CC BY
32
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 4 - P. 85-88
УДК: 616.316 DOI: 10.12737/article_5a38f4f5ad0b57.20641069
АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОТОРАСТВОРИМЫХ НУКЛЕОТИДОВ В СЕКРЕТАХ БОЛЬШИХ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ
О.В. МЯЧИНА, А.А. ЗУЙКОВА, А.Н. ПАШКОВ
ГБОУВПО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко», ул. Студенческая, 10, г. Воронеж, 394036, Россия
Аннотация. В статье изложены результаты исследования кислоторастворимых нуклеотидов в секретах левой, правой околоушных, подчелюстных и подъязычных слюнных желез у практически здоровых лиц и больных сахарным диабетом 2 типа.
Для забора биологического материала применяли слюносборники (Sarstedt D - 51588 Numbrecht). Нуклеотидный состав секретов больших слюнных желез анализировали при помощи колоночной хроматографии, используя автоматизированную систему FPLS® System (Швеция).
В ходе проведенного исследования выявили, что свободные нуклеотиды в секретах больших слюнных желез элюируются в виде 6 отличных друг от друга фракций: аденозина, аденозинмоно-фосфата, аденозиндифосфата, гуанозиндифосфата, аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата. Наибольшую площадь в секретах желез имеет пик, образованный экскрецией аденозиндифосфата, как у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, так и в контрольной группе; минимальную - пики, образованные экскрецией гуанозиндифосфата и гуанозинтрифосфата. Также обнаружено статистически значимое увеличение содержания аденозина, аденозиндифосфата, снижение аденозинтрифосфата и гуанозинтрифосфата в секретах околоушных слюнных желез у пациентов с сахарным диабетом 2 типа по сравнению с их практически здоровыми сверстниками, что свидетельствует о нарушении регу-ляторных процессов метаболизма в клетках слюнных желез при сахарным диабетом 2 типа и может быть использовано как дополнительный признак для оценки функционального состояния у данной категории больных.
Ключевые слова: секреты больших слюнных желез, сахарный диабет 2 типа, кислотораствори-мые нуклеотиды
ANALYSIS OF ACID-SOLUBLE NUCLEOTIDE CONTENT IN MAJOR SALIVARY GLANDS SECRETION O.V. MYACHINA, A.A. ZUIKOVA, A.N. PASHKOV, N.M. PICHUZHKINA Burdenko Voronezh State Medical University, Street Studencheskaya, 10, Voronezh, 394036, Russia
Abstract. Acid-soluble nucleotides in secretion of left and right parotid (LP, RP), submandibular and sublingual (SMSLSG) salivary glands in practically healthy people and patients with type 2 diabetes have been investigated.
For biological sampling, the saliva traps (Sarstedt D - Numbrecht) were used. Nucleotide composition of major salivary glands secretion was analyzed by chromatography method (FPLS-system).
During the study, the authors found that free nucleotides in the secrets of large salivary glands elute as 6 distinct fractions: adenosine, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, guanosine diphosphate, adenosine triphosphate, guanosine triphosphate.
Maximal peak in major salivary glands secretion is formed by ADP excretion (in both groups of patients), minimal peaks are formed by excretion of GDP and GTP.
Statistically valid increase of adenosine and adenosine diphosphate content, decrease of ATP and GTP-content in secretion of parotid glands in patients with type 2 diabetes has been observed. These results indicate disorders in regulatory metabolic processes of major salivary gland cells in patients with type 2 diabetes and can be used for their functional state estimation (as additional characteristic).
Key words: major salivary glands secretion, type 2 diabetes, acid-soluble nucleotides.
Открытия, совершаемые в молекулярной биологии, генетике и биологической химии, обуславливают интерес исследователей к свободным нуклеотидам, обнаруживающимся во всех биологических жидкостях, в том числе и в секретах больших слюнных желез (БСЖ). Известно, что нуклеотиды являются предшественниками синтеза нуклеиновых кислот как структурные единицы этих полимеров, участвуют в реакциях обмена веществ и энергетического обмена, являются коферментами, посредниками гормонального и медиаторного сигнала во многих биохимических реакциях.
Особенности распределения свободных нуклеотидов в секретах больших слюнных желез в доступной нам литературе не встречались. Между тем исследование секретов БСЖ актуально так как, с одной стороны, в них накапливаются и выводятся попавшие в организм токсические вещества а, с другой стороны, происходят изменения биологических констант, выраженность которых отражает функциональное состояние человека [1,2]. Важным при выборе используемого биологического материала также явилась его доступность и простота получения проб.
Цель исследования - изучение содержания свободных нуклеотидов в секретах больших слюнных желез у практически здоровых лиц и у страдающих сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа).
Материалы и методы исследования. Исследование нуклеотидного состава секретов больших слюнных желез - левой (ЛОУЖ) и правой (ПОУЖ) околоушных, подчелюстных и подъязычных (ПЧПЯЖ) слюнных желез - проведено у 19 практически здоровых людей (Контроль) и 19 пациентов с СД 2 типа сопоставимых по возрасту.
Забор биологического материала осуществляли в утренние часы до приема лекарственных препаратов при помощи слюносборника (Sarstedt D - 51588 Nümbrecht) [3].
Исследование нуклеотидного состава слюны проводили с использованием автоматизированной системы FPLS® System (Швеция) на колонке размером 10*200 мм с О Sepharose Fast Flow для лабораторного хроматографического разделения белков и других биомолекул. На колонку наносили 100 мкл кислотораствори-мой фракции секретов БСЖ, полученной добавлением к пробе охлажденной хлорной кислоты с последующим центрифугированием
при 3000 оборотов в минуту течение 5 минут, а затем подщелачиваем полученной надосадоч-ной жидкости раствором гидроксида калия для нейтрализации pH.
В качестве буфера последовательно использовали ступенчатый градиент, состоящий из двух компонентов: А - 0,05 НHCl; Б - 0,1 Н HCl + 0,5 М NaCl.
Для анализа нуклеотидного состава слюны проводилось хроматографическое разделение известных нуклеотидов, которые сопоставлялись с нуклеотидными фракциями слюны. Количество элюированных нуклеотидов определяли путем измерения площади пиков (%).
Анализ данных проводился с использованием пакета статистической обработки Statistica 6.1. Для описания экспериментально полученных данных были использованы среднее значение и стандартное отклонение. Для выявления значимых различий между независимыми группами использовали двухвыбороч-ный t-тест Стьюдента. При проверке статистических гипотез принимался 5% уровень значимости.
Результаты и их обсуждение. Свободные нуклеотиды в секретах ЛОУЖ, ПОУЖ и ПЧПЯЖ у практически здоровых людей элюируются в виде 6 отличных друг от друга фракций: адено-зина (А), аденозинмонофосфата (АМФ), адено-зиндифосфата (АДФ), гуанозиндифосфата (ГДФ), аденозинтрифосфата (АТФ), гуанозин-трифосфата (ГТФ). Для пациентов, страдающих сахарным диабетом, с уровнем гликиро-ванного гемоглобина HbAicM1,14±0,83% характерно появление дополнительной фракции, соответствующей цитидинмонофосфату (ЦМФ). Определяя кислоторастворимые нуклеотиды в секретах БСЖ, необходимо отметить, что часть их синтезируется в слюнных железах, а другая часть попадает в слюну из крови. Поэтому их содержание может быть обусловлено, с одной стороны, патогенетическими механизмами сахарного диабета и объясняется воздействием токсических продуктов обмена на клетки слюнных желез, нарушением целостности клеточных стенок и выходом внутриклеточных ферментов, участвующих в процессах синтеза и распада свободных нуклеотидов.
Приняв, что количество выделяющихся нуклеотидов в каждой из БСЖ составляет 100%, рассчитали площади элюируемых фракций (%). Их показатели внутри групп варьируют, что связано с асинхронным характером секреции
слюнных желез [3].
Наибольшую площадь в секретах ЛОУЖ, ПОУЖ и ПЧПЯЖ имеет пик, образованный экскрецией АДФ в каждой из исследуемых желез, как у пациентов с СД 2 типа, так и в контрольной группе; минимальную - пики, образованные экскрецией ГДФ и ГТФ (табл. 1).
Таблица 1
Анализ площадей выделяемых нуклеотидов (%)
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с Контролем (Гтабл=2,03), р<0,05
У больных СД 2 типа по сравнению со здоровыми лицами наблюдается увеличение площади экскретируемых аденозина и АДФ в секретах ЛОУЖ и ПОУЖ и АМФ в секретах ПЧПЯЖ; снижение площади экскреции АТФ и ГТФ в секретах ЛОУЖ и ПОУЖ. Выявленное увеличение в экскреции аденозина у больных сахарным диабетом может быть связано с его влиянием на активность макрофагов и последующее выделение цитокинов, что поддерживает хроническое воспаление в организме и является одним из путей, снижающих чувствительность тканей к инсулину [4].
Обнаруженные нами изменения в отношении адениновой системы нуклеотидов: снижение уровня АТФ и накопление АДФ и АМФ объясняются обменными нарушениями у больных СД, что приводит к гипоксии тканей и на-
рушению процессов окислительного фосфори-лирования и возникновению дефицита АТФ.
Выраженное снижение ГТФ (источник энергии для активации химических соединений, участвующих в метаболических реакциях) у обследованных пациентов также свидетельствуют о недостатке энергетических ресурсов для обеспечения процессов жизнедеятельности.
Важным диагностическим признаком у больных с уровнем гликемии выше 11% является экскреция ЦМФ, чего не наблюдается как у пациентов с меньшим содержанием НЬА1с, так и у практически здоровых лиц. Это может быть обусловлено несколькими факторами. Во-первых, результатом гипергликемии при декомпенсации углеводного обмена является развитие микро- и макрососудистых осложнений, нарушающих, в том числе, проницаемость гематосаливарного барьера и приводящих проникновению в секрет слюнных желез дополнительных веществ, например, ЦМФ.
Во-вторых, существует мнение, что характер компенсации сахарного диабета влияет и на частоту диабетической нейропатии. Поскольку ЦМФ стимулирует регенерацию нервных и мышечных волокон, то его выделение, в частности со слюной, может быть обусловлено развитием нервно-мышечных нарушений.
Поскольку концентрация выделенных соединений в каждой из желез, в том числе и свободных нуклеотидов, находится в обратной зависимости от объема секреции, то у больных СД 2 типа в связи со снижением уровня саливации должно наблюдаться концентрирование экскретируемых веществ. Однако даже в этих условиях у них напротив наблюдается снижение величины соотношения высоко- и низкоэнергетических компонентов адениновой и гуаниновой систем, отражающих регуляторные процессы метаболизма клетки (табл. 2).
Таблица 2
Соотношение компонентов адениновой и гуаниновой систем
Железа АТФ/АДФ ГТФ/ГДФ
Контроль СД 2 типа Контроль СД 2 типа
ЛОУЖ 0,31 0,11 1,69 0,79
ПОУЖ 0,31 0,13 2,56 1,06
ПЧПЯЖ 0,26 0,12 1,38 1,07
Таким образом, изменение характера пиков по площади и соответственно по высоте и
Слои Железа Контроль, n - 19 Среднее значение (M±m) СД 2 типа, n - 19 Среднее значение (M±m) | Трасч. |
Аденозин ЛОУЖ 17,33±1,43 22,39±1,74 2,25*
ПОУЖ 16,16±0,96 19,40±1,09 2,23*
ПЧПЯЖ 19,68±1,34 16,55±1,54 1,53
АМФ ЛОУЖ 19,43±1,51 20,74±2,07 0,49
ПОУЖ 20,62±1,35 21,83±1,79 0,55
ПЧПЯЖ 15,90±1,62 24,94±2,05 3,50*
АДФ ЛОУЖ 42,29±2,06 53,04±3,51 2,64*
ПОУЖ 40,36±2,43 47,92±2,11 2,35*
ПЧПЯЖ 45,29±3,15 47,15±3,46 0,40
ГДФ ЛОУЖ 3,24±0,84 3,04±0,85 0,17
ПОУЖ 2,87±0,94 2,31±0,64 0,49
ПЧПЯЖ 3,04±0,77 2,11±0,61 0,95
АТФ ЛОУЖ 13,23±1,87 5,71±0,75 3,65*
ПОУЖ 12,63±1,83 6,42±2,35 2,09*
ПЧПЯЖ 11,92±3,00 5,65±1,23 1,97
ГТФ ЛОУЖ 5,49±1,10 2,41±0,41 2,62*
ПОУЖ 7,35±1,18 2,44±0,58 3,74*
ПЧПЯЖ 4,18±0,88 2,25±0,51 1,93
ЦМФ ЛОУЖ - 8,85±1,51
ПОУЖ - 7,43±0,95
ПЧПЯЖ - 9,95±1,87
протяженности, появление дополнительной фракции ЦМФ у пациентов с СД 2 типа по сравнению с практически здоровыми людьми говорит о зависимости количественного и качественного состава слюны от состояния физиологических и патофизиологических реакций в организме.
Заключение:
1. Наибольшую площадь в секретах ЛОУЖ, ПОУЖ и ПЧПЯЖ имеет пик, образованный экскрецией АДФ в каждой из исследуемых желез, как у пациентов с СД 2 типа, так и в контрольной группе; минимальную - пики, образованные экскрецией ГДФ и ГТФ.
2. Исследование кислоторастворимых нуклеотидов в секретах БСЖ выявило досто-
Литература
1. Григорьев И.В., Уланова Е.А., Артамонов И.Д. Белковый состав смешанной слюны человека: механизмы психо-физиологической регуляции // Вестник РАМН. 2004. №7. С. 36-47.
2. Гуринович Г.П. Использование порфиринов для оценки влияния малых доз ионизирующего излучения на организм человека // Терапевтический архив. 1991. № 7. С. 47-49.
3. Мячина О.В. Хронобиологический анализ содержания оксида азота в секрете слюнных желез человека // Вестник ВГУ; серия химия, биология, фармация. 2006. № 1. С. 141-146.
4. Figler R.A. Links between insulin resistance, adenosine A2B receptors, and inflammatory markers in mice and humans // Diabetes. 2011. Vol. 60, N 2. P. 669.
верные отклонения в содержании аденозина, аденозинмоно-, ди-, трифосфатов и гуанозин-трифосфатов у пациентов с СД 2 типа по сравнению с практически здоровыми лицами, что можно использовать как дополнительный признак для оценки их функционального состояния.
В ходе исследования соотношений компонентов адениновой АТФ/АДФ и гуаниновой систем ГТФ/ГДФ обнаружено снижение этих показателей в 1,3-2,8 раза у больных сахарным диабетом по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о нарушении регуля-торных процессов метаболизма в клетках слюнных желез при СД 2 типа.
References
Grigor'ev IV, Ulanova EA, Artamonov ID. Belkovyy sostav smeshannoy slyuny cheloveka: mekhanizmy psikho-fiziologicheskoy regulyatsii [Protein composition of mixed human saliva: mechanisms of psychophysiological regulation]. Vestnik RAMN. 2004;7:36-47. Russian.
Gurinovich GP. Ispol'zovanie porfirinov dlya otsenki vliyaniya malykh doz ioniziruyushchego izlucheniya na organizm cheloveka [The use of porphyrins for the assessment of the effect of low doses of ionizing radiation on the human body]. Terapevticheskiy arkhiv. 1991;7:47-9. Russian.
Myachina OV. Khronobiologicheskiy analiz soderzha-niya oksida azota v sekrete slyunnykh zhelez chelo-veka [Chronobiological analysis of the content of nitric oxide in the secretion of human salivary glands]. Vestnik VGU; seriya khimiya, biologiya, farmatsiya. 2006;1:141-6. Russian.
Figler RA. Links between insulin resistance, adeno-sine A2B receptors, and inflammatory markers in mice and humans. Diabetes. 2011;60(2):669.
