CC BY
9УДК 577.21:635.21
А.В. Кондратюк, А.В. Кильчевский, Е.И. Кузьминова
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ БЕЛОРУССКОЙ И ИНОСТРАННОЙ СЕЛЕКЦИИ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
В настоящее время идентификация сортов растений базируется на оценке морфологических и биохимических признаков. По мере создания все большего количества новых сортов этих признаков становится недостаточно. Значительное влияние на морфологические признаки условий окружающей среды, дополняемое элементом субъективности в оценке, может привести к неверным выводам относительно принадлежности генотипа к тому или иному сорту. Кроме того, некоторые диагностические признаки проявляются лишь на определенной стадии развития растения (цветения и созревания плода).
Сложности, связанные с использованием морфологических и биохимических (белковых) маркеров, приводят к необходимости поиска новых, более удобных и надежных методов идентификации сортов растений. Ими на полном основании могут стать молекулярно-генетические методы, основанные на использовании ДНК-маркеров. Они позволяют в значительно большей степени выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, существенно повысить разрешающую силу анализа. ДНК-маркеры можно применять на любых стадиях развития расте-
ния, они более полиморфны и не подвержены влиянию окружающей среды. При использовании молекулярно-генетических методов, анализу можно подвергать различные части растения (листья, стебли, семена, клубни). ДНК-методы незаменимы в спорных случаях, когда применение традиционных подходов не позволяет достоверно различить исследуемые образцы.
В настоящее время SSR-маркеры все чаще используются для идентификации сортов сельскохозяйственных растений. Ряд важных особенностей SSR-локусов, такие как гипервариабельность, высокая плотность и равномерность распределения по геному, делают их весьма эффективным средством изучения меж- и внутривидового разнообразия.
На сегодняшний день выполнен ряд работ по SSR-анализу сортов и диких видов картофеля, результат которых демонстрируют высокую эффективность использования SSR-маркеров как средства идентификации растений [1-10].
Целью данной работы был микросател-литный анализ сортового полиморфизма картофеля белорусской и иностранной селекции, отбор наиболее информативных SSR-локусов для идентификации и последующей паспортизации.
Материалы и методы
Объектом исследований являлись 20 сортов картофеля белорусской и иностранной селекции, включенные в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород, допущенных к использованию на территории Республики Беларусь (Здабытак, Уладар, Журавинка, Бриз, Рагнеда, Ветразь, Дубрава, Универсал, Родео, Астерикс, Маг, Лилея, Талисман, Веснянка, Криница, Скарб, Атлант, Явар, Карлита, Сузорье).
Формы растений для исследований были предоставлены Государственной семенной инспекцией (каждый сорт был представлен 10 растениями).
Экстракцию ДНК проводили из клубней с помощью набора реагентов для выделения ДНК «Нуклеосорб» фирмы «Праймтех», согласно протоколу производителя. Полимераз-ную цепную реакцию проводили с праймера-ми, представленными в табл. 1.
Таблица 1
Структура и хромосомная локализация микросателлитных локусов
№ Локус Повтор Локализация (хромосома) Прямой и обратный праймеры
1 STM2022 (CAA)3...(CAA)3 II GCGTCAGCGATTTCAGTACTA TTCAGTCAACTCCTGTTGCG
2 STM1052 (AT)14 GT(AT)4 VII CAATTTCGTTTTTTCATGTGACAC ATGGCGTAATTTGATTTAATACGTAA
3 STM1031 (GT)6 V TGTGTTTGTTTTTCTGTAT AATTCTATCCTCATCTCTA
4 STM0019 (AT)13 VI AATAGGTGTACTGACTCTCAATG TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG
5 STM0031 (AT)7(GT)10(AT)4 VII CATACGCACGCACGTACAC TTCAACCTATCATTTTGTGAGTCG
б STM2013 (GT)5 (GC)4 (GT)4 VII TTCGGAATTACCCTCTGCC AAAAAAAGAACGCGCACG
7 STM3012 (AC)5 ...(AC)3 IX CAACTCAAACCAGAAGGCAAA GAGAAATGGGCACAAAAAACA
S STM0030 (GCAC)(AC)2 XII AGAGATCGATGTAAAACACGT GTGGCATTTTGATGGATT
9 STM1106 (GCAC)2 X TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG ATGCGAATCTACTCGTCATGG
10 STM1104 (TCTA)6 XIII TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG CAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA
11 STM0037 (CT)4,(CT)8 XI AATTTAACTTAGAAGATTAGTCTC ATTTGGTTGGGTATGATA
12 STM3023 (GT/GC)(GT)8 IV AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA GTTCTGGCATTTCCATCTAGAGA
Реакцию амплификации проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50-100 нг ДНК, по 10 пмоль каждого из праймеров (прямые праймеры мечены флуоресцентными метками Rox, R6G, Tamra, Fam), буфер (10 мМ трис-HCl (pH 8,3), 2,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl), 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 0,5 ед. Tornado Taq-полимеразы.
Полимеразную цепную реакцию проводили при следующих условиях: 95 °С - 15 мин; 30 циклов: 99 °С - 3 сек, Тотж (50-55 °С) - 30 сек, 72 °С - 30 сек; 72 °С -5 мин.
Анализ полученных ПЦР-фрагментов проводился с помощью автоматического секвена-тора Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems (США). Размер продуктов амплификации определяли с применением размерного стандарта молекулярного веса S450 «Синтол» (Россия).
Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ GeneMapper Software Version 4.1 (рис. 1).
Для оценки полиморфизма SSR-локусов использовали индекс полиморфного информационного содержания PIC (polymorphism information content): PIC = 1 - X pi2, где pi - частота встречаемости i-го аллельного фенотипа в выборке. Ввиду сложности определения частот аллелей конкретного локуса у тетраплоид-ного картофеля, при расчете PIC, вместо частот аллелей, использовался показатель частоты аллельных фенотипов [1, 6].
Кластерный анализ выполнен методом UPGMA с использованием программы TREECON для Windows (версия 1.36). Для оценки достоверности построенных деревьев проведен бутстреп (bootstrap) анализ для 100 повторностей.
Результаты и обсуждение
Для анализа полиморфизма и генотипи-рования образцов картофеля было отобрано 12 микросателлитов - STM2022, STM1052, STM1031, STM0019, STM0031, STM2013, STM3012, STM0030, STM1104, STM1106,
STM3023, STM37. Отбор SSR-маркеров проводился на основе числа ранее детектированных аллелей, а также хромосомной локализации [5].
На начальном этапе вся совокупность
Рис. 1. Визуализация продуктов ПЦР (размер аллелей в п.н. локусов
STM3012, STM37, STM0030, БТМ1106у сорта Сузоръе)
изучаемых сортов была исследована по трем наиболее полиморфным SSR-локусам ($ТМ2013, 8ТМ0037, 8ТМ0030). Поскольку ДНК спектры всех индивидуальных образцов в пределах отдельно взятых сортов оказались идентичными по трем наиболее полиморфным микросателлитным локусам, был сделан вывод относительно однородности представленных сортов. В дальнейшем для анализа по 9 другим SSR-локусам ис-
пользовался 1 образец от каждого сорта [2].
Анализ вариабельности двенадцати микросателлитных локусов у 20 сортов картофеля выявил различный спектр изменчивости по анализируемым локусам. Максимальное число аллелей было идентифицировано для локусов БТМ0019 (8), минимальное — для локусов 8ТМ2022 (2), при среднем числе аллелей на локус 4,75 (табл. 2).
Таблица 2
Характеристика SSR-маркеров
Микросателлит Код аллели Количество детектированных аллелей Количество детектированных аллельных фенотипов Размер аллелей Р1С
£ТМ1106 А 4 4 145-161 0,57
£ТМ0037 В 7 16 78-93 0,93
£ТМ3012 С 4 6 169-203 0,75
£ТМ1052 D 5 9 200-253 0,86
£ТМ0031 Е 7 8 157-199 0,78
£ТМ2013 F 6 13 149-167 0,91
£ТМ0019 0 8 11 164-234 0,86
£ТМ0030 I 6 13 139-163 0,89
£ТМ1031 J 5 9 268-282 0,80
£ТМ1104 К 4 7 168-178 0,81
£ТМ2022 ь 2 2 193-233 0,26
£ТМ3023 м 5 10 180-200 0,88
По данным проведенного SSR-анализа все локусы, за исключением STM2022, показали высокую эффективность в выявлении внутривидового полиморфизма и идентификации исследуемых сортов картофеля. Индекс полиморфного информационного содержания (PIC) взятых в анализ SSR-локусов для исследованных сортов был достаточно высок и варьировал в пределах 0,26-0,93. Средний показатель информативности двенадцати исследованных SSR-локусов составил 0,78. Количество детектированных аллельных фенотипов варьировало от 2 (STM2022) до 16 (STM0037). По многим SSR-локусам был получен ряд уникальных аллельных фенотипов, количество которых варьировало в зависимости от локуса STM1106 (l), STM3012 (2), STM1052 и STM0031 (3), STM1104 (4), STM1031 (6), STM2013 (8), STM0030 и STM0019 (9), STM0037 (13).
Для каждого сорта установлена индивидуальная аллельная формула (A, B, C......L,
M - обозначение микросателлитных локусов, цифры индексов - размеры аллелей в п.н.).
Метод позволяет выявлять и внутрипород-ные различия (рис. 2).
1. Здабытак
A В С D F F G
145,147 78,84,93 169,197 212,229 191 149,159,164 191,207 I139,146J270,282K176L193M180,183,190
2. Уладар
A ВС D F F G I Т
161 78,91 169,197 * 229 157,189 151,169 164 141,163 276,282 K168,172L193M200
3. Журавинка
A ВС D f F G I Т
161 78 169,199 229,253 191 151,157 164,191,207 133,148 282 K172,176L193M180,183,193
4. Бриз
A В С D F F G
156 8084,91 169,199 212,221,253 173,191,199 151,167 191,203 I139,146T268K168L193M180,183,190,200
5. Рагнеда
A В С D F F G I
161 78,80,86,91 169,197 229,253 183 151,159,167 180 163 J268K168,172L193M180,200
6. Ветразь
A В С D F F
156,161 78 80,82 86 169,199 212,221,229 191 151,164,167 G191,207I139,163T282K168,176L193M180,183,200
7. Дубрава
A ВС D F F G
156 80,84,91 169,199,203 212,229 191 149,151,159,167 191,203
I139,146J268K168L193M180,183,190,200
8. Универсал
A В С D F F G Т
161 78,82,91 169,199 229,253 173,191 151,159 191,207 139,146 J268,270K168,176L193,233M183,200
9. Родео
A В CD FF G Т
161 78,80,84 169 212,229,253 173 149,157,16^ 191,19^139 J268K168,178L193M180,200
10. Астерикс
A ВС D F F G Т T
161 78,86 169,197 212 173,191 149,159,16^ 197 141 268 K168,172L193M183
11. Маг
A BCD FF G Т T K
156 78,93 169 212,253 191 149,157,164 191 139,146 274,282 168 L193M183,200
12. Лилея
A ВС D FF G Т
161 78,91 169,197 229,253 173 149,157,16^ 19^146,163 T268,270,282K168,172L193,233M180,200
13. Талисман
A В CD FF G Т T
161 82,84,93 169 212,229 191 151,159,16^ 19^139,16^268 K168,178L193M180,193
14. Веснянка
A В C D F F G
156 84,91,93 169,199 212,253 173,191 151,159,164,16^ 191 Т139,163Т268,282К168^193М180,190,193,200
15. Криница
A В С D F F
156,161 78,80,82,86 169,199 221,229 191 151,159,164,167 ^^191Т139,146Т282К168,176^193^^180,183,200
16. Скарб
A В С D FF G
161 78,86,91 169,199 221,229 173 149,159,16^ 191,203 Т139,149Т268К168^193М180,200
17. Атлант
A В С D F F G
145,147 78 84 16^203 212,253 157 149,151,159 191,207 Т139,146Т270,282К168,172^193М180,200
18. Явар
A ВС d FF G Т
161 78,84 169,197,203 221,229 191 149,159,164 197,234 139 J270K168 172L193,233M200
19. Карлита
A В С D F F G
16^ 78 8^ 169,19^ 212,22^ 173,19^ 149,159,164 197,207 Т139,163Т282К172^193М180,183,200
20. Сузорье
A В С D FF
156 81,84,93 169,199 200,221,253 157,193 151,159,164,167 ^^171,207Т139,146,163Т270,282К172^193М180,200
На основе полиморфизма микросателлитных последовательностей построена ден-дрограмма, характеризующая генетические расстояния между исследуемыми сортами картофеля (рис. 2).
Заключение
В результате проведенного SSR-анализа с использованием двенадцати отобранных микросателлитных локусов было охарактеризовано генетическое разнообразие 20 сор-
тов картофеля. Для каждого исследованного сорта установлена аллельная SSR-формула, которая может быть использована в качестве молекулярно-генетического паспорта.
Рис. 2. Дендрограмма, отражающая генетическое сходство между исследованными сортами картофеля
Список используемых источников
Ветразь
Криница
Скарб
Универсал
Веснянка
Бриз
Дубрава
Ли лея
Маг
Родео
Яаар
Ас тер икс
Здабытак
Carlita
Сузоръе
Атлант
Талисман
Журавинкэ
Уладар
Рагнеда
1. Рыжова, Н.Н. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов сортов Картофеля Solanum tuberosum отечественной селекции / Н.Н. Рыжова, Е.В. Мартиросян, Е.З. Кочиева // Генетика. - 2010. - Т. 46. - № 4. - С. 481-487.
2. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: метод. рекомендации / С.В. Малышев [и др.]; под ред. С.В. Малышева. - Минск: УП Камет, 2006. - 27 с.
3. Molecular analysis of local potato cultivars from Tenerife Island using microsatellite markers / L. Barandalla [et al.] // Euphytica. - 2006. -Vol. 152. - P. 283-291.
Microsatellite variation in potato landraces from the island of La Palma / R.J.I. De Galarreta [et al.] // Spanish J. Agricultural Research. - 2007. -V. 5. - P. 186-192.
4. Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato / M. Ghislain [et al.] // Theor.
Appl. Genet. - 2004. - Vol. 108. - P. 881-890.
5. Raker, C.M. Chilean tetraploid cultivated potato, Solanum tuberosum, is distinct from the Andean populations: microsatellite data /
C.M. Raker, D M. Spooner // Crop Sci. - 2002. -Vol. 42. - P. 1451-1458.
6. Reid, A. A rapid simple sequence repeat (SSR)-based identification method for potato cultivars / A. Reid, M. Kerr // Plant Genetic Resources. - 2007. - Vol. 5. - P. 7-13.
7. Isolation, characterization and mapping of simple sequence repeat loci in potato /
D. Milbourne [et al.] // Mol. Gen. Genet. -1998. - Vol. - 259. - P. 233-245.
8. Potato cultivar identification using simple sequence repeats markers (SSR) / M. Moisan-Thiery [et al.] // Potato Research. - 2005. -Vol. - 48. - P. 191-200.
9. Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato / D. Milbourne [et al.] // Mol. Breeding. -1997. - Vol. 3. - P. 127-136.
Дата поступления статьи 14 декабря 2011 г.
