CC BY
71
УДК 576.856.25
С.И. Беликов, Г.Н. Леонова, И.Г. Кондратов, Е.В. Романова, Е.В. Павленко
АНАЛИЗ ПОЛНОГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ШТАММОВ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО СУБТИПА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ОБЛАДАЮЩИХ РАЗЛИЧНОЙ НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬЮ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА
Лимнологический институт СО РАН, Иркутск,
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток
Определена полногеномная последовательность вируса клешевого энцефалита (КЭ) штамма Primorye-86, выделенного от умершего больного с очаговой формой инфекции, и проведен анализ последовательности в сравнении с опубликованными ранее полногеномными последовательностями вируса КЭ с целью поиска участков генома, мутации в которых могут быть связаны с изменениями в нейровирулентности штаммов вируса КЭ. Показано, что потенциально важные для нейровирулентности участки имеются в капсидном белке С, неструктурных белках NS1 и NS3 и З'-нетранслируемом участке вирусной РНК.
Ключевые слова: вирус клещевого вирулентность
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к роду Flavivirus семейства Flaviviridae, основным хозяином и переносчиком которого являются таежные клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus. Флавивирусы представляют сферические частицы диаметром 50 нм, покрытые липидной оболочкой, содержащие РНК положительной полярности и множество копий капсидного, оболочечного белков, мембранного белка или его предшественника [1]. Флавивирусы в процессе созревания аккумулируются во внутриклеточных вакуолях клетки и выходят из нее после слияния вакуолей с внешней мембраной клетки. Вирусные частицы, ассоциированные с внешней мембраной, содержат два белка — преМ и Е размером 22 и 55 kDa соответственно. Сразу после освобождения вирусных частиц N-концевая часть белка отщепляется, так что в составе зрелой вирусной частицы остается короткий белок М (8 kDa) [2]. Геномная РНК фла-вивирусов имеет переменный размер около 11000 нуклеотидов и выполняет в клетке роль мРНК.
К настоящему времени известно, что ВКЭ, широко распространенный в лесной зоне Евразийского континента, представлен тремя субтипами: это дальневосточный — встречающийся в основном на Дальнем Востоке, сибирский
— на остальной территории России и европейский
— на территории Западной Европы (прототип-ные штаммы этих субтипов — Sofijn, Vasilchenko, Neudoerfl соответственно).
Ранее нами было показано, что на коротком фрагменте гена, кодирующего поверхностный белок Е, у штаммов трех субтипов ВКЭ существуют
энцефалита, полногеномная последовательность, нейро-
достоверные отличия, которые позволяют создать диагностический набор для их идентификации [3]. Было высказано предположение о том, что раннее определение субтипа вируса непосредственно в клеще, присосавшемся к человеку, может позволить предсказывать тяжесть заболевания и своевременно назначать адекватную терапию. Однако последующее более детальное изучение этого вопроса показало бесперспективность такой диагностики, основанной на определении субтипа вируса, так как не существует однозначной связи между субтипом вируса и его вирулентностью. Так, штаммы А ¡па и УазЛсБопко, являются представителями сибирского субтипа ВКЭ, но выделены они от умерших больных КЭ. Также как не все штаммы дальневосточного субтипа вируса обладают высокой вирулентностью для человека, они способны вызывать от тяжелых очаговых до инаппарантных форм КЭ [4].
В то же время, на основании анализа фрагмента белка Е нами было выяснено, что штаммы ВКЭ дальневосточного субтипа разделяются на три субклайда. В субклайд с прототипным штаммом Бофп вошли наиболее вирулентные штаммы, выделенные от умерших и больных с очаговой формой КЭ. В субклайд с прототипным штаммом 08Ыша-5-10 (Япония) вошли штаммы, выз-вающие чаще инаппарантную и реже манифестные формы КЭ. Третий субклайд сформировали штаммы БепгаБа^ и НеЬаг (Китай) и Рптогуе-85, выделенный нами из мозга умершего больного очаговой формой КЭ [5]. Отсюда следовало, что нуклеотидной последовательности анализируе-
мого участка гена белка Е достаточно для деления штаммов на субклайды, но не достаточно для точного предсказания тяжести заболевания заразившегося человека вирусом КЭ.
По нашему мнению, анализ всего генома вируса сможет позволить найти участки, ответственные за вирулентность штаммов вируса КЭ. Хотя нельзя не учитывать иммунобиологические особенности макроорганизма, влияющего на характер клинического течения инфекции.
Целью настоящего исследования явилось полногеномное секвенирование штамма Primorye-86 вируса КЭ, выделенного от умершего больного с очаговой формой инфекции, и установление связи нуклеотидных замен в последовательности всего генома шести штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с их вирулентными свойствами.
Материалы и методы
Штамм Primorye-86 (Р-86) ВКЭ был выделен из мозга умершего больного с очаговой формой инфекции, заражение которого произошло в 1986 г. на территории Кировского района Приморского края.
Суммарную РНК из тканей зараженных животных выделяли с помощью набора «Рибо-Золь-А» (АмплиСенс, Россия, кат.№ К2-2-100) согласно протоколу фирмы-изготовителя. Препараты суммарной РНК хранили после выделения в 50% изопропаноле при -20 °С. Перед постановкой реакции обратной транскрипции препараты РНК подвергали дополнительной очистке с помощью набора «Рибо-сорб» (АмплиСенс, Россия, кат. № К2-1-100) согласно протоколу фирмы-изготовителя.
кДНК получали с использованием набора «Реверта-L-lOO» (АмплиСенс, Россия, кат. № КЗ-4-100) согласно протоколу фирмы-изготовителя и затем без дополнительного обогащения использовали для амплификации перекрывающихся фрагментов генома средней длиной 1000 пар нуклеотидов.
Амплификацию фрагментов вирусного генома осуществляли в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 65 mM TrisHCl рН 8,8, 20 mM (NH4)2S04, 0,01% Tween-20, 10 ррМ каждого праймера, 0,05 ед. Taq полимеразы, 0,2 тМ каждого дНТФ и 2 мкл препарата кДНК.
Амплификацию проводили в приборе «DYAD DNA Engine, MG Research» в следующем режиме: 96 °С — 1 минута, затем 30 циклов 96 °С — 1 секунда, 50 °С — 1 секунда, 72 °С — 45 секунд, 72 °С — 1 минута. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле в 0,5 кратном Трис-ацетатном буфере (20 mM Трис-ацетат, рН 8,5).
Ампликоны выделяли электрофорезом в 1% геле агарозы в трис-ацетатном буфере, ДНК из
агарозы выделяли метом замораживания с последующим центрифугированием через фильтр. ДНК из раствора осаждали равным объемом изопропа-нола и выдерживанием при 4 °С в течение ночи.
Клонирование ампликонов осуществляли с помощью набора «InsTAclone PCR Cloning Kit, Fermentas, кат. № К1214» согласно протоколу фирмы-изготовителя. Наличие и размер вставки определяли амплификацией с универсальными плазмидными праймерами: M13/pUC-F(-20) и M13/pUC-R (-26).
Секвенирование полученных клонов осуществляли с помощью набора «Genome Lab DTCS-Quick Start Kit, Beckman Coulter»Ha секвенаторе CEQ-8800 (Beckman Coulter). Анализ полученных результатов осуществляли с помощью пакета программ «BioEdit».
Сравнительный анализ опубликованных полногеномной последовательности штамма Р-86 с полногеномными последовательностями 5 штаммов дальневосточного субтипа ВКЭ, опубликованных в базе данных GenBank (штаммы Sofjin (выровненная последовательность Y08863, Х03870, Х03871, Х7795 и AF013399), Sofjin-HO (АВ062064), Senzhang (AY182009), Glubinnoe (DQ862460), Oshima-5-lO (AB062063).
Филогенентический анализ был проведен по методу neighbor-joining с использованием программы TREECON (Yves Van de Peer).
Результаты и обсуждения
Было выяснено, что длина нуклеотидной последовательности геномной РНК анализируемых нами штаммов значительно варьируют от 10245 до 11100, для штамма Р-86 она составила 10881. Прежде всего перед нами стояла задача выяснить, как давно произошло разделение штаммов вируса КЭ на субтипы. На рисунке 1 показано филогенетическое древо флавивирусов, передаваемых через укус клеща, из которого следует, что такое разделение произошло давно. Величины расхождения трех субтипов ВКЭ сравнимы с величинами расхождения между вирусом Louping ill и ВКЭ европейского субтипа (штамм Neudoefl). Согласно расчетам Zanotto [6], время дивергенции вируса Louping-ill и дальневосточного субтипа ВКЭ составляет 595±82 лет, а европейского субтипа ВКЭ — 431±67 лет при скорости эволюции равной 4,12х 105 несинонимичных замен на сайт в один год.
Далее был проведен анализ нуклеотидных замен в белках изучаемых штаммов, которые могли бы отразиться на важную характеристику (вирулентность) штаммов дальневосточного субтипа ВКЭ.
Анализ транслированных
последовательностей белков
Штаммы ВКЭ кодируют один белок полипротеин (polyprotein) длиной 3414 аминокислот.
флавивирусов, передаваемых клещами, построенное методом neighbor-joining на основе анализа полногеномных последовательностей вирусных РНК. Штаммы Sofjin, Neudoetfl и Vasilchenko являются прототипными штаммами дальневосточного, европейского и сибирского субтипов вируса КЭ
В таблице 1 видно, что полипротеин всех анализируемых штаммов является высоко консервативным. Наименьшее сходство имеют штаммы Glubinnoe и Sofjin (97,54% идентичных аминокислот), а максимальное сходство — штаммы Oshima и Р-86 (98,92%). Последовательность такой большой длины сложно отобразить и анализировать, поэтому для удобства анализа мы удалили у всех штаммов совпадающие аминокислоты и оставили только различающиеся позиции. Количество таких различающихся позиций у шести анализируемых штаммов составило 150, что позволило достаточно легко оперировать с последовательностью такой длины. Последовательность, составленная из мутантных сайтов, представлена в таблице 2.
Показано сравнение мутантных сайтов, причем абсолютно похожие аминокислоты помечены темно-серым цветом, слабо выраженное сходство — серым цветом, отличающиеся аминокислоты не выделены. В таблице также выделены позиции отдельных белков, на которые расщепляется полипротеин в процессе протеолиза собственными или клеточными протеазами.
Рассмотрим позиции мутаций в отдельных белках ВКЭ и их возможную связь с вирулентностью. Полипротеин флавивирусов подвергается ко- и пост-трансляционному процессингу клеточными и вирусными протеазами на индивидуальные белки и организован следующим образом:
H2N-C-prM-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-COOH [7].
Таблица '
Процент идентичности аминокислотных последовательностей полипротена
Sofjin Sofjin-HO Senzhang Glubinnoe P-86
Sofjin-HO 98,48% *
Senzhang 97,86% 98,59% *
Glubinnoe 97,54% 98,30% 98,39% *
Р-86 98,01% 98,59% 98,42% 98,15% *
В процессинг вовлечены по крайней мере трг протеазы. Расщепление связей в С-ргМ, ргМ-Е E-NS1 и NS4A-NS4B осуществляется клеточног сигналазой, расположенной на внутренней частг мембраны эндоплазматического ретикулума. Этг протеаза расщепляет белок после сигнальногс пептида, содержащего гидрофобные остатки, который обычно содержит в позициях -3 и -1 с маленькой нейтральной или гидрофобной боковог цепью [8]. Второй протеазой является комплекс вирусных белков NS2B/NS3, который являете* трипсиноподобной сериновой протеазой расщепляющей белки после последовательности дву> положительно заряженных аминокислот [9]. И наконец, расщепление ргМ до мембранного бел кг М происходит в процессе экзоцитоза протеазог клетки хозяина [10].
Капсидный белок, или белок С, связывается с вирусной РНК с образованием нуклеокапсидг в виде сферических частиц диаметром 32 нм [И] Однако первоначально синтезируется мембрано-ассоциированный белок, а его цитоплазматичес-кая форма образуется в процессе расщепления мембраносвязанной формы вирусной протеазой — комплексом NS2A/NS3 [11]. Полностью сформированный капсид никогда не обнаруживается в инфицированных клетках, так как, вероятно, созревание вирусных частиц является скоординированным процессом, включающим мембраноассо-циированный белок С, мембранные белки (ргМ) и репликативный комплекс [12]. В группе анализируемых нами штаммов большое количество мутаций (поз. 99, 100, 103, 108 и 111) расположены с С-концевой части белка, в области сигнального пептида, который определяет связывание с внутриклеточной мембраной и вирусной протеазой NS2B-NS3 в процессе созревании белка С и расщепления связи между белком С и ргМ [13]. Теоретически мутации в этой области могут повлиять как на сродство вируса к мембране, так и на скорость отщепления ргМ, что может приводить к изменению скорости накопления вируса в клетках мозга и таким образом менять его вирулентность. Недавно было показано, что делеции в средней части белка С сохраняют жизнеспособность вируса, но уменьшают его вирулентность [14]. Более того, обширная делеция с 28 по 89 аминокислот
Аминокислотные замены полипротеине 6 штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа
Таблица 2
БоГ М к 0. м А К к т V Б С V I, V I. Б Р V V ■
Б-НО м к 0. ь V К к т V Э й V 1 V 1 ? Р м V V
Беп/. м я 0. ь А N к м А 0 Б 1 V V ь ? Р V I V
С1иЬ м к 0. м А N к т А 0 й 1 м м V р Я I V I
Р-86 м к я м А N И т V N в V к V ь 1г Р V V V
О.чЬ м к л м А N к т V 0 в V V V 1 г Р I V V
с
БоГ А V А А К М м N V V V Б с 1 V А V I. Б к
Б-НО А V V А К М I N V V V Б с р у А А 1. с к
Бепх А А А Р К м I т V V V Б с р V А А ь с я
СЫ> А V А А К м I т м V V в 0 р V А А ь в к
Р-86 V V А А К м I N V V А Б с р V А А ь в • к
V V А А К V I N V м А Б с р ь V А р с 1 к
Е
БоГ 1 т Ь Т р V I К 8 Б Е Т V I V т V I м р
Б-НО К т 1 Т Е I I К Б Е Т V 1 ь А I м м р
N(•11/ и т Р Т I V V Я Б Б Е I V V 1 А I м м р
С1иЬ к ь 1 Р V I Я С С I А I 1 А I м V р
Р-86 к т ь Г Р V т Я Б Б Е I А I 1. А I м м V
ОхЬ к 1 ь Т Р V I Я Б Б Е I А I 1 А V м м р
N52:1
БоГ в V Я Б Б ! А 0 С Я I Е Т
Б-НО в V Я Б У I А 0 V Я I Е Т
Бепх » А я Б Б I А п V л т Е 1
01иЬ Б V я Б Б I А Е V Я I С I
Р-86 0 V к Р Б I А й V К 1 Е 1
081) I) V я Р Б V V и V С 1 Е I
ЫБЗ
N 8 Б Б Т I У
Б А $ 1 А я Й
N А Т 1 Т я У
N А Т 1 т я р
N А 8 1 т я а
Б А Б I т я
БоГ Б С N Т Ь V Е А Ь Ь р м н V N Б Р Е А в
Б-НО Б С N т V V Е С й V ь м о V I А А Я А С
Бете Б С N т V I Е А в Ь I м Б V I 5 А Я А в
аиь Б V И А V V 0 А С м р м И V I Б А Я А С
Р-86 Б О N Т V V Е А С 1 р V о А I Б А Я V в
в С N Т V V Е А С ь р м Б V I Б А Я А Б
ЫБ4Ь
БоГ С к к к с А А м я А Т I в Р 1 м с XV V
Б-НО ь я я к У т с V я V I V в о Р I м V
Бепг 1 к я к У т с м к V I V в Б Р 1 м и' А
С1нЬ I. к я к У т с м я V I V А в Р I м XV и' V
Р-86 1 к я к У т с м я V I V в 0 V м V w с V
1 к я я У т в м я V I V с Б р I м w V
БоГ Р а в н I I Б Ц 0 И С 1 0 Т Я я А V А
Б-НО ¥ ь а И I I 5 1 0 R С I Е А I* XV 1 А V I
Бен/, * L с У I V Б 1 N И Я 1 Е А И 1 А I т
С1иЬ Т 1 Е V V. I Б 1 О Л И I Е А р XV ь А I X
Р-86 1 Ь 0 У I I Т 1 п Б К V Е Б И и' ь Т V т
ОяЬ ш Ь 0 У 1 ' Т Е. о Я Я V Е А я у/ р А V т
БоГ Б I А к к Е К Г) Е Б I
Б-Но Б 1 А к к Е К 0 Е 1.
Беп/ Б 1 V к к Е Я Р Е 1 I
аиь Б V V к я К К У N 1 Р
Р-86 Б I т к к Е К э в Ь I
ОкЬ С I V я к Е К » 4_^ I* Е 1 Г
Примечание. Строго похожие аминокислоты помечены темно-серыи цветом, слабо похожие аминокислоты - серым цветом, отличающиеся аминокислоты не выделены. Полиции белков выделены перемежающимися светло- и темно-серыми блоками.
приводит к образованию неинфекционного варианта вируса [15]. Однако в группе анализируемых штаммов нами не обнаружено соответствующих серьезных изменений в данной области.
Белок ргМ участвует в образовании созревающих вирусных частиц, связанных с клеточной стенкой. Незрелые вирусные частицы содержат белок ргМ и белок Е в виде гетеродимера и не являются инфекционными. После расщепления ргМ происходит диссоциация гетеродимера и олигомеризация белка Е [16]. Инфекционные частицы вируса созревают в аппарате Гольджи посредством расщепления ргМ клеточными про-теазами непосредственно перед высвобождением вирусных частиц экзоцитозом [17]. В группе анализируемых нами штаммов мутации в ргМ расположены далеко от места расщепления белка ргМ протеазами и, вероятно, мало влияют на вирулентность штаммов.
Белок Е является основным поверхностным белком вируса КЭ, расположенным на внешней части вирусной мембраны. Он отвечает за связывание вируса с мембраной клетки хозяина, сплавление мембран и проникновение вируса в клетку при помощи эндоцитоза. Ранее предполагали, что белок Е имеет решающее значение для нейропато-генности ВКЭ, поэтому анализировали множество мутаций в гене белка Е и их влияние на вирулентность [18]. Однако у анализируемых нами штаммов, являющихся естественной популяцией вируса дальневосточного субтипа, белок Е является консервативным, а обнаруженные мутации являются случайными и не влияют существенно на конфор-мацию и свойства поверхностного белка вируса.
Белок NS1 является гликопротеином, роль которого окончательно не выяснена. NS1 содержит 12 консервативных цистеинов и два сайта глико-зилирования и выполняет роль кофактора в процессе репликации вирусной РНК [19]. Показано, что мутации в белке NS1 могут влиять на вирулентность флавивирусов [20]. В отличие от других неструктурных белков, NS1 секретируется [21] и связывается повторно с внешней стороной клеточной мембраны [22]. В группе анализируемых нами штаммов пять мутаций расположено в первых 100 аминокислотах N-конца белка NS1, где, как показано [23], мутации детальны при замене заряженных аминокислот на аланин. Мутации в анализируемой нами группе не существенно изменяют полярность аминокислот, поэтому не ясно, могут ли они влиять на нейровирулентность штаммов ВКЭ. Но следует обратить внимание, что мутации в позициях Leu58>Val58, Val?2>Ala72 и Phe93>Leu93 встречаются только в штамме Oshima-5-lO, который является слабовирулентным.
NS2a является небольшим гидрофобным белком массой 22 kDa, играющим роль в репликации
РНК, так как он локализован вместе с двуцепо-чечной РНК и взаимодействует с З'-нетрансли-руемой областью РНК вместе с NS3 and NS5 [30]. Известны мутации, которые блокируют образование инфекционных вирусных частиц [24]. В группе анализируемых нами штаммов не обнаружено мутаций, существенно меняющих свойства белка.
Белок NS2b является еще меньшим белком массой 14,5 kDa, который образует гетеродимер с белком NS3. Этот димер NS2b-NS3 является сери-новой протеазой продуцирующей N-концы NS2B, NS3, NS4A и NS5. Белок имеет три гидрофобных района, фланкирующих консервативный гидрофильный домен размером 40 аминокислот, необходимый для повышения селективности протеазного домена белка NS3 [25]. В группе анализируемых нами штаммов также не обнаружено мутаций, существенно меняющих свойства этого белка.
NS3 является белком размером 69 kDa, обладающим целым рядом активностей, так N-концевая треть белка является доменом протеазы, средняя часть белка — доменом нуклеотид трифосфатазы (NTPase), а С-концевая часть является гелика-зой [26]. На основании молекулярного моделирования было предсказано, что у вируса желтой лихорадки и вируса Денги аминокислоты His-51, Asp-75 и Ser-135 образуют классический каталитический домен сериновых протеаз. Эта каталитическая активность ответственна за образование N-концов NS2B, NS3, NS4A, and NS5 и, возможно, С-конца капсидного белка. В отличие от этих флавивирусов, у анализируемых штаммов вируса КЭ аминокислоты His-53, Asp-77 и Ser-138 заменены на His-54, Glu-77 и Ser-138. Домен протеазы способен индуцировать апоптоз [27]. В группе анализируемых нами штаммов найдено две мутации у маловирулентного штамма Oshima. Мутация приводит к образованию неполярной незаряженной аминокислоты Glyl24 вместо полярной положительно заряженной аминокислоты Arg 124 и аминокислоты Gly485 вместо гидрофильной аминокислоты Ser485. Возможно, что обе мутации могут повлиять на изменение вирулентности вируса КЭ.
Небольшие гидрофобные белки NS4a и NS4b
имеют размеры 16 kDa и 27 kDa соответственно, и их точные функции не известны. Наиболее вероятно, что они принимают участие в образовании репликативного комплекса и обеспечивают закрепление репликазы вируса на мембране. В группе анализируемых нами штаммов найдены мутаций, которые, однако, не меняют существенно свойства белков NS4a и NS4b, поэтому они не могут влиять на вирулентность штаммов.
Белок NS5 флавивирусов является самым большим из неструктурных белков, содержит 905 аминокислот и имеет размер 105 kDa. Белок яв-
ляется многофункциональным, содержит семь мотивов, характерных для РНК-зависимой РНК-полимеразы в С-концевой части белка и два мотива S-аденозил-метионин трансферазы в N-ko-цевой части. Белок NS5 вместе с NS3 и З'-концом РНК образуют репликативный комплекс [28]. В группе анализируемых нами штаммов имеется 4 сайта, консервативных у высоковирулентных штаммов, но имеющих мутации у маловирулентного штамма: Туг... вместо Ser„„„ Phe,.,. > Leuc„,
J 634 643 ' 642 642'
Phe778>Leu77g и Glyg27>Serg27. При этих мутациях свойства аминокислот существенно не изменяются, что, вероятно, не может привести к изменению вирулентности штаммов. Однако необходима проверка возможности влияния этих замен на функционирование репликативного комплекса.
В состав репликативного комплекса входят не только белки, но и З'-нетранслируемый участок вирусной РНК. В процессе репликации вируса синтез плюс- и минус- РНК вируса является асимметричным процессом, т.е. плюс цепи РНК образуется в 10-100 больше, чем минус цепи. Считается, что для синтеза новой вирусной РНК большое значение имеют вторичные структуры З'-конца вирусной РНК и также гипотетические последовательности в 5'-конце вирусной РНК. Эти последовательности могут образовывать вторичные кольцевые структуры, обеспечивающие синтез минус цепи флавививируса [29]. Однако при анализе не-транслируемых участков генома анализируемых нами штаммов с помощью программы MFOLD, мы не нашли существенной гомологии между 5'- и З'-нетранслируемыми участками, которые могли бы обеспечить образование циклической РНК. При анализе З'-нетранслируемого участка вирусной РНК у анализируемой группы штаммов нами обнаружены различия между штаммом Oshima и высоковирулентными штаммами Sofjin-HO, Glubinnoe и Р-86. Штаммы Sofjin и Senzhang не рассматривались в связи с возможностью изменения последовательности в процессе многократных пассажей штамма Sofjin и не полностью прочитанной последовательностью у штамма Senzhang. З'-нетранслируемый участок РНК у штамма Oshima содержит 726 нуклеотидов. Штаммы Sofjin-HO, Glubinnoe имеют протяженную делецию длиной 207 нуклеотидов в районе 64-274, а штамм Р-86 делецию длиной 218 нуклеотидов в позиции 181-400. Позиции нуклеотидов определены от первого нуклеотида после терминирующего кодона гена полипротеина. По нашими расчетам, эти делеции существенно меняют вторичную структуру З'-нетранслируемого участка РНК штаммов ВКЭ. Однако точная роль этих потенциальных вторичных структур не известна, хотя ранее было показано наличие связи вирулентности с вторичными структурами З'-нетранслируемых участков
генома вируса желтой лихорадки [30]. Но в этой публикации рассматривался район длиной 380 нуклеотидов от З'-конца вирусной РНК, в то время как у анализируемой нами группы этот участок является консервативным, а различия имеются в области, находящейся непосредственно перед этим участком. Результаты настоящей работы с очевидностью указывают на то, что количество проанализированных штаммов недостаточно для получения окончательных выводов о точной локализации мутаций, ответственных за вирулентные свойства. Необходимо продолжить определение полногеномных нуклеотидных последовательностей, особенно для штаммов ВКЭ, обладающих пониженной вирулентностью.
Таким образом, в результате анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа, обладающих различной вирулентностью можно сделать ряд выводов:
1. Связь между участками генома ВКЭ и его вирулентностью вероятно существует;
2. Предположительно имеются 4 участка генома, влияющих на вирулентность вируса;
3. Потенциально важные участки локализованы в районах, кодирующих капсидный белок С, неструктурные белки NS1 и NS3 и З'-нетрансли-руемый участок вирусной РНК.
Работа выполнена в рамках интеграционного проекта №19 СО РАН «Пространственно-временная устойчи -вость паразитарных систем в естественных биоценозах на примере природных очагов наиболее важных инфекций позвоночных животных (клещевой энцефалит и трема-тодозы) », 2006 г. _
ANALYSIS OF COMPLETE GENOME SEQUENCE OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRAIN HAVING DIFFERENT NEUROVIRULENCE
S.I. Belikov, G.N. Leonova, I.G. Kondratov, E.V. Romanova, E.V. Pavlenko
It was determined complete genome sequence of tick-borne virus strain Primorye-86, isolated from the died patient with the focal form of an infection and the analysis of sequence in comparison with published earlier complete genome sequences of tick-borne virus was carried out with the purpose of search of genome sites, mutations in which can be connected to changes in neurovirulence of tick-borne virus strains. It was shown, that potentially important sites for neurovirulence are available in capside protein C, not structural proteins NS1 and NS3 and 3'-untranslated region of virus RNA.
Литература
1. Lindenbach, B.D. Flaviviridae / B.D. Lindenbach,
C.M. Rice // Fields Virology / D.M. Knipe, P. Howley,
D.E. Griffin et al. — Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa, 2001. - P. 991-1041.
2. Lindenbach, B.D. Flaviviridae / B.D. Lindenbach, C.M. Rice // In D.M. Knipe, P. Howley, D.E. Griffin et al. Fields Virology, 4th ed. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, Pa. 2001. - P. 991-1041.
3. Westaway, E.G. Flavivirus replication strategy / E. G. Westaway // Adv.Virus Res. - 1987. - Vol. 33. - P. 45-90.
4. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита / В.И. Злобин, С.И. Беликов, Ю.П. Джиоев и др. - Иркутск, 2003. - 271с.
5. Леонова, Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае/ Г.Н. Леонова. — Владивосток, 1997. — 187 с.
6. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит / Г.Н. Леонова, Л.М. Сомова-Исачкова. — Владивосток, 2002. — 205 с.
7. Holmes Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies / P.M. de A. Zanotto, E. A. Gould, G. F. Gao, et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. - 1996.
- Vol. 93. - P. 548.
8. Flavivirus genome organization, expression and replication / T.J. Chambers, C.S. Hahn, R. Galler, C.M. Rice // Annu. Rev. Microbiol. - 1990. - Vol. 44. - P. 649-688.
9. Von Heijne, G. A new method for predicting signal sequence cleavage sites / G. Von Heijne // Nucleic Acids Res. - 1986. - Vol. 14. - P. 4683-4690.
10. Yamshchikov, V.F. Formation of the flavivirus envelope: role of the viral NS2b-NS3 protease / V.F. Yamshchikov, R.W. Compans // J. Virol. - 1995. - Vol. 69.
- P. 1995-2003.
11. Randolph, V.B. Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein / V.B. Randolph, G. Winkler, V. Stollar // Virology. - 1990. - Vol. 174.
- P. 450-458.
12. Yamshchikov, V.F. Processing of the Intracellular form of the West Nile virus capsid protein by the viral NS2B-NS3 protease: an in vitro study / V.F. Yamshchikov, RW. Compans //J. Virol. - 1994. - Vol. 68. -P. 5765-5771.
13. Isolation of capside protein dimmers from the tick-borne encephalitis flavivirus and in vitro assembly of capsid-like particles / S. Kiermayer, R.M. Kofier, C.W. Mandl et al. //J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 8078-8084.
14. Stocks C.E. Signal Peptidase cleavage at the fla-vivrus C-prM junction dependence on the viral NS2b-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signal peptide, and prM / C.E. Stocks, M. Lobigs // J. Virol. - 1998. - Vol. 72. - P. 2141-2149.
15. Spontaneous mutations restore the viability of tick-borne encephalitis virus mutants with large deletions in protein С / R.M. Kofler, A. Leitner, G. O'Riordain et al. // J. Virol. - 2003. - Vol. 77. - P. 443-451.
16. Mimicking live flavivirus immunization with a noninfectious RNA vaccine / R.M. Kofler, J.H. Aberle, S.W. Aberle et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. - 2004. - Vol. 101. -P. 1951-1956.
17. Wengler, G. Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E pre-M protein heterodimers which are
destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release / G. Wengler, G. Wengler //J. Virol. — 1989. -Vol. 63.-P. 2521-2526.
18. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virus / S. Elshuber, S.L. Allison, F.X. Heinz, C.W. Mandl //J. Gen. Virol. - 2003. - Vol. 84. — P. 183-191.
19. Mandl C. W. Steps of the tick-borne encephalitis virus replication cycle that affect neuropathogenesis / C. W. Mandl //Virus Research. - 2005. - Vol. 111. - P. 161-174.
20. Mackenzie J.M. Immunolocalization of the dengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA replication / J.M. Mackenzie, M.K. Jones, P.R. Young // Virology. - 1996. - Vol. 220. - P. 232-240.
21. Lindenbach B.D. Trans-complementation of yellow fever virus NS1 reveals a role in early RNA replication / B.D. Lindenbach, C.M Rice //J. Virol. - 1997. - Vol 71.
- P. 9608-9617.
22. The NS1 protein of tick-borne encephalitis virus forms multimeric species upon secretion from the host cell / A.J. Crooks, J.M. Lee, L.M. Easterbrook et al. //J. Gen. Virol. - Vol. 75. - P. 3453-3460.
23. Newly synthesized dengue-2 virus nonstructural protein NS1 is a soluble protein but becomes partially hydrophobic and membrane-associated after dimerization / G. Winkler, S.E. Maxwell, C. Ruemmler, V. Stollar // Virology. - 1989. - Vol. 171. - P. 302-305.
24. Muylaert, I.R. Genetic analysis of the yellow fever virus NS1 protein: identification of a temperature-sen-sitive mutation which blocks RNA accumulation / I.R. Muylaert, R. Galler, C.M. Rice //J. Virol. - 1997. - Vol. 71.-P. 291-298.
25. Kümmerer B.M. Mutations in the Yellow Fever Virus Nonstructural Protein NS2A Selectively Block Production of Infectious Particles / B.M. Kümmerer, C.M. Rice //J. Virol. - 2002. - Vol. 76. - №10. - P. 4773-4784.
26. Purified NS2B/NS3 Serine Protease of Dengue Virus Type 2 Exhibits Cofactor NS2B Dependence for Cleavage of Substrates with Dibasic Amino Acids in Vitro / R.Yusof, S. Clum, M. Wetzel et al. //]. Biol. Chem.
- 2000. - Vol. 275. - P. 9963-9969.
27. Kadare G. Virus-encoded RNA helicases / G. Kadare, Haenni A.L. //J. Virol. - 1997. - Vol. 71. - P. 2583-2590.
28. Langat Flavivirus Protease NS3 Binds Caspase-8 and Induces Apoptosis / G.G. Prikhod'ko, E. A. Prikhod'ko, A.G. Pletnev, J.I. Cohen // J. Virol. - 2002. - Vol. 76.
- P. 5701-5710.
29. Brinton, M.A. Replication of flaviviruses / M.A. Brinton // The Togaviridae and Flaviviridae / S. Schlesinger and M. Schlesinger (ed.). — New York: Plenum Press,1986. - P. 327-374.
30. Essential role of cyclization sequences in flavivirus RNA replication / A.A. Khromykh, H. Meka, K.J. Guyatt, E.G. Westaway //J. Virol. - 2001. - Vol. 75. -P. 6719-6728.
31. Secondary structure of the 3'-untranslated region of yellow fever virus: implications for virulence, attenuation and vaccine development / V. Proutski, M.W. Gaunt, E.A. Gould, E.C. Holmes //J. Gen. Virol. - 1997. - Vol. 78.-P. 1543-1549.
