Анализ результатов диагностики аллергии на металлы различными методами in vitro и in vivo Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© КАРПУК Н.А., КАРПУК И.Ю., 2012

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ НА МЕТАЛЛЫ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ IN VITRO И IN VIVO

КАРПУК Н.А.*, КАРПУК И.Ю.**

У О «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра клинической иммунологии и аллергологии с курсом ФПК и ПК, * кафедра общей стоматологии с курсом ортопедической стоматологии**

Резюме. Целью работы был анализ результатов диагностики аллергии на металлы, проведенной с использованием аппликационных проб, реакции аллергениндуцированного повреждения лейкоцитов, реакции дегрануляции тучных клеток и иммуноферментного анализа.

Обследованы пациенты с непереносимостью металлических изделий, с положительными результатами аппликационных проб, к солям NiCl2 (n=20), CrCl3 (n=20), CoCl2 (n=20), CuCl2 (n=20) и пациенты без аллергии на металлы (n=20).

Установлена прямая корреляция между результатами выявления сенсибилизации ионам металлов в аппликационных пробах и методами in vitro: с реакцией аллергениндуцированного повреждения лейкоцитов: с NiCl2 (R=0,75; p=0,0001), с CrCl3 (R=0,79; p=0,002), с CoCl2 (R=0,9; p=0,00001), с CuCl2 (R=0,67; p=0,001); с реакцией дегрануляции тучных клеток: с NiCl2 (R=48; p=0,03), с CrCl3 (R=0,44; p=0,04), с CoCl2 (R=0,55; p=0,01); с результатами иммуноферментного анализа: с Ni2+ (R=0,45; p=0,04), с Cr3+ (R=0,49; p=0,02) и с Co2+ (R= 0,45; p=0,04).

Ключевые слова: аллергия, диагностика, лейкоциты, lgE-антитела.

Abstract. The aim of this work was the analysis of the diagnosis results of allergy to metals with the use of patch tests, reactions of allergen induced damage of leukocytes and degranulation reaction of mast cells and the enzyme-linked immunosorbent assay.

Patients with intolerance to metal products, with positive results of patch tests, to salts NiCl2 (n=20), CrCl3 (n=20), CoCl2 (n=20), CuCl2 (n=20) and patients without any allergy to metals (n=20) were examined.

Direct correlation between the results of identification of sensitization to metal ions in patch tests and in vitro methods has been established: with reaction of allergen induced damage of leukocytes: with NiCl2 (R=0,75; p=0,0001), with CrCl3 (R=0,79; p=0,002), with CoCl2 (R=0,9; p=0,00001), with CuCl2 (R=0,67; p=0,001); with degranulation reaction of mast cells: with NiCl2 (R=48; p=0,03), with CrCl3 (R=0,44; p=0,04), with CoCl2 (R=0,55; p=0,01); with enzyme-linked immunosorbent assay results: with Ni2+ (R=0,45; p=0,04), with Cr3+ (R=0,49; p=0,02) and with Co2+ (R = 0,45; p=0,04).

Гостав и структурное состояние металлических сплавов определенным образом влияет на организм человека [1, 2]. Катионы металлов, выделяемые из

Адрес для корреспонденции: 210029, г. Витебск, ул. Правды, д. 66, кв. 112. Тел. моб.: +375 (29) 711-97-36, e-mail: [email protected] - Карпук Н.А.

сплавов, могут оказывать неблагоприятное воздействие на организм в целом, что проявляется в виде субъективных и объективных признаков [3-6].

В сыворотке крови у пациентов с аллергией находят антитела к различным аллергенам, в том числе и к металлам. Наибольшее количество свободных антител в крови паци-

ента появляется через несколько дней после контакта с аллергеном. В острый период реакции титр их обычно снижен, а при затихании обострения повышается. Большую роль в аллергодиагностике играют антитела класса IgE, ответственные за анафилактический тип аллергической реакции и выявляемые в высоком титре в сыворотке крови [7-12].

Эта статья посвящена выявлению сенсибилизации к металлам путем обнаружения IgE-антител в сыворотке крови с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК), а также оценке сенсибилизации лейкоцитов в реакции аллергениндуцированного повреждения лейкоцитов (РАПЛ), анализу полученных результатов.

Цель исследования - анализ результатов диагностики аллергии на металлы, проведенной с использованием аппликационных проб, реакции аллергениндуцированного повреждения лейкоцитов, реакции дегрануляции тучных клеток и иммуноферментного анализа.

Методы

Для достижения поставленной цели нами были сформированы группы пациентов с непереносимостью металлических изделий, с резкоположительными, сильноположительными и положительными реакциями по результатам аппликационных проб (АП), к солям NiCl2 (n=20), CrCl3 (n=20), CoCl2 (n=20), CuCl2 (n=20), составивших исследуемую группу.

Контрольную группу составили 20 практически здоровых человек, сопоставимых по полу и возрасту с пациентами исследуемых групп.

Аппликационные пробы.

Для постановки кожных проб в качестве тестовых субстанций нами были использованы соли NiCl2 (3%), CrCl3 (3%), CoCl2 (1%), CuCl2 (0,5%), встречающиеся в составе неблагородных и благородных сплавов, которые характеризовались чистотой 99%.

Постановка аппликационного тестиро-

вания с вышеуказанными солями осуществлялась на вазелиновой основе с использованием в качестве аппликатора лейкопластыря «Унипласт фиксирующий» 5x500 см.

Результаты постановки АП оценивались через 3, 24 и 48 часов.

В качестве негативного контроля использовался чистый медицинский вазелин.

Обновление диагностических растворов проводили не реже 2-3 недель.

Определение IgE-антител к металлам методом ИФА.

Для выявления IgE-антител к ионам металлов мы использовали стандартную имму-ноферментную тест-систему фирмы EUROIMMUN (Германия).

В качестве аллергенов были использованы аллергодиски с Ni-HSA, Cr-HSA, Co-HSA, Au-HSA.

Кровь забирали из вены в пробирку и получали сыворотку. Сыворотку хранили в течение 2-3 дней при температуре 2-8°С. Специфические IgE-антитела, присутствующие в сыворотке пациента с аллергией на металлы, при внесении сыворотки в планшету и инкубации 1 час при 37°С присоединялись к ионам металлов (аллергенам), ковалентно связанным с целлюлозными дисками. Неспецифические IgE удаляли при промывке. Фермент-меченые анти- IgE добавляли в систему и инкубировали 1 час при 37°С, после чего образовывался комплекс аллерген-IgE-анти-IgE-щел очная фосфатаза. После последующей промывки добавляли хромогенный субстрат (раствор п-нитрофенилфосфата - p-NPP), что приводило к развитию желтой окраски реакционной смеси, интенсивность которой измеряли фотометрически (405 нм).

Для получения сопоставимых результатов различных серий опытов и исключения зависимости от активности компонентов им-муноферментной реакции результаты ИФА выражали в условных единицах (EU, Elisa Units), рассчитанных по формуле 1 [3]:

EU=(ODоп.xODср.сч.): (ОБоп.сч.)х100% (1)

где, EU - значение скорректированной активности ИФА;

ОБоп. - оптическая плотность в лунке с исследуемым образцом в данном опыте;

ОБоп.ст. - оптическая плотность в лунке с положительной контрольной сывороткой в данном опыте;

ОБср.ст. - средняя оптическая плотность в лунках с положительной контрольной сывороткой в серии из независимых опытов.

Положительной реакцию считали, когда при визуальной оценке результатов окраска опытной пробы была более желтая, чем пробы отрицательного контроля, и легко различима. По окрашенной шкале - оценка от «+» до «+++». В других случаях реакцию трактовали как сомнительную; при фотометрической оценке результатов: оптическая плотность опытной пробы превышала оптическую плотность пробы отрицательного контроля не менее чем вдвое, и она не менее 0,600. При превышении оптической плотности опытной пробы по сравнению с пробой отрицательного контроля менее чем в 2 раза, а также в других случаях результат считали сомнительным.

Определение сенсибилизации лейкоцитов с использованием РАПЛ.

В качестве аллергенов использовали растворы солей металлов. Оптимальная концентрация аллергенов для РАПЛ была определена с лейкоцитами 20 пациентов с аллергией на металлы и 20 здоровых лиц без аллергии. Установлено, что 0,01% растворы NiCl2, CrCl3,

0,005% раствор CoCl2 и 0,001% раствор CuCl2 не вызывают неспецифического повреждения лейкоцитов в реакции аллергениндуцирован-ного повреждения лейкоцитов.

Поэтому как аллергены использовали растворы солей металлов в физиологическом растворе хлорида натрия в вышеуказанных концентрациях.

Для исследования брали из вены 10 мл крови в пробирку, в которую добавляли 20 ед/ мл гепарина. Использовали суспензию неразделенных лейкоцитов, полученных из плазмы крови после её отстаивания 30-40 мин. Лейкоциты отмывали от плазмы крови раствором хлорида натрия и готовили их суспензию в концентрации 2х106 в 1мл.

0.25.0,05 мл суспензии лейкоцитов смешивали с равным объемом различных концентраций испытуемых аллергенов-растворов солей металлов, к одной пробе (контроль) аллерген не добавляли. Смеси лейкоцитов с аллергенами инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Все пробы дублировали. После инкубации смесь центрифугировали при 1000 об/ мин 5 мин, надосадочную жидкость сливали, добавляли 2 капли 0,1% раствора трипаново-го синего, ресуспендировали и подсчитывали в камере Горяева процент окрашенных лейкоцитов.

Цитотоксический индекс (ЦИ) рассчитывали по формуле 2:

(а-б) : а х 100% (2)

где: а - процент окрашенных клеток в опыте после инкубации с аллергеном; б - то же, но в опыте без аллергена [1].

Интерпретация результатов.

Цитотоксические индексы больше 0,15 или присутствие более 15% поврежденных клеток в опыте по сравнению с контролем указывают на наличие сенсибилизации лейкоцитов к испытуемому аллергену, т.е. на его аллергическую этиологическую роль в данном заболевании.

Диагностика IgE зависимой аллергии с использованием РДТК.

1. Подготовка исследуемой сыворотки.

Кровь больного, взятую путем венепункции, в количестве 5-7 мл обводили по краю стеклянной палочкой, отстаивали до образования сгустка, затем центрифугировали при 1500 об/мин, после этого отбирали сыворотку в пробирку. Сыворотку хранили при -20°С до исследования, не допуская повторного замораживания и отмораживания.

2. Получение тучных клеток мыши.

Мышь декапитировали, в брюшную полость вводили 5-8 мл подогретого до 37°С 0,9 % раствора №С1, приготовленного на 0,15 М фосфатном буфере рН 7,2, и оставляли мышь на 20 минут, периодически массируя ее переднюю брюшную стенку. Затем послойно вскрывали брюшную полость и пинцетом выводили петлю кишечника. Тушку переворачивали в воронку так, чтобы содержимое брюшной полости

стекало по петле в пробирку, содержащую 1 мл забуференного физиологического раствора с 12 каплями гепарина. Перитонеальные клетки отмывали путем центрифугирования при 1000 об/мин по 3-5 минут дважды, добавляя по 2 мл зубуференного физиологического раствора. Полученную суспензию тучных клеток разбавляли до концентрации 2,5x105мл забуферен-ным физиологическим раствором (80-100 тучных клеток в камере Горяева).

Для определения концентрации клеток в лунку круглодонной планшеты вносили 0,02 мл суспензии тучных клеток и 0,02 мл красителя толуидиного синего и подсчитывали в камере Горяева окрашенные клетки.

3. Приготовление растворов аллергенов в рабочей концентрации.

В качестве аллергенов использовали 0,01% растворы №С12, СгС13, СоС12 и СиС12, разведенные раствором Хенкса.

4. Приготовление красителя толуидино-го синего 0,025% спиртового раствора: 25 мл краски растворяли в 100 мл 30% этилового спирта, рН которого доводят до 3,2-3,4 добавлением ледяной уксусной кислоты, примерно 0,03-0,04мл на 10 мл красителя.

5. Постановку реакции осуществляли в планшетах для иммунологических исследований. В опытную лунку вносили 0,02 мл суспензии тучных клеток, добавляли равные объемы растворов аллергенов и снова инкубировали 15 минут при 37°С, а затем вносили по 0,02 мл растворов аллергенов и снова инкубировали при тех же условиях еще 15 минут.

Паралельно ставили два контроля: 1)туч-ные клетки + сыворотка больного + раствор Хенкса; 2) тучные клетки + раствор Хенкса + раствор аллергена.

В опыт и два контроля добавляли 0,02 мл красителя и проводили учет реакции в камере Горяева. Подсчитывали количество тучных клеток, учитывая только целые неповрежденные окрашенные клетки в горизонтальных рядах сетки всей камеры. Разница между контролем и опытом указывала на количество дегранулированных клеток.

Результат реакции рассчитывали по формуле 3:

Х = (К-О) : К х 100% (3)

где: Х - процент дегранулированых тучных клеток;

К - количество клеток в контроле;

О - количество клеток в опыте.

Реакцию считали положительной, если число окрашенных клеток в опыте уменьшалось на 20%, по сравнению с контролем.

Для качественной оценки степени дегрануляции базофилов у конкретного пациента выделяли три степени дегрануляции:

- прирост до 10% - «- » - отрицательная реакция;

- прирост 10 - 19 % - « ± » - сомнительная реакция;

- прирост 20 - 40 % - « + » - положительная реакция;

- прирост более 40 % - « ++ » - резкоположительная реакция.

Для статистической обработки результатов исследования использована прикладная программа Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Анализ результатов диагностики аллергии к Ni2+in vitro.

В опытную группу (n=20) были включены 5 (25%) пациентов с резкоположительными и 15 (75%) с сильноположительными реакциями к NiCl2 по данным АП.

По спектру положительных результатов к Ni-HSA в опытной группе IgE-антитела встречались у 12 (60%) пациентов в ИФА, к раствору соли NiCl2 в РДТК - у 11 (55%), а РАПЛ была положительна у 16 (80%) пациентов (табл. 1).

При этом положительные результаты в РАПЛ и ИФА одновременно наблюдались у 9 (45%) пациентов. IgE-положительными по ИФА и отрицательными в РАПЛ одновременно были 4 (20%) пациента. IgE-отрицательными и положительными по РАПЛ одновременно были 7 (35%) пациентов (табл. 2).

В РАПЛ и РДТК положительными были 8 (40%) пациентов; по РАПЛ положительными и отрицательными по РДТК были 9 (45%) пациентов; по РАПЛ отрицательными и положительными по РДТК были 3 (15%) паци-

Таблица 1

Результаты обследования пациентов с непереносимостью металлических изделий на наличие сенсибилизации к №2+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции п (%) Отрицательные реакции n(%)

ИФА 12 (60%) 8 (40%)

РДТК 11 (55%) 9 (45%)

РАПЛ 16 (80 %) 4 (20%)

Таблица 2

Соотношение результатов обследования пациентов опытной группы на наличие сенсибилизации к №2+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro РАПЛ+ n(%) РАПЛ- n(%) ИФА IgE+ n(%) ИФА IgE- n(%)

ИФА IgE + 9 (45%) 4 (20%) - -

ИФА IgE - 7 (35%) - - -

РДТК+ 8 (40%) 3 (15%) 10 (50%) 1(5%)

РДТК- 9 (45%) 1 (5%) 1(5%) 8(40%)

Таблица 3

Результаты обследования пациентов контрольной группы на наличие сенсибилизации к №2+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n (%) Отрицательные реакции n (%)

ИФА 0 20(100%)

РДТК 1 (5%) 19 (95%)

РАПЛ 1 (5%) 19 (95%)

ента и у 1 (5%) пациента оба теста были отрицательными.

Результаты РДТК и ИФА были положительными у 10 (50%) пациентов; РДТК отрицательным и ИФА положительным был 1(5%) пациент; РДТК положительным и ИФА отрицательным был 1 (5%) пациент; отрицательными в РДТК и ИФА были 8 (40%) пациентов.

При обследовании сывороток крови пациентов контрольной группы 1§Б-антитела к №-НБА выявлены не были; к раствору соли №С12 в РДТК у 1 (5%) пациента; сенсибилиза-

ция лейкоцитов к раствору соли №С12 по РАПЛ установлена у 1 (5%) пациента (табл. 3).

Корреляционный анализ полученных данных с №2+ выявил следующие зависимости: 1) прямую сильную корреляцию РАПЛ и АП с МС12 (3%) (Я=0,75; р=0,0001); 2) прямую умеренную корреляцию АП с №С12 (3%) с РДТК (Я=48; р=0,03) и ИФА (Я=0,45; р=0,04); 3) прямую сильную корреляцию РДТК и ИФА (Я=0,82; р=0,0001); 4) прямую умеренную корреляцию РАПЛ с РДТК (Я=0,61; р=0,004) и с ИФА (Я=0,4; р=0,0з).

Анализ результатов диагностики аллергии к Cr3+ in vitro.

В группу с непереносимостью хрома вошли 6 (30%) пациентов с резкоположительными и 14 (70%) пациентов с сильноположительными реакциями к раствору соли CrCl3 по данным АП.

По спектру положительных результатов к Cr-HSA в опытной группе IgE-антитела встречались у 14 (70%) пациентов по ИФА и у 8 (40%) к раствору соли NiCl2 по РДТК, а РАПЛ была положительна у 17 (85%) пациентов (табл. 4).

При этом положительные результаты в РАПЛ и ИФА одновременно наблюдались у 11 (55%) пациентов. IgE-положительными и отрицательными по РАПЛ одновременно были 3 (15%) пациента. IgE-отрицательными и положительными в РАПЛ одновременно были 6 (30%) пациентов (табл. 5).

В РАПЛ и РДТК положительными были 5 (25%) пациентов; по РАПЛ положительными и отрицательными по РДТК были 12 (60%)

пациентов; по РАПЛ отрицательными и положительными по РДТК были 2 (10%) пациента и отрицательным по РАПЛ и РДТК был

1 (5%) пациент.

Результаты РДТК и ИФА были положительными у 7 (35%) пациентов; РДТК отрицательным и ИФА положительным были 7 (35%) пациентов; РДТК положительным и ИФА отрицательным был 1 (5%) пациент; отрицательными по РДТК и ИФА были 5 (25%) пациентов.

У пациентов контрольной группы обнаружены IgE-антитела к Cr -HSA методом ИФА у 1 (5%) пациента; сенсибилизация к раствору солей CrCl3 в РДТК и по РАПЛ обнаружена у 1 (5%) пациента (табл. 6).

Корреляционный анализ полученных данных с Cr3+ выявил следующие зависимости: 1) прямую сильную корреляцию РАПЛ и АП с CrCl3 (3%) (R=0,79; p=0,0002); 2) прямую умеренную корреляцию АП с CrCl3 (3%) с РДТК (R=0,44; p=0,04) и ИФА (R=0,49; p=0,02); 3) прямую умеренную корреляцию РДТК и

Таблица 4

Результаты обследования пациентов с непереносимостью металлических изделий на наличие сенсибилизации к Сг3+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

ИФА 14 (70%) 6 (30%)

РДТК S (40%) 12 (60%)

РАПЛ 17 (S5%) 3 (15%)

Таблица 5

Соотношение результатов обследования пациентов опытной группы на наличие сенсибилизации к Сг3+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro РАПЛ+ n(%) РАПЛ- n(%) ИФА IgE+ n(%) ИФА IgE- n(%)

ИФА IgE + 11 (55%) 3 (15%) - -

ИФА IgE - 6 (30%) - - -

РДТК+ 5 (25%) 2 (10%) 7 (35%) 1 (5%)

РДТК- 12 (60%) 1 (5%) 7 (35%) 5 (25%)

Таблица 6

Результаты обследования пациентов контрольной группы на наличие сенсибилизации к Сг3+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

ИФА 1 (5%) 19 (95%)

РДТК 1 (5%) 19 (95%)

РАПЛ 1 (5%) 19 (95%)

Таблица 7

Результаты обследования пациентов с непереносимостью металлических изделий на наличие сенсибилизации к Со2+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

ИФА 11 (55%) 9 (45%)

РДТК 14 (70%) 6 (30%)

РАПЛ 1S (90%) 2 (10%)

Таблица 8

Соотношение результатов обследования пациентов опытной группы на наличие сенсибилизации к Co2+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (n=20)

Методы диагностики in vitro РАПЛ+ n(%) РАПЛ- n(%) ИФА IgE+ n(%) ИФА IgE- n(%)

ИФА IgE + 11 (55%) - - -

ИФА IgE - S (40%) 1 (5%) - -

РДТК+ 13 (65%) 1 (5%) 10 (50%) 4 (20%)

РДТК- 4 (20%) 2 (10%) - 6 (30%)

ИФА (R=0,68; p=0,0007); 4) прямую умеренную корреляцию РАПЛ с РДТК (R=0,55; p=0,01) и с ИФА (R=0,052; p=0,01).

Анализ результатов диагностики аллергии к Co2+ in vitro.

В группу пациентов с непереносимостью кобальта вошли ранее обследованные 7 (35%) пациентов с резкоположительными, 8 (40%) пациентов с сильноположительными и 5 (25%) пациентов с положительными реакциями к раствору соли CoCl2 по данным АП.

Методом ИФА IgE-антитела к Co-HSA выявлены у 11 (55%) пациентов, с помощью

РДТК сенсибилизация к раствору соли CoCl2 обнаружена у 14 (70%) пациентов, а РАПЛ была положительна у 18 (90%) пациентов (табл. 7).

Положительные результаты по РАПЛ и ИФА одновременно наблюдались у 10 (50%) пациентов. IgE-положительными и отрицательными по РАПЛ одновременно были 8 (40%) пациентов. По РАПЛ и ИФА одновременно были 2 (10%) пациента (табл. 8).

По РАПЛ и РДТК положительными были 13 (65%) пациентов; по РАПЛ положительными и отрицательными по РДТК были 4 (20%) пациентов; по РАПЛ отрицательны-

ми и положительными по РДТК 1 (5%) пациент и отрицательными по РАПЛ и РДТК были

2 (10%) пациента.

Результаты РДТК и ИФА были положительными у 10 (50%) пациентов; РДТК отрицательным и ИФА положительным были 4 (20%) пациентов; РДТК положительным и ИФА отрицательным были 4 (20%) пациента; отрицательными по РДТК и ИФА были 6 (30%) пациентов.

В контрольной группе пациентов (п=20) 1§Б-антитела к Со-НБА методом ИФА выявлены не были; к раствору соли СоС12 по РДТК сенсибилизация отмечена у 2 (10%) пациентов; по РАПЛ сенсибилизация лейкоцитов к раствору соли СоС12 выявлена у 1 (5%) пациента (табл. 9).

Корреляционный анализ полученных данных с Со2+ выявил следующие зависимости: 1) прямую сильную корреляцию РАПЛ и АП с СоС12 (1%) (Я=0,9; р=0,00001); 2) прямую умеренную корреляцию АП с ИФА (Я= 0,45; р=0,04) и АП СоС12 (1%) с РДТК (Я= 0,55; р=0,01); 3) прямую сильную корреляцию РДТК и ИФА (Я=0,87; р=0,0001); 4) прямую умеренную корреляцию РАПЛ с РДТК (Я= 0,57; р=0,009) и РАПЛ с ИФА (Я=0,53; р=0,01).

Анализ результатов диагностики аллергии к Au-HSA и CuCl2 in vitro.

Известно, что золото инертно по своей биологической сути и не может вызывать аллергических реакций, однако входящая в состав его сплавов медь (до 6%) (чаще всего является причиной возникновения аллергических реакций на золотой сплав. Поэтому целью данного раздела явилось определение сенсибилизации к меди у пациентов с непереносимостью изделий из сплавов золота, с одновременным определением IgE-антитела к Au-HSA методом ИФА для установления причинных аллергенов в развитии непереносимости у пациентов, пользующихся золотыми изделиями.

В данную группу вошли пациенты с непереносимостью изделий из сплавов золота по анамнезу и по данным объективного обследования, из которых у 1 (5%) пациента отмечена резкоположительная реакция, 7 (35%) пациентов сильноположительные и 12 (60%) пациентов положительные реакции к раствору соли CuCl2 in vivo.

С использованием РДТК сенсибилизация к раствору соли CuCl2 обнаружена у 11 (55%) пациентов, а РАПЛ была положительна у 15 (75%) пациентов (табл. 10).

Таблица 9

Результаты обследования пациентов контрольной группы на наличие сенсибилизации к Со2+, определяемой в РАПЛ, РДТК и ИФА (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

ИФА 0 20 (100%)

РДТК 2 (10%) 18 (90%)

РАПЛ 1 (5%) 19 (95%)

Таблица 10

Результаты обследования пациентов с непереносимостью металлических изделий на наличие сенсибилизации к раствору соли СиС12, определяемой в РДТК и РАПЛ (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

РДТК 11(55%) 9(45%)

РАПЛ 15 (75%) 5(25%)

По РАПЛ и РДТК положительными были 5 (25%) пациентов; по РАПЛ положительными и отрицательными по РДТК были 10 (50%) пациентов; по РАПЛ отрицательными и положительными по РДТК были 3 (15%) пациента и 1 (5%) пациент с отрицательными реакциями по РАПЛ и РДТК (табл. 11).

В контрольной группе по РДТК и по РАПЛ сенсибилизация к раствору соли CuCl2 выявлена у 1 (5%) пациента (табл. 12).

Методом ИФА IgE-антитела к Au-HSA были выявлены у 1(5%) пациента, а в контрольной группе пациентов IgE-антитела выявлены не были.

Корреляционный анализ полученных данных с CuCl2 и Au-HSA выявил следующие зависимости: 1) прямую умеренную корреляцию РАПЛ и АП (R=0,67; p=0,001); 2) отсутствие корреляции АП с CuCl2 (0,5%) и РДТК (R=0,18; p=0,44) и ИФА(Au-HSA) (R=0,02; p=0,95); 3) отсутствие корреляции РДТК и ИФА(Au-HSA) (R= -0,44; p=0,55); 4) отсутствие корреляции РАПЛ с РДТК (R=-

0,18; p=0,32) и с ИФА (Au-HSA) (R=0,08; p=0,72).

Заключение

Совокупность результатов, полученных в ходе выполнения работы по диагностике

аллергии на металлы у пациентов, дает основание сделать следующие выводы:

1. Установлена прямая корреляция между результатами выявления сенсибилизации к ионам металлов в аппликационных пробах и методами in vitro: с реакцией аллергенин-дуцированного повреждения лейкоцитов: с NiCl2 (R=0,75; p=0,0001), с CrCl3 (R=0,79; p=0,002), с CoCl2 (R=0,9; p=0,00001), с CuCl2 (R=0,67; p=0,001); с реакцией дегрануляции тучных клеток: с NiCl2 (R=48; p=0,03), с CrCl3 (R=0,44; p=0,04), с CoCl2 (R=0,55; p=0,01); с результатами иммуноферментного анализа: с Ni2+ (R=0,45; p=0,04), с Cr3+ (R=0,49; p=0,02) и с Co2+ (R= 0,45; p=0,04).

2. Доказано наличие прямой корреляции результатов выявления сенсибилизации к металлам с использованием реакции дегрануляции тучных клеток и иммуноферментного анализа: к Ni2+ (R=0,82; p=0,0001), к Cr3+ (R=0,68; p=0,0001) и к Co2+ (R=0,77; p=0,0007).

3. Результаты выявления сенсибилизации к растворам солей с применением реакции аллергениндуцированного повреждения лейкоцитов прямо умеренно коррелируют с результатами реакции дегрануляции тучных клеток: с NiCl2 (r=0,48; p=0,03), с CrCl3 (R=0,44; p=0,04), с CoCl2 (R=0,55; p=0,01).

4. Установлена прямая умеренная корреляция результатов выявления сенсибилизации

Таблица 11

Соотношение результатов обследования пациентов опытной группы на наличие сенсибилизации к раствору соли СиС12, определяемой в РАПЛ и РДТК (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

РДТК+ 7 (35%) 5 (25%)

РДТК- 7 (35%) 1 (5%)

Таблица 12

Результаты обследования пациентов контрольной группы на наличие сенсибилизации к раствору соли СиС12, определяемой в РАПЛ и РДТК (п=20)

Методы диагностики in vitro Положительные реакции n(%) Отрицательные реакции n(%)

РДТК 1 (5%) 19 (95%)

РАПЛ 1 (5%) 19 (95%)

к ионам металлов с применением реакции аллергениндуцированного повреждения лейкоцитов и иммуноферментного анализа: с Ni2+ (R=0,45; p=0,04), с Cr3+ (R=0,49; p=0,02), с Co2+ (R=0,45; p=0,04).

Литература

1. Lygre H. Prosthodontic biomaterials and adverse reactions: a critical review of the clinical and research literature // Acta Odontol. Scand. -2002. -Vol.60, №1. -P. 1-9.

2. Wataha J.C., Messer R.L. Casting alloys // Dent. Clin. North. Am. -2004. - Vol.48, №2. -P.499-512.

3. Максимовский Ю.М., Гринин В.М., Горбов С.И. Биосовместимость сплавов, используемых в стоматологии // Стоматология. - 2000. - №4. -С.73-76

4. Beneko V. Nickel: a review of its occupational and environmental toxicology // Epidemiol. Microbiol. Immunol. -1983. -Vol.27. -P.237-247.

5. Plaque formation in vitro on wires by gram-negative oral microorganisms (Veillonella) / H. Bladen, G. Hageage, F. Pollock et al. // Arch. Oral. Biol. -1970. -Vol.15, №2. -P. 127-133.

6. Wise M.D Dykema R.W. The plaque-retaining capacity of four dental materials // J. Prosthet. Dent. -1975. -Vol.33, №2. -P.178-190.

7. Новиков, Д.К. Оценка иммунного статуса / Д.К. Новиков, В.И. Новикова. - М.-Витебск, 1996. - 282 с.

8. Новиков, Д.К. Клиническая иммунология / Д.К. Но-

виков, П.Д. Новиков. - М.-Витебск, 2006. - 366 с.

9. Новиков, П.Д. Иммунодиагностика / П.Д. Новиков. - Витебск, 2006. - 250 с.

10. Ройт, А. Иммунология/ А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл - М.: Мир, 2000. - 581 с.

11. Хаитов, Р.М. Аллергология и иммунология. Национальное руководство/ Р.М. Хаитов, Н.И. Ильина. -ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 380 с.

12. Alanko K., Kanerva L., Jolanki R., et al. Oral mucosal diseaseinvestigated by patch testing with a dental screening series. Contact Dermatitis. 1996. Vol. 34. P. 263-267.

Поступила 02.03.2012 г. Принята в печать 04.06.2012 г.