CC BY
51
УДК 579.873.21:579.253.2
В.В. Синьков, О.Б. Огарков, С.Н. Жданова, С.Л. Антипина, Е.Д. Савилов
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА -336Д^ ГЕНА DC-SIGN ^209) В АУТОПСИЙНОМ МАТЕРИАЛЕ
НИИ Эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск) Иркутский областной противотуберкулезный диспансер (Иркутск)
Исследованы образцы аутопсийного материала умерших от туберкулеза людей, 89 человек — 19женщин и 70 мужчин, из которых 40 человек находились на терминальных стадиях ВИЧ-инфекции. Для. каждого образца исследовался полиморфизм. ДНК возбудителя, туберкулеза методом. MIRU-VNTR (локусы 2, 4, 10, 16, 24, 26, 27, 29, 31, 39, 40) и полиморфизм ДНК человека в локусе —336 A\G гена DC-SIGN. Установлено преобладание —336G аллеля, гена DC-SIGNв группе инфицированных генотипом. «Пекин» и. —336A аллеля в группе пораженных остальными генотипами M. tuberculosis (x2 = 4,4, p = 0,04).
Ключевые слова: M. tuberculosis, MIRU-VNTR, DC-SIGN
THE ANALYSIS OF -336A/G DC-SIGN GENE POLYMORPHISM IN AUTOPSY MATERIAL
V.V. Sinkov, O.B. Ogarkov, S.N. Zhdanova, S.L. Antipina, E.D. Savilov
Institute of Epidemiology and Microbiology SB RAMS, Irkutsk Irkutsk Regional TB Dispensary, Irkutsk
The autopsy specimens were studied, from 89 patients (19 females, 70 males) died, from pulmonary tuberculosis, among which 40 were in the terminal stage of HIV-infection. All specimens were studied, by MIRU-VNTR genotyping based, on 11-loci set (2, 4, 10, 16, 24, 26, 27, 29, 31, 39 and 40 loci). All specimens were genotyped by TaqMan -336A/G DC-SIGN genotyping assays. The significant difference was observed in frequency of -336G allele among TB patients infected. Beijing genotype and —336A allele among patients infected. non-Beijing genotype (x2 = 4.4, p = 0.04).
Key words: M. tuberculosis, MIRU-VNTR, DC-SIGN
ВВЕДЕНИЕ
Туберкулез — это инфекционное и социально-зависимое заболевание. На сегодняшний день он остается одной из наиболее актуальных проблем практического здравоохранения. В первую очередь это связано с тем, что с конца прошлого века эпидемиологическая обстановка по туберкулезу во всем мире вновь стала стремительно ухудшаться. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) за 2009 г. в мире зарегистрировано 9,4 млн. новых случаев заболевания [14]. В Российской Федерации, начиная с 1990 г., отмечается рост всех основных эпидемиологических показателей по туберкулезу [1]. По данным ВОЗ в 2009 г. заболеваемость туберкулезом среди взрослого населения в Российской Федерации составила 132 на 100 тыс. населения и, учитывая неблагополучную экономическую нестабильность в стране, прогнозируется ее дальнейший рост [1].
Особое место в глобальной пандемии туберкулеза занимает группа штаммов, именуемых «Пекин» (Beijing) [3]. На сегодняшний день, он является самым успешным эпидемическим штаммом M. tuberculosis в мире [6]. Генотип «Пекин» существенно отличается от других вариантов M. tuberculosis рядом выраженных «патогенных» свойств. В первую очередь это способность к диссе-минации и генерализации туберкулезного процесса [7] с достоверно более частым возникновением внелегочных форм туберкулеза [12].
Российская Федерация и страны бывшего СССР являются вторым после Китая, Японии и Кореи крупным регионом распространения генотипа «Пекин» в мире с массовой долей около 50 % из общего числа определяемых генотипов [2, 9].
Важную роль в инициации иммунного ответа в организме человека играют дендритные клетки (ДК), специализирующиеся на захвате и представлении антигенов T-клеткам [5]. Захватив антиген, они мигрируют к ближайшему лимфатическому узлу и, в процессе миграции, подвергаются специфическому процессу — «созреванию». «Созревание» сопровождается экспрессией большого числа рецепторов — кластеров дифференциации (англ. CD-Cluster of Differentiation) [5]. Наиболее важным рецептором захвата M. tuberculosis дендритными клетками является лектиновый рецептор DC-SIGN (англ. Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin), известный еще как CD209 [11]. На молекулярном уровне, рецептор DC-SIGN «распознает» представителей рода Mycobacterium по специфическим молекулам маннозилированного липоарабиноманана (manLAM) [8].
В предыдущей нашей работе было выявлено увеличение частоты встречаемости аллеля —336G гена DC-SIGN у мужчин инфицированных генотипом «Пекин» [4]. Цель данной работы заключалась в изучении данного феномена у людей, умерших от туберкулезной инфекции.
Таблица 1
Структуры и концентрации использованных праймеров и зондов
Название Структура Конц. в мкМ
DCSIGN -336 For 5'-ACT GTG TTA CAC CCC CTC CAC TAG-3' 0,3
DCSIGN -336 Rev 5'-AGG AAA GCC AGG AGG TCA CA-3' 0,3
DCSIGN -336 Probe G 5'- R6G-CTGC(C-LNA)(C-LNA)(A-LNA)CCCTTGC -BHQ1- 3' 0,1
DCSIGN -336 Probe A 5'- FAM-CTGC(C-LNA)(T-LNA)(A-LNA)CCCTTGC-BHQ1- 3' 0,1
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение ДНК микобактерий и MIRU-VNTR типирование проводили, как описано ранее [2]. Принадлежность исследованных MIRU-VNTR паттернов к известным семействам туберкулезных штаммов определяли по предложенным алгоритмам с использованием пакета прикладных программ MIRU-VNTRplus [13].
Полиморфизм гена CD209 (DC-SIGN) в позиции —336A/G (rs4804803) определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и LNA-зондов разработанных и синтезированных НПФ «Синтол» (Россия) на амплификаторе Rotor-Gene6000 (QIAGEN, США). Структуры праймеров и зондов приведены в табл. 1.
ПЦР проводили в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1х ПЦР буфер (Интерлабсер-вис); 3 мМ MgSO4 (Интерлабсервис); Смесь олигонуклеотидов и зондов (Синтол) в эквимолярных концентрациях (см. табл. 1); 4NTP (Интерлабсер-вис) в конечной концентрации 200 мкМ каждого нуклеотида; Модифицированная TaqF полимераза (Интерлабсервис) по 1 ед. на реакцию; ДНК образец в концентрации около 50 нг на реакцию. ПЦР инициировали 15-минутным прогревом реакционной смеси при 95 °С (для активации TaqF полимеразы) с последующей амплификацией в течение 45 циклов, состоящей из этапов: плавление при 95° — 30 сек.; отжиг при 56 — 67° (в зависимости от расчетной температуры каждого набора) — 30 сек.; элонгация при 72° — 20 сек.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ R [10]. Частоты аллелей и генотипов, соответствие распределения частот генотипов равновесию Хар-
ди — Вайнберга определяли в модуле «genetics» пакета R. Значения х2 были рассчитаны с учетом поправки Йетса, т.к. число степеней свободы не превышало 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Были исследованы образцы аутопсийного материала умерших от туберкулеза людей (89 человек) — 19 женщин и 70 мужчин, из которых 40 человек находились на терминальных стадиях ВИЧ-инфекции. Распределение частот аллелей гена DC-SIGN соответствовало равновесию Харди — Вайнберга. В табл. 2 приведены абсолютные и относительные частоты генотипов и аллелей
— 336A/G полиморфизма промотора гена DC-SIGN.
Предварительный анализ —336A/G полиморфизма не выявил каких либо значимых различий между ВИЧ-позитивными и ВИЧ-негативными. В дальнейшем сравнение проводилось не зависимо от ВИЧ-статуса образцов. Сравнение группы 1 (инфицированных генотипом «Пекин») и группы 2 (другие генотипы) обнаружило тенденцию к увеличению —336G аллеля в первой группе не достигшую уровня достоверных различий (х2 = 3,41, p = 0,07) в данной выборке. Тем не менее, было установлено, что частота генотипа
— 336А/А во второй группе достоверно выше, по сравнению с первой группой (х2 = 4,4, p = 0,04). Так же значимые различия распределения частот аллелей —336A/G были выявлены среди мужчин: снижение —336G аллеля в группе 1 и увеличение частоты —336A в группе 2 (х2 = 4,6, p = 0,03). Очевидно, что основной вклад в достоверность полученных результатов внесла именно когорта больных мужского пола.
Таблица 2
-336A/G полиморфизм промотора гена DC-SIGN
Группа A-аллель G-аллель AA AG GG
Пораженные генотипом «Пекин» 87 (0,72) 33 (0,28) 30 (0,50) 27 (0,45) 3 (0,05)
мужчины 67 (0,71) 27 (0,29) 21 (0,45) 25 (0,53) 1 (0,02)
женщины 20 (0,77) 6 (0,23) 9 (0,69) 2 (0,15) 2 (0,15)
Пораженные другими генотипами 50 (0,86) 8 (0,14) 22 (0,76) 6 (0,21) 1 (0,03)
мужчины 41 (0,89) 5 (0,11) 18 (0,78) 5 (0,22) 0
женщины 9 (0,75) 3 (0,25) 4 (0,67) 1 (0,17) 1 (0,17)
ВЫВОДЫ
Выявлена ассоциация между генотипом «Пекин» M. tuberculosis и —336G аллелем гена DC-SIGN человека. Наблюдается достоверное увеличение частоты —336G аллеля у лиц мужского пола умерших на фоне туберкулеза вызванного генотипом «Пекин». В то же время, ранее была обнаружена обратная закономерность — уменьшение вероятности обнаружения сочетания генотипа «Пекин» M. tuberculosis и аллеля —336G среди больных легочным туберкулезом (мужчины) [4]. Данный феномен можно объяснить тем, что в популяции людей, носители —336G аллеля имеют преимущество в защите от развития туберкулеза, вызванного генотипом «Пекин». С другой стороны, —336G аллель ухудшает течение заболевания и достоверно чаще встречается в образцах тканей умерших от туберкулеза людей инфицированных генотипом «Пекин».
В заключение хотелось бы отметить, что изучение сложных взаимодействий популяции M. tuberculosis и популяции людей на молекулярногенетическом уровне находятся в сфере интересов не только генетиков и молекулярных биологов, но могут быть применены в анализе глобальных эпидемических процессов.
ЛИТЕРАТУРА
1. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2009 году. Государственный доклад. — M.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - С. 456.
2. Огарков О.Б., Медведева Т.В., Zozio T. Молекулярное типирование штаммов микобактерий туберкулеза в Иркутской области (Восточная Сибирь) в 2000-2005 гг. // Молекулярная медицина. - 2007. - Т. 2. - С. 33-38.
3. Савилов Е.Д., Синьков В.В., Огарков О.Б. Пекинский генотип M. tuberculosis // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2010. - № 4. -
С. 50-53.
4. Синьков В.В. и др. Полиморфизм генов DC-SIGN -336A/G, MCP1 -2518A/G и INFY +874A/T
Сведения об авторах
у больных легочным туберкулезом в Иркутской области // Сиб. мед. журн. - 2009. - Т. 7. - С. 30-33.
5. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity // Nature. - 1998. -Vol. 392, N 6673. - P. 245-252.
6. Filliol I. et al. Snapshot of moving and expanding clones of Mycobacterium tuberculosis and their global distribution assessed by spoligotyping in an international study // J. Clin. Microbiol. - 2003. -Vol. 41. - P. 1963-1970.
7. Lopez B. et al. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 133. -P. 30-37.
8. Maeda N. et al. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan // J. Biol. Chem. - 2003. -Vol. 278. - P. 5513-5516.
9. Mokrousov I. et al. Penitentiary population of Mycobacterium tuberculosis in Kyrgyzstan: exceptionally high prevalence of the Beijing genotype and its Russia-specific subtype // Infect. Genet. Evol. - 2009. - Vol. 9. - P. 1400-1405.
10. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. - Vienna, Austria, 2011.
11. Tailleux L. et al. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells // J. Exp. Med. - 2003. - Vol. 197. -P. 121-127.
12. Thwaites G. et al. Relationship between Mycobacterium tuberculosis genotype and the clinical phenotype of pulmonary and meningeal tuberculosis // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 13631368.
13. Weniger T. et al. MIRU-VNTRplus: a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria // Nucleic Acids Research. - 2010. - Vol. 38. - P. W326-331.
14. WHO Tuberculosis Factsheet (2010/2011 TUBERCULOSIS GLOBAL FACTS). 2010.
Синьков Вячеслав Владимирович - аспирант Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: (3952) 33-34-25; e-mail: vsinkov@gmail.com)
Огарков Олег Борисович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторным отделением ГУЗ «Иркутский областной противотуберкулезный диспансер» (664047, г Иркутск, ул. Терешковой, 59; тел. (3952) 38-72-61; e-mail: obogarkov@ yandex.ru)
Жданова Светлана Николаевна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: (3952) 33-34-25; e-mail: svetnii@mail.ru) Антипина Светлана Львовна - старший преподаватель кафедры патологии Иркутского государственного медицинского университета (моб. тел.: 89501442494; e-mail: antipina-sl@yandex.ru)
Савилов Евгений Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией эпидемиологии антропонозных инфекций Институт эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел. (3952) 33-34-23; e-mail: savilov47@gmail.com)
