение кислорода.
дневник самоконтроля (оценивался ежемесячно); коррекция тренировочной нагрузки проводилась на втором амбулаторном визите; все больные наблюдались кардиологом в амбулаторном отделении. Образцы биопсий 3 пациентов до и после 12-нед. курса индивидуальных тренировок были использованы для анализа транскриптома с помощью РНК-секвениро-вания; всего исследовалось 6 образцов. Клинические и гистологические результаты пациентов СН до и после физической реабилитации описаны на рисунке 1 и в предыдущем исследовании [9].
Выделение и секвенирование РНК. РНК выделяли из мышечных биопсий с использованием ExtractRNA (#BC032, Evrogen); качество устанавливали с помощью Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies), используя BA RNA nano kit; концентрации РНК были определены на Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Библиотеки для секвенирования 3'-концевых последовательностей мРНК были подготовлены с использованием набора Quantseq 3'mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina (FWD) (Lexogen). Секвенирование РНК проводили на Illumina MiSeq в режиме одноконце-вого чтения. Длина прочтений составляла 150 п.н., среднее число ридов — 0,93 млн на образец. Результаты секвенирования 6 образцов, описанных в этой статье, выложены в открытую базу данных GEO под номером GSE134698.
Обработка данных РНК-секвенирования. Необработанные данные были получены в формате FASTQ непосредственно из MiSeq. Качество оценивалось с помощью программы FastQC (v0.11.5) (доступно онлайн по адресу: http://www.bioinformatics.babraham. ac.uk/projects/fastqc). Фильтрация ридов и удаление адаптерных последовательностей выполнены с помощью программы fastp (v0.20.0). Прочтения были выровнены на геном человека GRCh38.p12, используя маппер STAR v2.5 и аннотацию GENCODE v28. Выровненные риды подсчитывались с помощью программы featureCounts. Топ 12 тыс. наиболее экспрес-сируемых генов были выбраны после квантильной
и логарифмической нормализации для анализа дифференциальной экспрессии. Дифференцированно экспрессируемые гены определяли с помощью программного пакета DESeq2 для R. Данные были нормализованы в парах образцов для каждого пациента, разница в экспрессии была рассчитана между двумя состояниями: до и после физической нагрузки. Значения p-value скорректированы с помощью процедуры Бенджамини-Хохберга и отфильтрованы с применением критерия FDR =0,1. Анализ обогащения набора генов (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) проводился для нахождения активированных и деак-тивированных молекулярных путей с использованием пакета fgsea [10], наборы генов были взяты из базы данных Gene Ontology Biological Processess; критерий значимости для путей FDR =0,1.
Результаты
Реакция транскриптома скелетных мышц на физическую нагрузку у пациентов с ХСН. Анализ РНК-секве-нирования является стандартным типом анализа, позволяющим получить механистическое понимание клеточной сигнализации в мышцах [11]. Для определения молекулярных механизмов, лежащих в основе терапевтического исхода, было проведено 3'мРНК-секвенирование на парах биоптатов скелетных мышц, полученных от трех пациентов с ХСН до и после 12 нед. физической нагрузки. Однако секвенирование образцов HF3 и HF6 имело недостаточную глубину покрытия, в то время как HF2 отличался низким количеством назначенных генов (табл. 1).
График принципиальных компонент продемонстрировал обусловленные тренировками изменения транскриптома скелетных мышц во всех трех парах биопсий, хотя разница между пациентами также была значительной (рис. 2А).
Для сравнения образцов до и после тренировок был составлен список дифференциально экспресси-руемых генов, важных для развития и функционирования скелетных мышц (табл. 2). Мы применили
Negative log^Q р-value
£ •
m
о
см
f\l U а.
■» 9 fô »
PCI (40.7%)
Ф до физической реабилитации после физической реабилитации
интерферон гамма - зависимый сигнальный путь интерферон 1 - зависимый сигнальный путь процессы, обусловленные тубулиновым цитоскелетом дифференцировка клеток скелетной мускулатуры импорт иона калия через плазматическую мембрану сборка межклеточных контактов убиквитин-зависимый ERAD сигнальный путь высвобождение ионов кальция из депо в цитозоль мышечное сокращение сборка малых рибосомных субьединиц развитие олигодендроцитов АТФ-зависимый транспорт протонов гомеостаз внутриклеточного калия позитивная регуляция сборки стресс-фибрилл регуляция клеточного цикла инактивация МАРК сигнального пути организация э и догом циркздные ритмы развитие аорты
катаболизм пероксида водорода неддулирование протеинов трансляция митохондрий сборка митохондриального дыхательного комплекса IV
Щ подавление Щ активация
Рис. 2. Изменения сигнальных путей в скелетных мышцах пациентов с ХСН после 12 нед. физической нагрузки. A. График PCA (PCA — principal component analysis, принципиальные компоненты 1 и 2) для образцов пациентов показывает изменения в транскриптоме. Синим цветом обозначены образцы, взятые до прохождения курса реабилитации, красным — после. Б. Биологические процессы, которые были значительно (FDR =0,1) активированы (красный) или подавлены (синий) в тренированных мышцах относительно нетренированных (abs (NES) >1,7) после 12-нед. программы реабилитации пациентов с СН (n=3). Представлены значения p-value <0,001; числа показывают количество генов, участвующих в активации/подавлении данного пути. Цветное изображение доступно в электронной версии журнала.
Negafrve log.,-, p-value
анализ обогащения набора генов (08БЛ) и идентифицировали 26 биологических процессов и путей, которые были значимо активированы или подавлены после курса тренировок (рис. 2Б). Полный список подмножеств генов, участвующих в активации/дезактивации каждого молекулярного пути, приведен в таблице 2. Почти все гены и пути, идентифицированные как значительно апрегулированные, могут быть отнесены к следующим трем группам. Во-первых, это гены, участвующие в росте и регенерации мышц (МЕБ2, МуоБ, ШР90, 1ЕЯ5). В список генов, принадлежащих к пути "дифференцировка клеток скелетной мускулатуры", вошли транскрипционный фактор МУОБ и миоцит-специфический энхансер-ный фактор МЕГ2, который взаимодействует с членами семейства МуоБ в процессе стимуляции регенерации мускулатуры. Кроме того, повышена экспрессия гена ЫЛСЛ, участвующего в регуляции постна-тального роста и регенерации скелетных мышц.
Во-вторых, мы выявили повышенную регуляцию саркомерных генов и генов, вовлеченных в сигналь-
ный путь регуляции кальция. Те и другие участвуют в сокращении и расслаблении мышц (МУИ7, ЛСТЛ1, ТЫЫТ1, ТЫМЗ, ТЫШ1, МУ19, МУОМ2, МУОМ1, ЯУЯ1).
Третья группа значимо апрегулированных генов включала гены, играющие критическую роль в поддержании структурной целостности мышечных волокон, включая компоненты актин-интегринового цитоскелета и актин-модулирующие гены (ЛСТВ, ЛСТ01, GSC, ЫМБ2). Эта группа также содержит подмножество генов, ассоциированных с 2-диском (ЛЖС, РЬЕС, Х1И140, SУNPO2L, ШРВ7). Сигнальные гены, вовлеченные в механодетекцию и механо-трансдукцию, также были апрегулированы (СУР61).
Кроме того, мы обнаружили повышенную экспрессию генов, относящихся к сигнальному пути, регулирующему гидролиз АТФ, связанный с протонным транспортом (табл. 1), а именно, генов, опосредующих ацидификацию внутриклеточных органелл эукариот, необходимых для генерации протонного градиента в синаптических пузырьках (ЛТР6У1В2,
ATP6V1F, ATP6V0A1, ATP6AP1, ATP6V0D1), и генов, ответственных за поддержание электрохимических градиентов ионов Na /К через плазматическую мембрану (ATP1A1, ATP1A2). Мы также наблюдали повышенную экспрессию генов, участвующих в инсулин-зависимом транспорте глюкозы (GLUT4) и функционировании митохондрий (SLC25A4, NDUFS3, LYRM7, ND6).
Обсуждение
Основной вывод настоящего исследования заключается в том, что вызванное тренировкой улучшение здоровья, включая повышение толерантности к физической нагрузке у пациентов с СН, было связано с активацией сигнальных путей, ответственных за потенциал регенерации скелетных мышц: результаты анализа секвенирования транскриптомов до и после курса упражнений определенно указывают на вызванную тренировками стимуляцию мышечной регенерации и функции у пациентов с СН (рис. 2Б).
Это наблюдение важно и ново: большинство опубликованных работ содержат доказательства, подтверждающие мнение о том, что СК скелетных мышц больных с СН плохо поддерживают рост мышц из-за ряда патологических факторов, включая ингибирова-ние активации и пролиферации сателлитных клеток белком Ang II через его рецептор I типа [12], более низкую плотность капиллярной сети в мышцах [13], устойчивую активацию основных путей деградации белков — протеосомного и лизосомально-аутофаги-ческого [14]. В наших последних работах, однако, мы продемонстрировали, что в стандартизированных условиях in vitro СК скелетных мышц и костного мозга, полученные от пациентов с СН, не теряют регенеративного потенциала, что свидетельствует о том, что стабилизация микроокружения in vivo может привести к физиологически значимой активации СК [3, 15]. В настоящей работе мы показываем, что этот потенциал может быть стимулирован у пациентов с СН с помощью персонализированного курса тренировок, что приводит к предотвращению мышечного истощения и повышению толерантности к физической нагрузке.
В норме адаптация, обусловленная тренировкой, у здоровых людей отражается изменениями в сократительных белках и их функциях, митохондриальной функции, метаболической регуляции, внутриклеточной сигнализации и транскрипционных изменениях (обзор в работе [16]). У пациентов с СН снижена максимальная производительная способность, поэтому относительная нагрузка у пациентов с СН выше, чем у здоровых доноров, и этот вопрос следует учитывать при сравнении данных, полученных от здоровых доноров и пациентов с СН. Кроме того, непереносимость физической нагрузки у пациентов с СН может быть результатом снижения окислительного
метаболизма и усиления глюконеогенеза в тренированных мышцах и/или из-за низкого уровня доставки кислорода и физической инертности пациентов с СН, или того и другого, и эти ограничения также следует учитывать. Поэтому, чтобы установить правильную персонализированную интенсивность упражнений, мы определили LT1 для каждого пациента и назначили 60-минутную скорость ходьбы на уровне LT1 или близком к нему. Наблюдаемые изменения транскриптома у пациентов с СН (рис. 2) хорошо согласуются с данными, полученными другими для здоровых доноров: индуцированный физической нагрузкой специфический транскриптомный ответ на сократительную активность был описан для здоровых доноров [17], в работе Dickinson JM, et al. (2018) авторы обнаружили специфичный для аэробных упражнений кластер генов, связанный с убиквитини-рованием [18]. Однако следует иметь в виду, что данные от здоровых доноров были получены для короткого курса физических упражнений, в то время как наши пациенты проходили длительную программу тренировок, что указывает на необходимость дальнейших исследований.
Важно отметить, что в нашей работе мы также обнаружили повышенную регуляцию генов, участвующих в модуляции внутриклеточных сигнальных путей TGFp и WNT, которые важны для регуляции васкуляризации тканей [19]. Кроме того, известно, что дифференциально экспрессируемый ген CYR61, относящийся к группе белков, связывающих инсули-ноподобный фактор роста (IGF) (табл. 2), участвует в регуляции ангиогенного фактора VEGF через механизмы цитоскелетной механотрансдукции [20], а увеличение его экспрессии в скелетных мышцах как на уровне мРНК, так и на уровне белка было обнаружено у здоровых людей после физической нагрузки. Кроме того, было показано, что сывороточный уровень CYR61 коррелирует со смертностью в течение 6 мес. у пациентов с острой СН, и авторы предложили сывороточный CYR61 в качестве перспективного прогностического биомаркера для пациентов с СН [21]. Эти данные вместе с нашими наблюдениями указывают на необходимость проведения дополнительных исследований для уточнения роли CYR61 в патогенезе СН, тканеспецифических функций CYR61, его диагностической и прогностической значимости при СН.
Ключевым наблюдением в нашем исследовании является вызванная тренировкой стимуляция пути, способствующего инактивации митоген-активиро-ванных протеинкиназ (MAPK) (рис. 2Б). MAPK играют критическую роль в ремоделировании мышечной ткани в ответ на повышенную нагрузку или патологические нарушения; при прогрессирующей СН активируется каждая из трёх ветвей сигнального пути MAPK, независимо от природы заболевания [22]. Инактивация MAPK регулируется специа-
Таблица 2
Дифференциально экспрессируемые гены со значениями p-values <0,05 и fold change >1,5
Название генов Ensembl ID P value adjusted log2 FC Описание
CYR61 ENSG00000142871 3.15E-05 1,745 cellular communication network factor 1
RYR1 ENSG00000196218 1,97E-02 0,960 ryanodine receptor 1
PLEC ENSG00000178209 1,60E-02 1,064 plectin
APH1A ENSG00000117362 5,67E-02 1,008 Aph-1 homolog A, gamma-secretase subunit
HSP90AB1 ENSG00000096384 5,67E-02 0,905 Heat shock protein 90 alpha family class B member 1
SYNPO2L ENSG00000166317 5,67E-02 0,867 Synaptopodin 2 like
SLC25A4 ENSG00000151729 5,67E-02 -0,939 Solute carrier family 25 member 4
FLNC ENSG00000128591 8,42E-02 0,873 Filamin C
SLC2A4 ENSG00000181856 8,42E-02 0,809 Solute carrier family 2 member 4
CRLF1 ENSG00000006016 8,42E-02 1,053 Cytokine receptor like factor 1
MPST ENSG00000128309 8,80E-02 1,147 Mercaptopyruvate sulfurtransferase
IER5 ENSG00000162783 8,80E-02 1,038 Immediate early response 5
MT2A ENSG00000125148 8,80E-02 1169 Metallothionein 2A
RERE ENSG00000142599 8,80E-02 0,955 Arginine-glutamic acid dipeptide repeats
HSPB7 ENSG00000173641 8,80E-02 0,812 Heat shock protein family B (small) member 7
CAVIN4 ENSG00000170681 8,80E-02 -0,909 Caveolae associated protein 4
NACA ENSG00000196531 8,80E-02 0,857 Nascent polypeptide associated complex subunit alpha
KLHL40 ENSG00000157119 9,96E-02 1,034 Kelch like family member 40
GSN ENSG00000148180 9,96E-02 0,769 Gelsolin
PSMD3 ENSG00000108344 9,96E-02 0,924 Proteasome 26S subunit, non-ATPase 3
NDUFS3 ENSG00000213619 9,96E-02 0,778 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit S3
RN7SL2 ENSG00000274012 5,27E-02 1,592 RNA component of signal recognition particle 7SL2
BCYRN1 ENSG00000236824 6,56E-02 1109 Brain cytoplasmic RNA 1
LYRM7 ENSG00000186687 9,98E-02 -1173 LYR motif containing 7
TAPBP ENSG00000231925 9,98E-02 1,065 TAP binding protein
SELENOW ENSG00000178980 9,72E-02 -0,756 Selenoprotein W
ND6 ENSG00000198695 5,56E-02 1,340 Mitochondrial^ encoded NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit 6
TUBA1C ENSG00000167553 8,31E-02 1124 Tubulin alpha 1c
Примечания: р-value ajusted =0,1; значения р-value ajusted получены после применения процедуры Бенджамини-Хохберга над p-values для поправки на множественные сравнения; параметр log2 FC (log2 fold change) представляет собой то, во сколько раз по степени двойки измененилась экспрессия данного гена в образцах после физических упражнений.
лизорованными двуспецифичными фосфатазами (DUSP), а DUSP-зависимая регуляция MAPK динамически изменяет тканевые реакции на физиологические и патологические стимулы [22]; роль MAPK в регенерации скелетных мышц, а также кардиопро-текторные эффекты ингибиторов p38 MAPK, были показаны на различных крысиных и клеточных моделях [23, 24]. Cosgrove BD, et al. (2014) и Bernet JD, et al. (2014) показали, что повышение активности p38 MAPK-пути приводит к нарушению способности к самообновлению старых мышечных СК, но фармакологическое ингибирование или нокдаун p38-a/p способствует их омоложению [25, 26]. Принимая во внимание эти результаты, наряду с полученными нами ранее данными, которые подтверждают способность СК пациентов с СН дифференцироваться в поддерживающей среде in vitro [3, 15], мы полагаем, что инактивация MAPK-пути, индуцированная тренировками (рис. 2Б), может способствовать преду-
преждению истощения скелетной мускулатуры у пациентов с ХСН за счет восстановления регенеративного потенциала мышечных СК.
Известным отличительным признаком реакции на тренировку выносливости является митохондриаль-ный биогенез в сочетании с улучшением функциональных параметров митохондрий. Однако в нашем исследовании мы наблюдали снижение активности путей, регулирующих сборку комплекса IV дыхательной цепи митохондрий и трансляцию митохондрий (рис. 2Б). Эти неожиданные наблюдения могут отражать либо дальнейшую посттранскрипционную регуляцию митохондриальных ферментов [27], либо тот факт, что комплексное системное нарушение энергетического метаболизма как миокарда, так и скелетных мышц является значимым аспектом патофизиологии ХСН [1]. Поэтому динамика функциональных параметров митохондрий при физической реабилитации больных СН должна быть рассмотрена в иссле-
довании, специально разработанном для решения этой сложной проблемы.
Заключение
Мы продемонстрировали возможность стимуляции с помощью тренировки молекулярных путей и генов, ответственных за дифференцировку и развитие скелетных мышц у пациентов с СН. Этот молекулярный ответ включает в себя активацию СК скелетных мышц, развитие миофибрилл, организацию и функционирование мышечной ткани. Наши дан-
Литература/References
1. Zizola C, Schulze PC. Metabolic and structural impairment of skeletal muscle in heart failure. Heart Fail. Rev. 2013;18:623-30. doi:10.1007/s10741-012-9353-8.
2. Springer J, Springer J-I, Anker SD. Muscle wasting and sarcopenia in heart failure and beyond: update 2017. ESC Hear. Fail. 2017;4:492-8. doi:10.1002/ehf2.12237
3. Dmitrieva RI, Lelyavina TA, Komarova MY, et al. Skeletal muscle resident progenitor cells coexpress mesenchymal and myogenic markers and are not affected by chronic heart failure-induced dysregulations. Stem Cells Int. 2019;1-11. doi:101l155/2019/5690345.
4. Agostoni P, Dumitrescu D. How to perform and report a cardiopulmonary exercise test in patients with chronic heart failure. Int. J. Cardiol. 2019;288:107-13. doi:10,1016/j. ijcard.2019.04.053.
5. Wagner J, Agostoni P, Arena R, et al. The Role of Gas Exchange Variables in Cardiopulmonary Exercise Testing for Risk Stratification and Management of Heart Failure with Reduced Ejection Fraction. Am Heart J. 2018;202:116-26. doi:10,1016/j. ahj.2018.05.009.
6. Lelyavina T, Sitnikova M, Shlyakhto E. Diagnostic and prognostic value of lactate threshold and pH — threshold determination during cardiopulmonary testing in patients with chronic heart failure. Br J Med. Med. Res. 2015;5:289-96. doi:10.9734/BJMMR/2015/12920.
7. Lelyavina T, Sitnikova M, Galenko V, et al. Aerobic training in heart failure patients with optimal heart failure therapy — a prospective randomized study. World J. Pharm. Res. 2017;6:59-67.
8. Galenko VL, Lelyavina TA, Sitnikova MY. Response predictors for physical training HFrEF patients. Kardiologiia. 2018;58:22-8. (In Russ.) Галенко В. Л., Лелявина Т. А., Ситникова М. Ю. Предикторы ответа на физические тренировки у больных СНнФВ. Кардиология. 2018;58(S4):22-8. doi:10,18087/cardio.2434.
9. Lelyavina TA, Galenko VL, Ivanova AO, et al. Clinical Response to Personalized Exercise Therapy in Heart Failure Patients with Reduced Ejection Fraction Is Accompanied by Skeletal Muscle Histological Alterations. International journal of molecular sciences. 2019;20(21):551. doi:10.3390/ijms20215514.
10. Sergushichev AA. An algorithm for fast preranked gene set enrichment analysis using cumulative statistic calculation. bioRxiv. 2016;60012. doi:101101/060012.
11. Popov DV, Makhnovskii PA, Shagimardanova EI, et al. Contractile activity-specific transcriptome response to acute endurance exercise and training in human skeletal muscle. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2019;316:E605-E614. doi:101152/ ajpendo.00449.2018.
12. Yoshida T, Delafontaine P. An Intronic Enhancer Element Regulates Angiotensin II Type 2 Receptor Expression during Satellite Cell Differentiation, and Its Activity Is Suppressed in Congestive Heart Failure. J Biol Chem. 2016;291:25578-90. doi:10,1074/ jbc.M116.752501.
13. Hendrickse P, Degens H. The role of the microcirculation in muscle function and plasticity. J. Muscle Res. Cell Motil. 2019;40:127-40. doi:101007/s10974-019-09520-2.
ные обеспечивают важную основу для дальнейших исследований, направленных на улучшение понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе терапевтических эффектов персонализированных физических тренировок у пациентов с СН, с целью разработки новых фармакологических подходов к профилактике и лечению истощения скелетных мышц при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Отношения и деятельность. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 16-15-10178.
14. Schiaffino S, Dyar KA, Ciciliot S, et al. Mechanisms regulating skeletal muscle growth and atrophy. FEBS J. 2013;280:4294-314. doi:10.1111/febs.12253.
15. Dmitrieva RI, Revittser AV, Klukina MA, et al. Functional properties of bone marrow derived multipotent mesenchymal stromal cells are altered in heart failure patients, and could be corrected by adjustment of expansion strategies. Aging (Albany. NY). 2015;7:14-25. doi:10,18632/aging,100716.
16. Egan B, Zierath JR. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metab. 2013;17:162-84. doi:10,1016/j.cmet.2012,12.012.
17. Binder RK, Wonisch M, Corra U, et al. Methodological approach to the first and second lactate threshold in incremental cardiopulmonary exercise testing. Eur. J. Prev. Cardiol. 2008;15:726-34. doi:10,1097/HJR.0b013e328304fed4.
18. Dickinson JM, D'Lugos AC, Naymik MA, et al. Transcriptome response of human skeletal muscle to divergent exercise stimuli. J. Appl. Physiol. 2018;124:1529-40. doi:10,1152/ japplphysiol.00014.2018.
19. Muppala S, Xiao R, Krukovets I, et al. Thrombospondin-4 mediates TGF-ß-induced angiogenesis. Oncogene. 2017;36:5189-98. doi:10,1038/onc.2017,140.
20. Lavine KJ, Sierra OL. Skeletal muscle inflammation and atrophy in heart failure. Heart Fail. Rev. 2017;22:179-89. doi:10,1007/s10741-016-9593-0.
21. Zhao J, Zhang C, Liu J, et al. Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry Prognostic Significance of Serum Cysteine-Rich Protein 61 in Patients with Acute Heart Failure. Cell Physiol Biochem. 2018;48:1177-87. doi:101159/000491984.
22. Liu R, Molkentin JD. Regulation of cardiac hypertrophy and remodeling through the dual-specificity MAPK phosphatases (DUSPs). J Mol Cell Cardiol. 2016;101:44-9. doi:10,1016/j. yjmcc.2016.08.018.
23. Li C, Wang T, Zhang C, et al. Quercetin attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Gene. 2016;577:275-80. doi:10,1016/j.gene.2015,12.012.
24. Takeshima H, Kobayashi N, Koguchi W, et al. Cardioprotective effect of a combination of Rho-kinase inhibitor and P38 MAPK inhibitor on cardiovascular remodeling and oxidative stress in Dahl rats. J. Atheroscler. Thromb. 2012;19:326-36. doi:10.5551/ jat11114.
25. Cosgrove BD, Gilbert PM, Porpiglia E, et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat. Med. 2014;20:255-64. doi:101038/nm.3464.
26. Bernet JD, Doles JD, Hall JK, et al. P38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat. Med. 2014;20:265-71. doi:101038/nm.3465.
27. Popov DV, Lysenko EA, Bokov RO, et al. Effect of aerobic training on baseline expression of signaling and respiratory proteins in human skeletal muscle. Physiol. Rep. 2018;6(17):e13868. doi:10/l4814/phy21l3868.
