CC BY
5
Научная статья УДК 619:576.893.1
https://dol.org/10.31016/1998-8435-2024-18-1-58-65
Анализ таксономической принадлежности ASV (Amplicon Sequence Variant) представителей Cryptosporidium scrofarum у свиней в условиях Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ
1 2 ФГБОУ ВО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н. В. Верещагина, Вологда, Россия
1 [email protected], https://orcid.org/0000-0001-7015-8063
2 [email protected], https://orcid.org/0000-0002-6919-8524
цель исследований - выделение, идентификация и анализ типов ASV (Amplicon Sequence Variant) криптоспоридий свиней в условиях Вологодской области РФ.
Материалы и методы. Исследования в Российской Федерации выполнены впервые. Исследования проводили в свиноводческих хозяйствах на территории Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ в период с января по октябрь 2023 г. Фекалии получали от поросят различных возрастов, а также от подсосных свиноматок. Пробы исследовали с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Идентификацию видов рода Cryptosporidium в пробах фекалий проводили с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликонных библиотек фрагментов гена 18S рРНК, полученных в результате проведения nested (вложенной) ПЦР с последующим «деноизингом», объединением последовательностей, восстановления исходных филотипов (ASV, (Amplicon Sequence Variant)).
Результаты и обсуждение. Представители рода Cryptosporidium были выявлены в каждой исследуемой возрастной группе. В результате высокопроизводительного секвенирования библиотек по технологии Illumina для каждого образца было получено от 20 до 100 тыс. нуклеотидных последовательностей (прочтений), после обработки которых суммарно было выявлено 2372 ASV. Анализ таксономической принадлежности ASV, проведённый с помощью филогенетического анализа, дополненного анализом с использованием алгоритма blastn в базе данных GenBank, показал, что суммарно во всех исследованных образцах присутствуют только 10 ASV, имеющих высокое сходство с последовательностями, депонированными в GenBank как фрагменты гена 18S рРНК Cryptosporidium scrofarum. 8 типов ASV являются уникальными и не повторяются от хозяйства к хозяйству. Вероятно, эти последовательности принадлежат местным популяциям подвидов C. scrofarum. Интересным представляется обнаружение уникальной последовательности рода Cryptosporidium типа ASV8, сходство которого с ближайшим родственником рода составляет всего 91,47%, что может свидетельствовать о довольно удалённом таксономическом родстве. Данный тип нуклеотидной последовательности в дальнейшем может быть описан как новый вид. Все выявленные уникальные нуклеотидные последовательности ASV были депонированы в GenBank.
ключевые слова: криптоспоридиоз, Cryptosporidium scrofarum, ооцисты, ПЦР, ДНК, секвенирование, 18S рРНК, ASV, Amplicon Sequence Variant, поросята, Вологодская область, Российская Федерация
Благодарности. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-26-00002, https://rscf.ru/ project/22-26-00002/
Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.
конфликт интересов отсутствует.
Андрей Леонидович кряжев 1, Артём Сергеевич новиков 2
Аннотация
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License. The content is available under Creative Commons Attribution 4.0 License.
Для цитирования: Кряжев А. Л., Новиков А. С. Анализ таксономической принадлежности ASV (Amplicon Sequence Variant) представителей Cryptosporidium scrofarum у свиней в условиях Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ // Российский паразитологический журнал. 2024. Т. 18. № 1. С. 58-66.
https://doi.org/10.31016/1998-8435-2024-18-1-58-66
© Кряжев А. Л., Новиков А. С., 2024
Original article
AsV (Amplicon sequence Variant) taxonomic affiliation analysis of Cryptosporidium scrofarum species in pigs in the Vologda Region, the Northwestern Federal District of the Russian Federationr
Andrey L. Kryazhev 1, Artem s. Novikov 2
1 2 FSBEI HE Vologda State Dairy Farming Academy named after N. V. Vereshchagin, Vologda, Russia
1 [email protected], https://orcid.org/0000-0001-7015-8063
2 [email protected], https://orcid.org/0000-0002-6919-8524
abstract
The purpose of the research is isolation, identification, and analysis of ASV (Amplicon Sequence Variant) types of Cryptosporidia spp. in pigs in the Vologda Region of the Russian Federation.
Materials and methods. The research has been conducted in the Russian Federation for the first time. The research was conducted on pig farms in the Vologda Region of the Northwestern Federal District of the Russian Federation from January to October 2023. Feces were taken from piglets of various age groups, as well as milking sows. The samples were studied using the equipment of the resource center "Genomic Technologies, Proteomics and Cell Biology" of ARRIAM. Species of the genus Cryptosporidia were identified in fecal samples using high-throughput sequencing of 18S rRNA gene fragment amplicon libraries as obtained from nested PCR followed by "denoising", sequence combining, and restoring the original phylotypes (ASV, (Amplicon Sequence Variant)).
Results and discussion. Cryptosporidia spp. species were identified in each age group studied. As a result of high-throughput sequencing of the libraries using the Illumina technology, 20 to 100 thousand nucleotide sequences (reads) were obtained for each sample after processing of which a total of 2,372 ASVs were identified. The analysis of the ASV taxonomic affiliation performed with phylogenetic analysis supplemented by an analysis using the blastn algorithm in the GenBank database showed that, in total, 10 ASVs were only present in all studied samples that had high similarity to sequences deposited in the GenBank as 18S rRNA gene fragments of Cryptosporidium scrofarum. Eight ASV types were unique and did not repeat from farm to farm. Probably, these sequences belong to local populations of C. scrofarum subspecies. Of interest is the discovery of a unique Cryptosporidium sequence of ASV8 type which is only 91.47% similar to the closest relative of the genus, which may indicate a rather distant taxonomic relationship. This type of nucleotide sequence can be further described as a new species. All identified unique ASV nucleotide sequences were deposited in GenBank.
keywords: cryptosporidiosis, Cryptosporidium scrofarum, oocysts, PCR, DNA, sequencing, 18S rRNA, ASV, Amplicon Sequence Variant, piglets, Vologda Region, Russian Federation
acknowledgments. The study was supported by the Russian Science Foundation Grant No. 22-26-00002, https://rscf.ru/ project/22-26-00002/
Financial transparency: none of the authors has financial interest in the submitted materials or methods. there is no conflict of interests.
For citation: Kryazhev A. L., Novikov A. S. ASV (Amplicon Sequence Variant) taxonomic affiliation analysis of Cryptosporidium scrofarum species in pigs in the Vologda Region, the Northwestern Federal District of the Russian Federation. Rossiyskiy parazitologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Parasitology. 2024;18(1):58-66. (In Russ.).
https://doi.org/10.31016/1998-8435-2024-18-1-58-66
© Kryazhev A. L., Novikov A. S., 2024
Введение
Криптоспоридии - распространенные во всем мире протисты, вызывающие заболевание людей и животных [9, 15, 16].
Впервые сообщения о случаях криптоспо-ридиоза у свиней были зарегистрированы в 1977 г. [8], в России же - в 1984 г. [1].
В настоящее время при помощи новейших молекулярно-генетических методов идентифицировано 44 вида и 120 генотипов представителей рода Cryptosporidium [14]. У свиней было выделено тринадцать различных видов/генотипов Cryptosporidium, а именно Cryptosporidium scrofarum (ранее Cryptosporidium, генотип свиньи II), C. suis (ранее Cryptosporidium, генотип свиньи I), C. muris, C. parvum, C. tyzzeri (ранее генотип I мыши Cryptosporidium), C. hominis, C. meleagridis, C. felis, C. andersoni, C. struthioni, генотип Cryptosporidium крысы, Cryptosporidium sp. Генотип Eire w65.5 и неизвестный генотип Cryptosporidium из навозной жижи свиней [6, 10, 17, 18].
Более 90% случаев криптоспоридиоза у свиней вызывается видами C. suis и C. scrofarum [7]; также сообщается о потенциальной опасности заражения ими человека [10, 11].
В условиях Северо-Западного федерального округа РФ ранее нами были впервые обнаружены криптоспоридии у поросят [3, 4], а в дальнейшем при помощи молекулярно-гене-тических методик впервые в РФ установлен вид C. scrofarum [5].
Целью исследования было выделение, идентификация и анализ типов ASV крипто-споридий свиней в условиях Вологодской области СЗФО РФ.
Материалы и методы
Данные исследования в Российской Федерации проведены впервые.
Исследования проводили в условиях промышленных свинокомплексов и частных фер-
мерских хозяйств по выращиванию свиней, расположенных на территории Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ, в период с января по октябрь 2023 г. Фекалии поросят различных возрастов исследовали путем микроскопии фекальных мазков, окрашенных по Циль-Нильсену. После чего замороженные пробы фекалий транспортировали в г. Пушкин и г. Санкт-Петербург для дальнейших исследований. Работу проводили с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ».
Идентификацию видов рода
Cryptosporidium в пробах фекалий животных проводили по ранее разработанной нами методике [2] с помощью двух раундов высокопроизводительного секвенирования ам-пликонных библиотек фрагментов гена 18S рРНК, полученных в результате проведения nested (вложенной) ПЦР с использованием специализированных методов [13, 19] с последующим демультиплексированием образцов, «деноизинга», объединения последовательностей (перекрытие минимум в 12 нуклеотидов), восстановления исходных филотипов (ASV, (Amplicon sequence variant)) и удаления химерных прочтений [5]. Таксономическую принадлежность последовательностей определя-лаи с помощью blastn в базе данных GenBank.
В результате первичных исследований, сортировки и отбора исследованию подвергли 53 пробы фекалий.
Результаты исследований
Из 53 проб фекалий свиней, выращиваемых в удалённых друг от друга хозяйствах, была выделена тотальная ДНК, которая была использована для приготовления библиотек фрагментов гена 18S рРНК методом nested (вложенной) ПЦР со специфическими праймерами.
В результате высокопроизводительного секвенирования библиотек по технологии
2024;18(1):58-66
Russian Journal of Parasitology / Российский паразитологический журнал
Illumina для каждого образца было получено от 20 до 100 тыс. нуклеотидных последовательностей (прочтений), после обработки которых суммарно выявлено 2372 ASV.
Анализ таксономической принадлежности ASV, проведённый с помощью филогенетического анализа, дополненного анализом с использованием алгоритма blastn в базе данных GenBank, показал, что суммарно во всех исследованных образцах присутствуют только 10 ASV, имеющих высокое сходство с последовательностями, депонированными в GenBank как фрагменты гена 18S рРНК C. scrofarum. Эти 10 ASV, однако, составляют 40,6% от всех (944917) прочтений, полученных в результате анализа 53 проб.
В таблице 1 приведены идентификаторы всех обнаруженных ASV, а также процент их сходства с последовательностями гена 18SрРНК, ранее депонированными в GenBank. Только ASV1 и ASV2 полностью идентичны последовательностям, присутствующим в GenBank, остальные различаются в разной степени, что, учитывая высокую консервативность гена 18S рРНК, говорит о таксономических различиях между представителями рода Cryiptosporidium, выявленных в пробах фекалий. Особенно это касается ASV8, сходство которого с ближайшим родственником рода Cryptosporidium составляет всего 91,47%, и может свидетельствовать о довольно удалённом таксономическом родстве, вплоть до нового вида.
Таблица 1 [Table 1]
нуклеотидные последовательности Asv и их процентное сходство с референсными последовательностями
вGenBank
[Asv nucleotide sequences and their percentage similarity to reference sequences in genbank]
№ Названия последовательностей в сводной таблице ASV [Sequence names in ASV summary table] Предполагаемый вид и присвоенный номер ASV [Intended species and assigned ASV number] Процентное сходство с референсными последовательностями [Percentage similarity to reference sequences]
1 Seq1 C. scrofarum ASV1 100
2 Seq4 C. scrofarum ASV2 100
3 Seq92 C. scrofarum ASV3 99,74
4 Seq224 C. scrofarum ASV4 99,48
5 Seq467 C. scrofarum ASV5 99,48
6 Seq812 C. scrofarum ASV6 99,74
7 Seq888 C. scrofarum ASV7 99,74
8 Seq1230 C. scrofarum ASV8 91,47
9 Seq2159 C. scrofarum ASV9 98,17
10 Seq2269 C. scrofarum ASV10 98,17
Все идентифицированные ASV, а также несколько последовательностей гена 18S рРНК C. scrofarum, взятые из GenBank (Sequence ID: MT071828, ON14980, KF597533. MN243610, MN243595), были выравнены в программе MEGA с использованием алгоритма Muscle. Выявленные в результате выравнивания ну-клеотидные замены для каждого ASV при-
ведены таблице 2 и на рисунке 1. Хорошо заметно, что А8У8 имеет большое число нуклеотидных замен в последовательности ам-плифицированного участка гена 188 рРНК по сравнению с другими А8У, а также референсными последовательностями.
Обнаруженные нами нуклеотидные последовательности являются уникальными. Каж-
NJ
Таблица 2 [Table 2]
Выявленные нуклеотидные замены в последовательностях фрагмента гена 18S рРНК С. scrofarum (нумерация позиций дана по выравниванию) [Identified nucleotide substitutions in the sequences of the 18S rRNA gene fragment of C. scrofarum (position numbering is given according to the alignment)]
ASV
Номера позиции в нуклеотидиой последовательности гена 18S рРНК C.scorofarum, имеющих однонуклеотидный полиморфизм
и seq. ID - T Tf Г ON г ® г* 00 г* п Tf п 00 П 00 r»i -т ir, I in п чо чо о г 00 чо с\ •с г-1 m г •с | № 00 00 г 00 00 00 00 о Ov с\ о п 'f. Г1 M п п M 00 п г-1 m 'Г, Г-1 г* ч© M г ЧО П с\ ЧС П © Г) п о Г) о № п Г-1 Г-1 № 00 rj f^ -t 00 т гъ 00 in гъ ■с Г) m чо Г) 00 чо ■с [
ASV1 С G A С G С А G А - С С T - т т А т т т С А С т А А т А А А А T А T т т А А т т с т G G С С T А с А А
ASV2 т - -
ASV3 A - -
ASV4 - - T G
ASV5 - - А
ASV6 - - G
ASV7 - - С
ASV8 т С А т А т А С т С А G G С А т G т С G С С т G G G С G С А С G T G
ASV9 - - А А А T С Т Т
ASV10 т - - А А А T С Т т
MT071828 - -
ON14980 - -
KF597533 - - - -
MN243610 - -
MN243595 - -
о —h
XI
о_ о ю
ш
тз
тз
I
ш
Е з
о а
1 & £ »
а дао
р
>
1Л <
в о
а
и
(Л
3
С
ф
ф
я л о з и
X
ы н н
е еж
ур
а н б о о в
е р
е д
е о к с е ч и т е н е г о л и
©
и Р
ф
с
ф
.о
дая из них была депонирована в GenBank c присвоением идентификаторов (Sequence ID: OR649139, 0R654022, 0R654023, OR661243, 0R661244, 0R654051, 0R654052, 0R654083, 0R654084, 0R654106).
Обсуждение
В результате проведенных исследований в условиях СЗФО РФ на примере Вологодской области, установлено, что поросята всех возрастных групп инвазированы С. scrofarum. Типы ASV1 и ASV2, выявляемые в различных географических регионах мира от Португалии и Великобритании до Китая, Индии и Австралии, идентифицированы во всех обследуемых хозяйствах, хотя и в существенно различных количествах. Остальные ASV присутствуют в значительно меньшем количестве и не повторяются от хозяйства к хозяйству. Вероятно, эти последовательности принадлежат местным популяциям подвидов C. scrofarum.
Интересным представляется обнаружение уникальной последовательности рода Cryptosporidium типа ASV8, который в последствии может быть описан как новый вид.
Заключение
Впервые в Российской Федерации в условиях СЗФО на примере Вологодской области с использованием новейших молекулярно-генетических методик установлено парази-тирование у свиней С. scrofarum у поросят всех возрастных групп. Определены местные типы ASV, а также появились предпосылки для последующего описания нового вида рода Cryptosporidium.
Список источников
1. Горбов Ю. К., Мачинский А. П. Распространение ассоциативных заболеваний сельскохозяйственных животных и опыт борьбы с ними в Мордовской АССР // Паразитоценозы и ассоциативные болезни. М., 1984. С. 235-252.
2. Кряжев А. Л., Новиков А. С. Идентификация таксономической принадлежности крипто споридий у поросят в условиях северо-запада РФ при помощи молекулярно-генетических методов // Российский паразитологический журнал. 2023. Т. 17. № 1. С. 84-90. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2023-17-1-84-90
3. Кряжев А. Л., Новиков А. С., Никитин В. Ф. Эпи-зоотологическая ситуация по криптоспоридиозу
поросят в промышленном свиноводстве Вологодской области // Ветеринария. 2020. № 1. С. 30-34. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2020.23.L30-34
4. Новиков А. С., Кряжев А. Л. Криптоспоридиоз поросят в условиях северо-западного Нечерноземья РФ. Монография. Вологда-Молочное: Вологодская ГМХА, 2022. 112 с.
5. Callahan B. J., McMurdie P. J., Rosen M. J., Han A. W., Johnson A. J. A., & Dada S. H. High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. 2016; 13: 581583. https://doi.org/10.1038/nmeth.3869
6. Chen Y., Qin H., Wu Y., Xu H., Huang J., Li J., & Zhang L. Global prevalence of Cryptosporidium spp. in pigs: a systematic review and meta-analysis. Parasitology. 2023; С. 1-38. https://doi.org/10.1017/ S0031182023000276
7. Feng Y., Ryan U. M., Xiao L. Genetic diversity and population structure of Cryptosporidium. Trends in parasitology. 2018; 34 (11): 997-1011. https://doi. org/10.1016/j.pt.2018.07.009
8. Kennedy G. A., Kreitner G. L., Strafuss A. C. Cryptosporidiosis in three pigs. Journal of the American Veterinary Medical Association. 1977; 170 (3): 348-350.
9. Kotloff K. L, Nataro J. P., Blackwelder W. C. et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): a prospective, case-control study. The Lancet. 2013; 382 (9888): 209-222. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(13)60844-2
10. Nemejc K., Sak B., Kvetonova D., Kernerova N., Rost M., Cama V. A., & Kvac M. 0ccurrence of Cryptosporidium suis and Cryptosporidium scrofarum on commercial swine farms in the Czech Republic and its associations with age and husbandry practices. Parasitology research. 2013; 112 (3): 1143-1154. https://doi.org/10.1007/s00436-012-3244-8
11. Pettersson E., Ahola H., Frossling J., Wallgren P., & Troell K. Detection and molecular characterisation of Cryptosporidium spp. in Swedish pigs. Acta Veterinaria Scandinavica. 2020; 62 (1): 1-7. https:// doi.org/10.1186/s13028-020-00537-z
12. Qi M., Zhang Q., Xu C., Zhang Y., Xing J., Tao D., Li J., Zhang L. Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in pigs in Xinjiang, China. Acta Tropica. 2020; 209. 105551. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2020.105551
13. Rahimah A. B., Cheah S. C., Rajinder S. Freeze-drying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA. J. 0il Palm Res. 2006; 18. 296-304.
14. Ryan U. M., Feng Y., Fayer R., & Xiao L. Taxonomy and molecular epidemiology of Cryptosporidium and Giardia - a 50-year perspective (1971-2021).
2024;18(1):58-66
Russian Journal of Parasitology / Российский паразитологический журнал
International Journal for Parasitology. 2021; 51 (13-14): 1099-1119. https://doi.org/10.1016/jijpara.2021.08.007
15. Striepen B. Parasitic infections: time to tackle cryptosporidiosis. Nature News. 2013; 503 (7475): 189-191. https://doi.org/10.1038/503189a
16. Wang R., Qiu S., Jian F., Zhang S., Shen Y., Zhang L., Ning C., Cao J., Qi M., Xiao L. Prevalence and molecular identification of Cryptosporidium spp. Parasitol. Res. 2010; 107. 1489-1494. https://doi. org/10.1007/s00436-010-2024-6
17. Wang W., Gong Q. L, Zeng A., Li M. H, Zhao Q, & Ni H. B. Prevalence of Cryptosporidium in pigs in China: A systematic review and meta-analysis.
Transboundary and Emerging Diseases. 2021; 68 (3): 1400-1413. https://doi.org/10.1111/tbed.13806
18. Wang P. Li, S., Zou Y., Du Z. C., Song D. P., Wang P., & Chen X. Q. The infection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in diarrheic pigs in southern China. Microbial Pathogenesis. 2022; 165. 105459 https://doi.org/10.1016/j. micpath.2022.105459
19. Zheng S., Li D., Zhou C., Zhang S., Wu Y., Chang Y., Chen Y., Huang J., Ning C., Zhang G., Zhang L. Molecular identification and epidemiological comparison of Cryptosporidium spp. among different pig breeds in Tibet and Henan, China. BMC veterinary research. 2019; 15 (1): 1-8. https://doi.org/10.1186/ s12917-019-1847-3
Статья поступила в редакцию 13.10.2023; принята к публикации 12.02.2024
Об авторах:
кряжев Андрей Леонидович, ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА (160555, г. Вологда, п. Молочное, ул. Шмидта, 2), г. Вологда, Россия, доктор ветеринарных наук, ОКСЮ Ю: 0000-0001-7015-8063, [email protected]
новиков артём Сергеевич, ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА (160555, г. Вологда, п. Молочное, ул. Шмидта, 2), г. Вологда, Россия, кандидат ветеринарных наук, ОКСЮ Ю: 0000-0002-6919-8524, [email protected]
Вклад соавторов:
кряжев андрей Леонидович - обзор литературных источников по проблеме, отбор проб, их подготовка и исследование, критический анализ материала и формирование выводов.
новиков артём Сергеевич - отбор проб, их подготовка и исследование, обзор литературных источников по проблеме, корректировка статьи.
Авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
References
1. Gorbov Yu. K., Machinsky A.P. Spreading of associative diseases in livestock animals and control experience in the Mordovian Autonomous Soviet Socialist Republic. Parasite cenosis and associative diseases. M., 1984; 235-252. (In Russ.)
2. Kryazhev A. L., Novikov A. S. Identification of the taxonomic affiliation of Cryptosporidium spp. in piglets in the conditions of the north-west of the Russian Federation using molecular genetic methods. Rossiyskiy parazitologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Parasitology. 2023; 17 (1): 84-90. (In Russ.) https://doi.org/10.31016/1998-8435-2023-17-1-84-90
3. Kryazhev A. L., Novikov A. S., Nikitin V. F. Epizootological situation on cryptosporidiosis in piglets in industrial pig farming in the Vologda Region. Veterinariya = Veterinary Medicine. 2020; 1: 30-34. (In Russ.) https://doi.org/10.30896/0042-4846.2020.23.1.30-34
4. Novikov A. S., Kryazhev A. L. Cryptosporidiosis of piglets in the northwestern Non-Black Earth Region of the Russian Federation. Monograph. Vologda-
Molochnoye: Vologda State Dairy Farming Academy, 2022; 112. (In Russ.)
5. Callahan B. J., McMurdie P. J., Rosen M. J., Han A. W., Johnson A. J. A., & Dada S. H. High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. 2016; 13: 581583. https://doi.org/10.1038/nmeth.3869
6. Chen Y., Qin H., Wu Y., Xu H., Huang J., Li J., & Zhang L. Global prevalence of Cryptosporidium spp. in pigs: a systematic review and meta-analysis. Parasitology. 2023; C. 1-38. https://doi.org/10.1017/ S0031182023000276
7. Feng Y., Ryan U. M., Xiao L. Genetic diversity and population structure of Cryptosporidium. Trends in parasitology. 2018; 34 (11): 997-1011. https://doi. org/10.1016/j.pt.2018.07.009
8. Kennedy G. A., Kreitner G. L., Strafuss A. C. Cryptosporidiosis in three pigs. Journal of the American Veterinary Medical Association. 1977; 170 (3): 348-350.
9. Kotloff K. L., Nataro J. P., Blackwelder W. C. et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric
